9.高效液相色谱分析
无机及分析化学第9章-高效液相色谱法
二、方法原理
5.亲和色谱法 主要利用生物大分子与固定相之间的特异亲和力 进行选择性分离及纯化的方法。
原理：于载体表面先键合具有一般反应性能的环氧或联氨（称 为间隔臂），然后再连接上配基。当含有复杂混合试样的流动 相流经这种经固定化的配基时，其中具有亲和力特性的生物大 分子与配基相互作用而被保留，无此作用的则被淋洗出；随后 ，改变流动相pH或组成，再将被保留的大分子组分以纯品的形 式洗脱出来。
1.高压输液系统 一般由贮液器、脱气装置、高压输液泵、过 滤器、压力脉动阻尼器以及梯度洗脱装置等组成，其中高压输 液泵是核心部件。
（1）贮液器 用来贮存流动相，其材料对流动相是化学惰性的 。常用的材料为玻璃、不锈钢或表面涂聚四氟乙烯的不锈钢等
（2）过滤和脱气装置 流动相在使用前应根据其性质选用不 同材料的滤膜过滤，一般选用市售的0.45 m的水性和油性滤 膜进行过滤 。样品溶液一般用市售的0.45 m针形滤器过滤。 另外，在流动相入口、泵前、泵和色谱柱间都配置有各种各样 的滤柱和滤板。
一、分离类型的选择 色谱分离类型的选择原则列于图9－3中。
图9－3 PHLC分离类型的选择参考表
二、固定相和流动相的选择
（一）固定相
高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为 刚性固体和硬胶两大类。固定相按孔隙深度可分为表 面多孔型和全多孔型固定相。
1. 表面多孔型固定相 它的基体是实心玻璃球，在玻璃 球外面覆盖一层多孔活性材料，如硅胶、氧化硅、离 子交换剂、分子筛、聚酰胺等。
例1 有机氯农药的测定，采用液－固色谱法。
色谱条件：50cm×2.5mm（内径）色谱柱；
三、HPLC法应用实例
流动相：正己烷； 固定相：薄壳硅胶 CorasilⅡ37~50μ m）；
高效液相色谱分析
数 据 处 理
检 测 器
色 谱 柱
高效液相色谱仪一般可分为5个主要部分： 高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、 计算机控制及数据处理系统。此外还配有辅助装 置：如梯度洗脱，也叫梯度淋洗，自动进样及数 据处理等。其工作过程如下：首先高压泵将贮液 器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从 控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流 经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱 进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪 将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色 谱图。
纯 水 制 备 仪
超 纯 水 制 备 仪
乙腈 这是反相高效液相色谱常用的溶剂，实验室常用的 只能满足紫外检测器的需要。这样的试剂很难符合荧光 和电化学检测器的要求。 甲醇 反相高效液相色谱常用的溶剂之一，其杂质主要是 水。市面上能够买到紫外光谱纯的商品，但它的主要问 题也是有些特性满足不了荧光和电化学检测分析。 氯代烃类溶剂 在正相高效液相色谱中常用的二氯甲烷等 氯代烃类溶剂中，添加稳定剂甲醇或乙醇。乙醇能够提 高流动相的极性，缩短正相高效液相色谱分析中各组分 的保留时间。各批次之间浓度的变化也许会影响重复性。 国内市场上可能不容易买到不含稳定剂的氯代烃类溶剂， 但是可以用氧化铝柱吸附的办法或者用水萃取脱掉。不 含稳定剂的氯代烃类溶剂可以缓慢的分解，特别是与其 他溶剂共存时。分解的盐酸会腐蚀不锈钢部件，损害色 谱柱。以戊烯为稳定剂的氯代烃类溶剂可避免上述产生 的问题。
由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流动相 阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输液系统。 它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高压输 液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成，其中高压输液泵是 核心部件。对于一个好的高压输液泵应符合密封性好，输出 流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速更换溶剂及耐 腐蚀等要求。常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。恒流 泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱柱 引起阻力变化无关；恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其 流量则随色谱系统阻力而变化，故保留时间的重现性差，它 们各有优缺点。目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流泵又称 机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，应用最多的 是机械往复泵。
