酪氨酸磷酸化蛋白在体外获能豚鼠精子上的分布与表达
哺乳动物精卵融合机制及研究进展
哺乳动物精卵融合机制及研究进展郭璇06级生物技术00611057摘要哺乳动物受精是一多步骤的复杂过程，包括精子获能、精子识别卵子透明带及发生顶体反应、精卵质膜相互勃附与融合、卵母细胞第二极体的排除、两性原核的形成与融合等。
最近基因打靶研究揭示出了参与精卵结合和融合的各种分子。
精子中ADAMs 因子(是含有裂解蛋白和金属蛋白酶结构域蛋白质家族)，包括繁殖因子α、繁殖因子β以及cyritestin，经过研究已经发现它们对精卵结合有重要作用，而对精卵的融合不重要。
通过研究推测出其受体为卵母细胞整合蛋白，其对精卵交互作用是必需的。
最近，一些研究表明CD9 和卵母细胞上GPI 锚定蛋白(glycosyl phosphatidyl inostol,糖基磷脂酰肌醇)，以及精子上的附睾蛋白DE 均是精卵融合过程中的侯选因子，如果缺乏这些蛋白质分子或其作用受到干扰将导致精卵融合机制紊乱。
综述重点讨论了参与精卵相互作用的相关分子机制。
关键词精卵融合分子机理；CD9；GPI；DE；ADAMs作为受精过程的重要一步，长期以来，人们试图找到精卵融合过程中的相关分子。
到目前为止，精卵融合的详细分子机制还没有搞清楚，但是最近的研究已揭示出特定的分子与精卵融合反应有关[2]。
下面就探讨一下与精卵融合相关分子在此交互作用中所起的作用。
1 卵母细胞CD9CD9 是跨膜四超蛋白家族的一个成员，这种蛋白质家族成员有4 个跨膜区域和2 个胞外环态[1]。
第二个环比第一个环大并且有高度保守氨基酸残基[2]。
四超家族与胞膜上相关因子形成多分子复合体，这一复合体与细胞连接、运动、增殖和分化有关[3]。
CD9 对细胞运动和分化的调节可能是通过其调节信号传导功能决定的。
其中包括细胞内钙离子水平的调节、酪氨酸磷酸化以及PKC 的依赖功能。
CD9 对细胞运动、转移和生长的影响部分与CD9 调节细胞的粘附有关。
首先是从抗CD9 的实验中发现了CD9 能在受精中产生作用的。
细胞内蛋白酪氨酸磷酸化机制分析
细胞内蛋白酪氨酸磷酸化机制分析细胞内蛋白酪氨酸磷酸化（tyrosine phosphorylation）是一种常见的细胞信号转导过程，在细胞生长、分化、凋亡、肿瘤、感染等多种生物学过程中起着重要作用。
在这个过程中，酪氨酸激酶（tyrosine kinase）在其底物蛋白上转移磷酸基团，从而改变底物蛋白的构象和功能，进而影响细胞的生理和病理状态。
本文主要从酪氨酸磷酸化的作用、机制和调节三个方面对其进行分析。
一、酪氨酸磷酸化的作用酪氨酸磷酸化在多个细胞生理和病理过程中发挥重要作用。
例如：生长和分化：酪氨酸激酶可以激活多种生长因子受体（growth factor receptor），进而诱导细胞生长和分化。
此外，酪氨酸激酶还可以直接磷酸化多个细胞内信号转导蛋白，从而调控细胞周期和凋亡。
肿瘤：许多肿瘤细胞中具有突变的酪氨酸激酶或增强的酪氨酸磷酸化水平，这些异常导致了肿瘤细胞的无节制增殖和侵袭。
因此，针对这些激酶的抑制剂成为了癌症治疗的重要策略之一。
感染：病毒和细菌常常利用酪氨酸激酶和酪氨酸磷酸化来调节宿主细胞的信号转导，以促进它们自身的生存和复制。
二、酪氨酸磷酸化的机制酪氨酸磷酸化发生在酪氨酸残基（Tyr）的羟基上，通过酪氨酸激酶介导。
酪氨酸激酶主要分为两大类：酪氨酸肽激酶（tyrosine protein kinase）和酪氨酸激酶样受体（tyrosine kinase-like receptor）。
前者是一类独立的酶，可以磷酸化细胞内各种底物蛋白，例如EGFR、Src、ABL等。
后者则是细胞膜上的跨膜蛋白，其激酶活性的激活需要特定的配体（例如生长因子或激素）结合。
目前已知的酪氨酸激酶约有100种，它们的底物多种多样，包括直接转录调控因子（例如STAT），各种信号转导蛋白（例如PI3K、Ras等），以及调节细胞骨架和细胞外基质附着的蛋白质。
这种多样性保证了酪氨酸磷酸化的广泛影响。
除了酪氨酸激酶外，还有一类酪氨酸磷酸酶（tyrosine phosphatase）可以水解酪氨酸的磷酸化。
Ass1在不同组织中的表达定位、调节及生理病理功能阐述-生理学论文-生物学论文