高效液相色谱习题及参考答案
高效液相色谱习题及参考答案一、单项选择题1. 在液相色谱法中，按分离原理分类，液固色谱法属于（）。
A、分配色谱法B、排阻色谱法C、离子交换色谱法D、吸附色谱法2. 在高效液相色谱流程中，试样混合物在（）中被分离。
A、检测器B、记录器C、色谱柱D、进样器3. 液相色谱流动相过滤必须使用何种粒径的过滤膜？A、0.5μmB、0.45mC、0.6μmD、0.55μm4. 在液相色谱中，为了改变色谱柱的选择性，可以进行如下哪些操作？A、改变流动相的种类或柱子B、改变固定相的种类或柱长C、改变固定相的种类和流动相的种类D、改变填料的粒度和柱长5. 一般评价烷基键合相色谱柱时所用的流动相为（）A、甲醇/水（83/17）B、甲醇/水（57/43）C、正庚烷/异丙醇（93/7）D、乙腈/水（1.5/98.5）6. 下列用于高效液相色谱的检测器，（）检测器不能使用梯度洗脱。
A、紫外检测器B、荧光检测器C、蒸发光散射检测器D、示差折光检测器7. 在高效液相色谱中，色谱柱的长度一般在（）范围内。
A 、10～30cmB、20～50mC 、1～2mD、2～5m8. 在液相色谱中, 某组分的保留值大小实际反映了哪些部分的分子间作用力（）A、组分与流动相B、组分与固定相C、组分与流动相和固定相D、组分与组分9. 在液相色谱中，为了改变柱子的选择性，可以进行（）的操作A、改变柱长B、改变填料粒度C、改变流动相或固定相种类D、改变流动相的流速10. 液相色谱中通用型检测器是（）A、紫外吸收检测器B、示差折光检测器C、热导池检测器D、氢焰检测器11. 在环保分析中，常常要监测水中多环芳烃，如用高效液相色谱分析，应选用下述哪种检波器A、荧光检测器B、示差折光检测器C、电导检测器D、紫外吸收检测器12. 在液相色谱法中，提高柱效最有效的途径是（）A、提高柱温B、降低板高C、降低流动相流速D、减小填料粒度13. 在液相色谱中，不会显著影响分离效果的是（）A、改变固定相种类B、改变流动相流速C、改变流动相配比D、改变流动相种类14. 不是高液相色谱仪中的检测器是（）A、紫外吸收检测器B、红外检测器C、差示折光检测D、电导检测器15. 高效液相色谱仪与气相色谱仪比较增加了（）A、恒温箱B、进样装置C、程序升温D、梯度淋洗装置16. 在高效液相色谱仪中保证流动相以稳定的速度流过色谱柱的部件是（）A、贮液器B、输液泵C、检测器D、温控装置17. 高效液相色谱、原子吸收分析用标准溶液的配制一般使用（）水A．国标规定的一级、二级去离子水B．国标规定的三级水C．不含有机物的蒸馏水D．无铅(无重金属)水18. 高效液相色谱仪与普通紫外－可见分光光度计完全不同的部件是（）A、流通池B、光源C、分光系统D、检测系统19. 下列哪种是高效液相色谱仪的通用检测器A、紫外检测器B、荧光检测器C、安培检测器D、蒸发光散射检测器20. 高效液相色谱仪中高压输液系统不包括A、贮液器B、高压输液泵C、过滤器D、梯度洗脱装置E、进样器二、判断题：1. 液相色谱分析时，增大流动相流速有利于提高柱效能。
食品仪器分析-高效液相色谱参考答案
高效液相色谱习题一、填空题1.高效液相色谱分析是将流动相用高压泵输送，使压力高达 5 MPa以上，并采用新型的化学键合固定相，是分离效率很高的液相色谱法。
2.高效液相色谱法的特点是分离性能高、分析速度快、检测器灵敏度高、应用范围广。
3.高效液相色谱法和气相色谱法的共同之处是分离功能、分析功能、在线分析。
4.高效液相色谱分析根据分离机理不同可分为四种类型，即液固色谱、液液色谱、键合相色谱、凝胶色谱。
5.高效液相色谱中的液一液分配色谱采用的新型固定相叫化学键合相，它是利用化学方法将固定液官能团键合在载体表面上的。
6.通常把固定相极性大于流动相极性的一类色谱称为正相色谱。
反之称为反相色谱。
7.高效液相色谱仪通常由储液器、输液泵、梯度淋洗器、进样器、色谱柱、检测器、色谱工作站七部分组成。
8.高效液相色谱仪中使用最广泛的检测器为紫外检测器，另外还有折光检测器、荧光检测器等等。
9.高效液相色谱主要用于分析沸点高的、分子量大的、受热易分解的以及具有生理活性物质的分析。
二、判断题√、√、⨯、⨯、√、√、⨯、√、⨯、√、⨯、√、√、⨯、√、⨯、⨯、√、⨯、√、√、⨯、⨯、⨯、⨯、⨯、⨯、⨯、√、⨯1．液一液色谱流动相与被分离物质相互作用，流动相极性的微小变化，都会使组分的保留值出现较大的改变。
（√）2．利用离子交换剂作固定相的色谱法称为离子交换色谱法。
（√）3．紫外吸收检测器是离子交换色谱法通用型检测器。
（×）4．检测器性能好坏将对组分分离产生直接影响。
（×）5．高效液相色谱适用于大分子，热不稳定及生物试样的分析。
（√）6．高效液相色谱中通常采用调节分离温度和流动相流速来改善分离效果。
（×）7．键合固定相具有机械性能稳定，可使用小粒度固定相和高柱压来实现快速分离。
（√）8．在液相色谱中为避免固定相的流失，流动相与固定相的极性差别越大越好。
（×）9．正相分配色谱的流动相极性大于固定相极性。
高效液相色谱谱图分析
高效液相色谱图分析要参考多方面因素;现在以液相色谱反相谱图C18,VWD检测器进行分析;
1,出峰越靠前,说明物质极性越大,同时说明结构中含杂原子,极性键,比如羧基,氨基,等;
2,峰响应值越高,说明有机物中共轭越多,有时物质已经带了颜色,进入可见区;
3,峰型不好时,多是含双多基团,尤其是氨基酸类;
4,根据PH调整看峰型,能基本判断PKA,有利于判断物质结构;
5,多种条件分离都很困难时,并且峰型相似,一般多是两种或多种异构;
6,通过出峰顺序可判断物质处理如重结晶所使用溶剂;
7,波长与响应值对应,来判断可能结构;相当于四大谱之一的紫外。
高效液相色谱分析法概述
高效液相色谱分析技术及其新的发展与应用余建军(陕西科技大学生命科学与工程学院，西安710021)1 高效液相色谱法概述高效液相色谱法（high performanc，liquid chromatography，HPLC）是在经典液相色谱法基础上发展起来的一种新型分离、分析技术。
经典液相色谱法由于使用粗颗粒的固定相，填充不均匀，依靠重力使流动相流动，因此分析速度慢，分离效率低。
新型高效的固定相、高压输液泵、梯度洗脱技术以及各种高灵敏度的检测器相继发明，高效液相色谱法迅速发展起来[1]。
高效液相色谱法与经典液相色谱法比较，具有下列主要特点：（1）高效由于使用了细颗粒、高效率的固定相和均匀填充技术，高效液相色谱法分离效率极高，柱效一般可达每米104理论塔板。
近几年来出现的微型填充柱（内径lmm）和毛细管液相色谱柱（内径0.05umm），理论塔板数超过每米105，能实现高效的分离。
（2）高速由于使用高压泵输送流动相，采用梯度洗脱装置，用检测器在柱后直接检测洗脱组分等，HPLC完成一次分离分析一般只需几分钟到几十分钟，比经典液相色谱快得多。
（3）高灵敏度紫外、荧光、电化学、质谱等高灵敏度检测器的使用，使HPLC 的最小检测量可达10-9～10-11g（4）高度自动化计算机的应用，使HPLC 不仅能自动处理数据、绘图和打印分析结果，而且还可以自动控制色谱条件，使色谱系统自始至终都在最佳状态下工作，成为全自动化的仪器。
（5）应用范围广（与气相色谱法相比）HPLC 可用于高沸点、相对分子质量大、热稳定性差的有机化合物及各种离子的分离分析。
如氨基酸、蛋白质、生物碱、核酸、甾体、维生素、抗生素等。
（6）流动相可选择范围广它可用多种溶剂作流动相，通过改变流动相组成来改善分离效果，因此对于性质和结构类似的物质分离的可能性比气相色谱法更大。
（7）馏分容易收集更有利于制备2 色谱法分类高效液相色谱法按固定相不同可分为液-液色谱法和液-固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液-液色谱）和吸附色谱法（液-固色谱）等[2]。
高效液相色谱分析
高效液相色谱分析一、选择题1.液相色谱适宜的分析对象是( )。
A 低沸点小分子有机化合物B 高沸点大分子有机化合物C 所有有机化合物D 所有化合物2.在液相色谱中,梯度洗脱适用于分离( )。
A 异构体B 沸点相近,官能团相同的化合物C 沸点相差大的试样D 极性变化范围宽的试样3吸附作用在下面哪种色谱方法中起主要作用( )。
A 液一液色谱法B 液一固色谱法C 键合相色谱法D 离子交换法4.在液相色谱中,提高色谱柱柱效的最有效途径是( )。
A 减小填料粒度B 适当升高柱温C 降低流动相的流速D 增大流动相的流速5.液相色谱中通用型检测器是( )。
A 紫外吸收检测器B 示差折光检测器C 热导池检测器D 荧光检测器6.高压、高效、高速是现代液相色谱的特点,采用高压主要是由于( )。
A 可加快流速,缩短分析时间B 高压可使分离效率显著提高C 采用了细粒度固定相所致D 采用了填充毛细管柱7.在液相色谱中,下列检测器可在获得色谱流出曲线的基础上,同时获得被分离组分的三维彩色图形的是( )。