Ass1在不同组织中的表达定位、调节及生理病理功能阐述-生理学论文-生物学论文——文章均为WORD文档，下载后可直接编辑使用亦可打印——精氨琥珀酸合酶（argininosuccinate synthase 1,Ass1）能够催化瓜氨酸和天冬氨酸形成精氨琥珀酸，在精氨琥珀酸裂解酶（argininosuccinate lyase,Asl）的作用下，生成精氨酸。
精氨酸通过精氨酸酶水解生成尿素和鸟氨酸，鸟氨酸既可以被鸟氨酸脱羧酶代谢，生成多胺；也可以在鸟氨酸转氨酶作用下重新生成瓜氨酸，形成尿素循环；另外，精氨酸还可以通过一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,NOS）作用生成一氧化氮（nitric oxide,NO）和瓜氨酸，形成瓜氨酸---一氧化氮循环。
因此，Ass1 是生成精氨酸、尿素和NO 的关键限速酶。
根据精氨酸的代谢途径不同，Ass1 在组织中表达水平也是不同的。
本篇综述主要就Ass1 在不同组织中的表达定位、表达调节及生理和病理功能进行阐述。
一、Ass1 的生化结构Ass1 为编码精氨琥珀酸合酶的基因，位于第9号染色体。
Ass1 由同源四聚体构成，包含412 个氨基残基。
比较cDNA 序列发现，Ass1 在人、牛、大鼠和小鼠中高度同源。
它能催化瓜氨酸与天冬氨酸在ATP 的作用下生成精氨琥珀酸。
人的Ass1 结构包含三个主要部分：核苷酸结合部分、合成酶部分及多聚化的螺旋 C 端。
对瓜氨酸血症的病人研究发现，Ass1 有多种突变位点。
大多数位点突变后会破坏它们与周围单体形成二聚体或使它们与周围单体的作用缺失，导致构象改变和电子的重新分布。
此外，一些突变位点是直接与底物结合（如Gln40（Leu）和Arg127（Gln））,并很可能对催化活性起直接作用。
还有一些位点突变（如Val345（Gly））,使得一些和瓜氨酸相互作用的区域和大部分寡聚化区域缺失，使蛋白不能正确的折叠。
二、Ass1 的表达定位Ass1 早期发现于肝细胞中。
受精——精选推荐
受精第四章受精（fertilization）受精：指两性配⼦（卵⼦和精⼦）相互融合⽽形成⼀个新的细胞－－合⼦(zygote)的⽣物学现象。
在受精过程中，精⼦激活卵⼦并开始分裂；同时精⼦把雄性单倍体遗传物质引⼊卵⼦，恢复物种细胞原有的⼆倍染⾊体，保证了物种延续与进化。
⽬的要求掌握配⼦在雌性⽣殖道中的运⾏、正常受精过程、异常受精现象、精⼦屏障与精⼦库、获能与顶体反应、阻⽌多精⼦⼊卵的机理。
重点：配⼦在受精前的运⾏及准备难点：配⼦在受精前的变化第⼀节配⼦在受精前的准备⼀精⼦在受精前的准备⼆卵⼦在受精前的准备第⼆节受精过程⼀正常受精过程⼆阻⽌多精⼦受精的反应三异常受精第⼀节配⼦在受精前的准备受精过程发⽣在输卵管的壶腹部后/下段，受精发⽣之前，精⼦必须从射精部位运⾏到受精部位，并完成精⼦获能的变化，才能和卵⼦结合⽽形成合⼦。
⼀精⼦在受精前的准备⼀）射精部位阴道射精型动物：⽜、⽺；宫射精型动物：猪、马。
进⼊阴道或⼦宫内的精⼦起初悬浮于精清中，随后与母畜⽣殖道分泌物相混，当精⼦达到受精部位时，⼏乎完全悬浮于单纯的母畜⽣殖道分泌物中。
⼆）精⼦在母畜⽣殖道内的运⾏：运⾏机理1）⾃⾝运动能⼒：精⼦尾部鞭⽑的运动。
通过⽣殖道的关键部位、穿透卵母细胞，没有精⼦本⾝的运动就没有受精过程（ICSI）。
2）母畜⽣殖道平滑肌的收缩：主使精⼦很快的进⼊输卵管（⼏⾄⼗⼏分钟），E、交配刺激、精液中的某些物质刺激⽣殖道的收缩（⼦宫向输卵管⽅向移动）。
运⾏速度快! 运⾏到受精部位的时间：⽜2-15min; ⽺2-30min; 马2-4min; 猪15-30min 。
运⾏速度的影响因素激素:E2, OXT, PG授精⽅式：⽜在A.I时仅需2.5min，⾃然交配则需15min。
疫学作⽤：精⼦含有种特异性的精⼦表⾯抗原，在⼦宫颈黏液中可形成相应抗体，抗原抗体作⽤使运⾏⾄⼦宫腔内的精⼦发⽣凝集⽽降低其活动性。
⼦宫蠕动：发情结束后给绵⽺受精，精⼦⼏乎不能到达输卵管，性刺激、按摩⽣殖器官和乳房，可刺激⽣殖道蠕动，促使精⼦的运⾏。
发育生物学笔记
重点：1. 掌握发育生物学的概念发育生物学(developmental biology)是应用现代生物学的技术研究生物的生殖、生长和分化等发育本质的科学。
2. 掌握发育生物学研究的对象和任务①发育生物学主要研究多细胞生物体从生殖细胞的发生、受精、胚胎发育、生长、衰老和死亡，即生物个体发育 (ontogeny) 中生命过程发展的机制；②生物种群系统发生(systematics development) 的机制。