A 光电二极管阵列检测器B 示差折光检测器C 荧光检测器D 电化学检测器8.液相色谱中不影响色谱峰扩展的因素是( )。
A 涡流扩散项B 分子扩散项C 传质扩散项D 柱压效应9.在液相色谱中,常用作固定相又可用作键合相基体的物质是( )。
A 分子筛B 硅胶C 氧化铝D 活性炭11.在液相色谱中,固体吸附剂适用于分离( )。
A 异构体B 沸点相近,官能团相同的颗粒C 沸点相差大的试样D 极性变换范围12水在下述色谱中,洗脱能力最弱(作为底剂)的是( )。
A 正相色谱法B 反相色谱法C 吸附色谱法D 空间排斥色谱法13.在下列方法中,组分的纵向扩散可忽略不计的是( )。
A 毛细管气相色谱法B 高效液相色谱法C 气相色谱法D 超临界色谱法14. 下列用于高效液相色谱的检测器,()检测器不能使用梯度洗脱。
A、紫外检测器B、荧光检测器C、蒸发光散射检测器D、示差折光检测器15. 高效液相色谱仪与气相色谱仪比较增加了()A、恒温箱B、进样装置C、程序升温D、梯度淋洗装置二、填空题1.高效液相色谱中的技术类似于气相色谱中的程序升温,不过前者连续改变的是流动相的,而不是温度。
高效液相色谱法分析原始记录
高效液相色谱法分析原始记录维生素K1是一种重要的脂溶性维生素，对于血液凝固和骨骼健康起着关键作用。
因此，对维生素K1的分析具有重要的意义。
在HPLC中，分析维生素K1的常用方法是利用其在特定条件下的保留时间。
首先，我们需要准备实验所需的试剂和设备。
试剂包括甲醇、乙腈、蒸馏水和维生素K1标准品。
设备包括HPLC系统和色谱柱等。
接下来，我们可以开始进行实验。
实验步骤如下：步骤一：准备工作1.准备HPLC系统，开机预热至适当的温度。
2.准备色谱柱，根据柱的要求选择合适的流动相。
步骤二：样品制备1.取适量的维生素K1标准品，用甲醇溶解。
浓度可以根据需求进行选择。
2.通过滤膜过滤溶液，以去除不溶性颗粒。
步骤三：色谱条件设置1.设置流动相的比例，常用的流动相为甲醇和乙腈的混合物，可以根据实际情况调整比例。
2. 设置流速和温度，常用的流速为1-2 mL/min，温度可以根据柱的要求进行设置。
3. 设置检测器的波长，维生素K1在254 nm处有最大吸收峰。
步骤四：进样和分析1.使用注射器将准备好的维生素K1样品注入色谱柱。
2.记录维生素K1的保留时间和吸收峰的面积。
步骤五：数据处理1.根据维生素K1标准曲线，计算样品中维生素K1的浓度。
2.分析不同样品中维生素K1的含量差异。
以上就是通过使用HPLC分析维生素K1时的一般操作步骤和记录内容。
根据实际情况，具体的实验步骤和数据记录可能会有所不同。
然而，通过正确设置色谱条件和准确操作实验,可以得到可信度高的分析结果，从而对维生素K1的含量进行可靠的定量分析。
液相色谱法题库及答案
液相色谱法(一)基础知识分类号：G5-0试题同“上册第一章第十三节W13-0”。
(二)苯酚类化合物分类号：G5-1主要内容苯酚类化合物的测定氢氧化钠溶液吸收-高效液相色谱法《空气和废气监测分析方法》(第四版)一、填空题1．环境空气中的苯酚类化合物主要来源于行业及各种燃烧，大多数化合物具有性，对人体具有危害性。
答案：化工毒2．高效液相色谱法分析环境空气中苯酚类化合物时，一般情况下，对于相对干净的样品应采用检测器，检测波长为 nm。
答案：紫外 2743．高效液相色谱法分析环境空气中苯酚类化合物时，分析色谱柱为，流动相为。
答案：Zorbox ODS或C18反相柱 30％乙腈溶液(内含醋酸盐缓冲溶液)二、判断题1．高效液相色谱法分析环境空气中苯酚类化合物时，测定结果是每个化合物的含量值。
( )答案：正确2．高效液相色谱法分析环境空气中苯酚类化合物时，含苯酚类化合物的吸收液应保存在具有Teflon螺盖的瓶子中。
( )答案：正确3．高效液相色谱法分析环境空气中苯酚类化合物时，实验中所用的试剂事先必须进行检测，以确定是否被污染。
( )答案：正确4．高效液相色谱法分析环境空气中的苯酚类化合物时，实验中所用的试剂水必须是去离子水。
( )答案：错误正确答案为：也可以是蒸馏水。
5．高效液相色谱法分析环境空气中苯酚类化合物中，在采集样品时，需记录点位、日期、气温、气压、相对湿度和流速等采样时相应的参数。
( )答案：正确6．高效液相色谱法分析环境空气中苯酚类化合物中；采集样品时，采样流速大于1000ml／min，吸附效率就会提高。
( )答案：错误正确答案为：若采样流速大于1000ml／min，吸附效率会降低。
7．高效液相色谱法分析环境空气中苯酚类化合物时，采集样品所使用的玻璃器皿，使用之前必须用蒸馏水充分清洗并烘干。
( )答案：错误正确答案为：使用之前必须用甲醇充分清洗并烘干。
8．高效液相色谱法分析环境空气中苯酚类化合物时，产生与所测定化合物相同保留时间的干扰峰，可通过改变色谱分离条件而消除。
仪器分析高效液相色谱法
仪器分析高效液相色谱法高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC）是目前广泛应用于仪器分析领域的一种重要分析方法。
它通过利用柱子中流动的流动相和样品的物理化学性质的相互作用，使样品组分在柱子中发生分离，再通过检测器对各组分进行定量或定性分析。
仪器分析高效液相色谱法主要由流动相供给系统、进样器、柱子、检测器和数据处理系统等组成。
流动相供给系统通过恒压或恒流的方式将流动相送入进样器中，进样器将样品注入柱子中，柱子根据物理化学性质的差异，使不同组分发生分离，之后检测器检测进入检测器的各组分的浓度，并通过数据处理系统对数据进行分析和整理。
高效液相色谱法具有分离效率高、分离时间短、适用范围广等特点。
与传统的液相色谱法相比，高效液相色谱法的流动相的流速更高，柱子填充物颗粒更小，从而大大提高了分离效率。
同时，高效液相色谱法对样品的需求量较小，具有较好的分析灵敏度。
因此，高效液相色谱法被广泛应用于生物、环境、食品、药物、化工等领域的组分分析和质量控制。
在生物领域中，高效液相色谱法常用于生物样品中代谢产物和药物的分析。
通过绑定柱子、手性柱子以及使用不同的检测器，可以对复杂的生物样品中的不同组分进行准确的分析和定量测试。
例如，对尿液中的代谢产物进行分析可以帮助人们了解人体健康状态，对药物的残留物进行分析可以保证食品和水的安全等。
在环境领域中，高效液相色谱法常用于水质、大气和土壤等环境样品中有机污染物的分析。
通过连接各种不同相的柱子，可以对复杂的环境样品中的有机污染物进行有效的分离，使用紫外-可见光检测器或质谱检测器可以对分离后的各组分进行检测和定量。
在食品领域中，高效液相色谱法常用于食品中添加剂、农药残留物和食品中的有害物质的分析。
通过选择合适的柱子和检测器，可以对复杂的食品样品进行分离和检测，以保证食品的安全性和质量。
在药物领域中，高效液相色谱法常用于药品中活性成分和杂质的分析。
高效液相色谱分析法
现代食品检测技术第一部分——色谱分析——高效液相色谱第七章高效液相色谱分析法High performance liquid chromatograph 第一节高效液相色谱的特点与仪器第二节主要分离类型与原理第三节液相色谱的固定相与流动相第四节影响分离的因素与操作条件的选择第五节新型液相色谱简介2010-1-25第一节高效液相色谱的特点与仪器2010-1-25一、高效液相色谱法的特点在经典的液体柱色谱法基础上，引入了气相色谱法的理论。
在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，实现了分析速度快、分离效率高和操作自动化。
高效液相色谱法的突出特点：1）高效（柱效约为30000n /米）2）高速（较经典色谱法））3）高压（150 -350*105Pa4）高灵敏度（高灵敏度的检测器：紫外10-9g，荧光：10-11g ）2010-1-251. HPLC与经典LC区别主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段1）经典LC：仅做为一种分离手段柱内径1～3cm，固定相粒径>100μm 且不均匀；常压输送流动相，柱效低（H↑，n↓）；分析周期长、无法在线检测。
2）HPLC：分离和分析柱内径2～6mm，固定相粒径<10μm（球形，匀浆装柱）；高压泵输送流动相，柱效高（H↓，n↑）；分析时间大大缩短、可以在线检测。
2010-1-252. HPLC与GC差别9相同：兼有分离和分析功能，均可以在线检测9主要差别：分析对象、流动相及操作条件的差别1）分析对象GC：能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品不可检测，仅能分析有机物的20％。
HPLC：溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和热稳定性的限制；分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测，用途广泛，占有机物的80％。
2010-1-252）流动相差别GC：流动相为惰性气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相作用HPLC：流动相为液体流动相与组分间有亲合作用力，为提高柱的选择性、改善分离度增加了因素，对分离起很大作用流动相种类较多，选择余地广流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相可以增大分离选择性3）操作条件差别GC：加温操作HPLC：室温；高压（液体粘度大）2010-1-25二、液相色谱仪器2010-1-25三、流程及主要部件Process and main assembly of HPLC 1.流程2010-1-252.主要部件(1) 高压输液泵♥主要部件之一，压力：150～350×105Pa。
仪器分析笔记 《高效液相色谱分析》
第二章高效液相色谱分析§2.1 高效液相色谱法概述（掌握）2.1.1 高效液相色谱法的特点1、与经典液相色谱法比较2、与气相色谱法比较3、高效液相色谱法的发展A、固定相的变化填料粒度减小，粒型规整；键合型固定相；整体结构固定相；亲和固定相。
目前，出现使用1.0µm填料的超高压液相色谱。
B 、流动相变化目前，出现120～220℃超热水为流动相、FID 和FPD 检测器的HPLC 。
C 、全新方法剪切流路液相色谱；不同分离机制组合的多维液相色谱以及HPLC 与MS 、NMR 、IR 联用的多维液相色谱法。
4、高效液相色谱法的特点①高压 ：采用高压输液设备，（150~350）× 105 Pa ②高速：分析速度快； ③高效：柱效很高。
（n>30000），可以在数分钟内完成数百种物质的分离；④高灵敏度：10—9g （UV ）；10—11g （荧光检测）。
5、高效液相色谱法的局限①溶剂用量太大；②缺乏诸如气相色谱使用的TCD 、FID 通用型检测器； ③不能替代气相色谱法，难分离化合物(柱效10万以上)，必须使用毛细管气相色谱法进行分离； ④不能替代中、低压柱色谱法，一些生物活性化合物不能承受200kPa ～1MPa 压力。
§2.2 影响色谱峰扩展及色谱分离的因素（了解）2.2.1 影响色谱峰的扩展的因素高效液相色谱法的基本概念及理论基础，与气相色谱法是基本一致的，其区别主要在于流动相的不同。
现根据速率理论及色谱峰扩展及色谱分离的影响讨论如下：高效液相色谱的范氏方程：2222m p sm p s fd m p mm s C d C d C d C D H d u u u D D D λ⎛⎫=++++ ⎪ ⎪⎝⎭ 若将上式简化，可写作：BH A Cu u=++这与气相色谱的速率方程形式是基本一致的，主要区别在于纵向扩散项可以忽略不计，影响柱效的主要因素是传质项。
高效液相色谱分析技术的使用注意事项
高效液相色谱分析技术的使用注意事项引言：高效液相色谱（High-performance liquid chromatography，简称HPLC）是一种广泛应用于药物分析、食品检测、环境监测等领域的分析技术。
作为一种高精密、高灵敏度的分析方法，HPLC在科研实验室和工业生产中得到了广泛的应用。
然而，正确使用HPLC技术需要注意一些关键的使用注意事项，以确保分析结果的准确性和可靠性。
一、样品制备在进行高效液相色谱分析之前，样品制备是必不可少的步骤。
优质的样品制备是保证分析结果准确性的前提。
正确的样品制备过程可以包括样品的预处理、提取、净化等步骤。
在样品制备过程中，务必遵循标准化的操作流程和使用适当的试剂和溶剂。
二、仪器设置正确设置HPLC仪器是保证高效液相色谱分析效果的关键。
在设置仪器的过程中，需要注意以下几个方面：1. 流动相：选择合适的流动相液体以及其比例是一项重要任务。
适当的流动相选择可以提高分析分离的效果和分辨率。
2. 柱温：保持柱温稳定是确保分析结果准确的重要因素。
高温容易导致柱效果变差，低温则可能导致柱内压力过高。
因此，需要根据分析物的性质选择适宜的柱温。
3. 检测器：要正确选择和设置检测器，以确保能够准确测量样品的峰面积、保证检测的灵敏度和可靠性。
4. 注射体积：确定合适的样品注射体积以及注入速度是确保高效液相色谱分析准确性的另一个关键因素。
三、质量控制为了确保分析结果的准确性和可靠性，在使用高效液相色谱分析技术时需要进行质量控制。
质量控制可以包括以下几个方面：1. 标准曲线：建立合适的标准曲线是定量分析的基础。
通过使用一系列浓度已知的标准溶液，构建样品分析物浓度与峰面积之间的线性关系，以便后续样品的定量分析。
2. 内标法：使用内标物进行定量分析可以提高结果的准确性。
内标物应该与目标分析物性质相似，但不会干扰样品中其他化合物的检测。
3. 干扰物的去除：在样品制备过程中，一些杂质和干扰物可能会影响分析结果的准确性。
高效液相色谱结果分析
测定回收率R（recovery）的具体方法可采用“回收 试验法”和“加样回收试验法”。
(1)回收试验 空白+已知量A的对照品（或标准品）测定， 测定值为 M
回收率
M - 空白
R=
X 100%
A
(2)加样回收试验 已准确测定药物含量P的真实样品+已 知量A的对照品（或标准品）测定，测定值为M
回收率 R = M - P X 100% A
数据要求 在规定的范围内，至少用9次测定结果评价，如 高、中、低三个不同浓度样品各测三次.
4.精密度(precision)
（通常采用峰面积A）成比例(正比). 标准曲线的范围确定取决于样品最低浓度与最高浓度. 标准曲线线性一般采用5-9点，并非点越多越好!
3.准确度(accuracy)
准确度 指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近 的程度，用百分回收率表示。
相对回收率 直接反映测定结果与真实值的接近程度,应 控制在100%左右(95%～105%)。
Unacceptable t=2
Awful t=4
正常
前伸
三.液相色谱图名词术语(7)
基线(Baseline): 在正常操作条件下,仅由流动相所产生 的响应信号.
基线噪声(Baseline Noise): 由各种因素所引起的基线波 动.
基线飘移(Baseline Drift): 基线随时间定向的缓慢变化.
分析方法重现性的测定是通过在不同的实验室内不同 的实验者对同一样品的分别测试而获得的。(获得的这 种再与正常检定下的精密度进行比较,从而确定该法的 耐用性,或称粗放度).
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第四节 高效液相色谱仪
1.流程图
HPLC色谱柱
数据处理系统
溶剂
自动进样器
色谱泵
检测器
废液
高效液相色谱仪由 高压输液系统、进样系统、分离系 统、检测系统、记录系统 等五大部分组成。
分析前，选择适当的色谱柱和流动相，开泵，冲 洗柱子，柱子达到平衡而且基线平直。
用微量注射器把样品注入进样口，流动相把试样 带入色谱柱进行分离，分离后的组分依次流入检测器， 最后和洗脱液一起排入废液缸。
三、 液-液分配色谱
固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相， 流动相的极性小于固定液的极性（正相 ）; 流动相的极性大于固定液的极性（反相 ）。
液液分配色谱
正相色谱法 1.极性固定相
聚乙二醇、氨基与腈基键合相 2.相对非极性流动相
4. 选择流动相时应注意的几个问题
（1）尽量使用色谱纯试剂作流动相，防止微量杂质长期累 积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。
（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏 柱子。
（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉 淀并在柱中沉积。
（4）黏度小些为好 否则造成传质速率缓慢，柱效下降。
（5）应与检测器相匹配。当使用紫外检测器时，流动 相不应有紫外吸收。
a. 超声波振荡脱气： 将配制好的流动相连容器 放入超声水槽中脱气10-20min。
这种方法比较简便，又基本上能满足日常 分析操作的要求，所以，目前仍广泛采用。
b. 真空脱气装置
将流动相通过一段由多孔性合成树脂膜制造的 输液管，该管外有真空容器，真空泵工作时， 膜外侧被减压，分子量小的氧气、氮气、二氧 化碳就会从膜内进入膜外而被脱除。
c. 硅碳键型： d. 硅氮键型：
≡Si—C ≡Si—N
化学键合固定相的特点
（1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传 质快； （2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相 冲击；耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定； （4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性。
➢固定相类型 极性固定相：正相色谱
梯度洗脱操作
在液相色谱中流速（压力）梯度和 温度梯度效果不大，而且还会带来一些 不利影响，因此，液相色谱中通常所说 的梯度洗脱是指流动相梯度，即在分离 过程中改变流动相的组成或浓度。
定义：流动相中含有两种（或更多）不 同极性的溶剂，在分离过程中按一定的 程序连续改变流动相的配比和极性，以 提高分离效果。
(5) 高效分离柱
柱体为直型不锈钢管，内径1～6 mm（常用4.6mm或 3.9mm），柱长5～40 cm（常用15cm或25cm）。
发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。 与GC色谱柱不同。
(6) 检测器
a. 紫外检测器 基于Lambert-Beer定律，即被测组分对紫外光或可 见光具有吸收，且吸收强度与组分浓度成正比。
20版 62 68 25 469 21 10 7
21版 363 142
698 13 17 27
22版 871 157 15 542 17 17 76
23版 1188 100 4 490 15 5 78
24版 1386 111 1 374 14 14 96
2 2 5 784 2 803 2 775
•Atomic Absorption Spectroscopy 原子吸收光谱 •Nuclear Magnetic Resonance 核磁共振 •Infrared ray 红外光谱 •Fluorescence spectrum 荧光光谱 •TI 滴定分析法
9.高效液相色谱分析
第一节 概 述
高效液相色谱法是继气相色谱之后，20世纪 70年代初期发展起来的一种以液体做流动相的新 色谱技术。
GC只适合分析较易挥发、且化学性质稳定的有 机化合物，而HPLC则适合于分析那些用GC难以分 析的物质。HPLC的应用范围远远超过GC。
1.高效液相色谱法定义
指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。 它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学 键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实 验技术建立的一种液相色谱分析法。 高压：150-350×105 Pa 高效：大于3万塔板/米（GC：103塔板/米） 高灵敏：10-9 g （紫外检测）、10-11 g （荧光检测）
3. 流动相选择
在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依 据。
常用溶剂的极性顺序：
水(最大) > 甲酰胺> 乙腈> 甲醇> 乙醇> 丙醇> 丙酮> 二氧六环> 四氢呋喃> 甲乙酮> 正丁醇> 乙 酸乙酯> 乙醚> 异丙醚> 二氯甲烷>氯仿>溴乙烷> 苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)
原理： 许多有机化合物，特别是芳香族化 合物、生化物质，如有机胺、维生素、激素、 酶等，被一定强度和波长的紫外光照射后，发 射出较激发光波长要长的荧光。
极性大先流出
固定相：早期涂渍固定液，固定液易流失， 较少采用；
化学键合固定相：将各种不同基团通过化学 反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。 C18柱（反相柱）。
五、凝胶色谱
• 以多孔性物质作固定相，样品分子受固定相孔径大 小的影响而达到分离的一种液相色谱分离模式。 •凝胶色谱又常被称作体积排斥色谱、空间排阻色谱。 •比固定相孔径大的溶质分子不能进入孔内，迅速流 出色谱柱。 •比固定相孔径小的分子才能进入孔内而产生保留， 溶质分子体积越小，进入固定相孔内的机率越大， 于是在固定相中停留（保留）的时间也就越长
如氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化合物、药品、 多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固醇、金属有机物等分 析。
第三节 HPLC的固定相和流动相
一.固定相
1.化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相 a. 硅氧碳键型： ≡Si—O—C b. 硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si — C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；
流动相溶液往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡。
气泡进入检测器后会在色谱图上出现尖锐的噪音峰。
气泡进入流路或色谱柱中会使流动相的流速变慢或出பைடு நூலகம் 流速不稳定，致使基线起伏。
气泡一旦进入色谱柱，排出这些气泡则很费时间。 溶解气体还可能引起某些样品的氧化或使溶液pH值发
生变化。
脱气方法
离线超声波振荡脱气和在线真空脱气。
查、杂质分离及含量测定的重要手段，以下以中国药典和美 国药典为代表说明HPLC在药品质量标准中的作用。
版本 1953年版 1963年版 1977年版 1985年版 1990年版 1995年版 2000年版
中国药典含量主要测定方法统计/ % 滴定分析法 质量分析法 分光光度法
68.8
11.9
0
68.2
当有样品组分流过检测器时，检测器把组分浓 度转变成电信号，经过放大，用记录器记录下来得 到色谱图。
色谱图是定性、定量和评价柱效高低的依据。
2.主要部件
(1) 高压输液泵
A、主要部件之一，压力：15～35MPa。 B、应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定、可调、耐腐蚀等 特性
(2) 脱气装置 流动相为什么要脱气
11.3
6.93
61.8
3.89
22.3
57.8
2.64
28.0
52.1
2.29
26.3
51.8
1.42
28.9
47.6
1.2
28.0
HPLC GC
0
0
0
0
0
0
1.17 0.29
6.09 0.44
8.01 0.57
17.8 0.6
美国药典含量测定方法比较 （品种数）
版本 HPLC GC TLC UV IR FL AAS NMR TI
色谱柱是用小粒径的填料填充而成，从而使柱 效大大高于经典液相色谱；
柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行 连续检测。
因此，高效液相色谱具有分析速度快、分离效 能高、自动化等特点。
所以称它为高压、高速、高效液相色谱法。
3.HPLC在药物分析中的作用
药品质量标准 在药物分析中，HPLC已成为对各类药物及其制剂进行鉴别、检
凝胶过滤色谱（gel filtration chromatography, GFC）： 以水或缓冲溶液作流动相的凝胶色谱 法。主要适合于水溶性高分子的分离。
凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography, GPC）： 以有机溶剂作流动相的凝胶色谱法。 主要适合于脂溶性高分子的分离。如甲苯和四氢 呋喃能很好地溶解合成高分子，所以GPC主要 用于合成高分子的分子量（分布）的测定。
TLC
13.4
16.6
12.2
16.1
21.4
HPCE
3.2
5.6
电化学
8.5
4.7
2.5
其他
10.6
11.4
10.0
9.0
8.8
论文总数
553
923
760
870
879
HPCE 高效毛细管电泳法
3.高效液相色谱法与其他分离方法的比较
项目 分离效率 分离速度 应用范围 样品用量 可否用于制备 可否用于痕量分析 分析鉴定 分析灵敏度
各组分的出峰顺序(正相色谱） 极性较小组分，吸附力较弱，容易解吸，
先流出。 极性较大组分滞留作用大，后流出。
二、液相色谱的流动相
1. 流动相特性
流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况
2. 流动相类别
按流动相组成分：单组分和多组分； 按极性分：极性、弱极性、非极性； 常用溶剂： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、 乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相 的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。