发育生物学的研究任务一个单细胞受精卵如何通过一系列的细胞分裂和细胞分化产生有机体的所有形态和功能不同的细胞，这些细胞又如何通过细胞之间的相互作用共同构建各种组织和器官，建成一个有机体并完成各种发育过程的。
阐明个体发育机制的核心问题是弄清遗传信息以何种方式编码在基因组上，DNA上的一维信息又是如何控制生物体的三维形态结构的构建和生命现象的发展。
3.动物发育的主要特征(1 ) 个体发育的特征；生物个体发育的特征是具有严格的时间和空间的次序性，这种次序性由发育的遗传程序控制。
发育是有机体的各种细胞协同作用的结果，也是一系列基因网络性调控的结果。
在发育的过程中涉及多种生命现象，如细胞分裂，细胞分化，细胞迁移，细胞凋亡，生长、衰老和死亡等。
(2 ) 个体发育的功能生物个体发育有两个主要的功能：①产生细胞的多样性并使各种细胞在本世代有机体中有严格的时间和空间次序性；②保证世代的交替和生命的连续。
4.动物发育的基本规律(1)受精新个体的生命开始于两性配子(gamete)——精子(sperm)和卵子(ovum)的融合，这个融合过程称为受精(fertilization)。
(2) 胚胎发育——形成幼体通过受精激活发育的程序，受精卵开始胚胎发育。
大多数动物要经过卵裂、原肠胚形成、神经胚形成(neurulation)、器官形成(organogenesis)等几个主要的胚胎发育阶段才能发育成为幼体。
(3)生长发育——成体 (4)衰老与死亡5. 了解后成论和先成论的基本内容后成论;胚胎是由简单到复杂逐渐发育形成的，这个理论后来称为后成论。
精子膜蛋白的研究进展
精子膜蛋白的研究进展精子膜表面蛋白是精子功能得以实现的最主要物质，对其进行深入研究能从蛋白质水平研究其生物学的功能、揭示其生物生殖的分子机制，进而为避孕疫苗的开发奠定了基础。
本文就近年来精子膜蛋白的研究进展作一综述。
标签：精子膜蛋白；精卵相互作用；避孕疫苗精子是一种高度分化的细胞，其膜蛋白种类繁多，是精子功能得以实现的最主要物质，与受精过程和胚胎的早期发育关系密切，可能参与精子的发生、成熟、获能、精卵粘附与识别、顶体反应、穿越透明带（ZP）、精卵融合等诸多环节。
近几年来，一些新的精子膜特异蛋白不断被发现，这些都有助于从分子水平揭示受精的过程和不育的机制，为提高不育特别是免疫性不育的诊断与治疗水平以及避孕疫苗的研发提供了必要的基础。
1 与精子发生、成熟与获能相关的精子膜蛋白1.1 精子成熟前后膜蛋白的变化精子作为哺乳动物一种特殊的具有运动能力的单倍体细胞，在发生、成熟、获能过程中，其形态结构、生化组成不断发生变化，以达到与其功能相适应。
Kaul等[1]通过碘放射标记和免疫学方法检测羊精子获能前后膜表面蛋白的变化，发现在获能前能够检测到相对分子质量（Mr）为17800、29100、33400、45600、85100、123200的蛋白条带，在获能后只能检测到Mr为26000、32100、40100、45600的蛋白条带，而在顶体反应后的精子表面只能检测到Mr为45600的1个蛋白条带。
精子获能前后一个明显的变化是高相对分子质量的蛋白质逐渐减少，而低相对分子质量的蛋白质增多。
1.2 附睾特异性分泌蛋白HongrES1 是丝氨酸蛋白酶抑制剂家族的新成员并受雄激素调控。
该蛋白分泌到附睾管腔液中后，结合到精子头部，促进精子获能及超激活运动，获能后的精子HongrES1蛋白在头部的定位消失[2]。
1.3 p34H蛋白在精子获能的过程中重新暴露出来。
p34H蛋白可能是一种透明带蛋白，它的重新暴露有利于精子膜在受精过程中与透明带的相互作用。
综述蛋白质磷酸化在信号转导过程中的作用
蛋白质磷酸化在细胞内信号传导中的意义摘要：生物体对环境(包括外环境和内环境)信号变化有极高的反应性。
细胞对外界刺激的感受和反应都是通过信号转导系统的介导实现的。
该系统由受体、酶、通道和调节蛋白等构成。
通过信号转导系统、细胞能感受、放大和整合各种外界信号。
蛋白质的可逆磷酸化在这一过程中起着至关重要的作用。
关键词：蛋白质磷酸化，细胞信号转导Abstract：The organisms are very sensible to the changes of environmental signals(both external or internal) .The the feelings and reactions of the cells to the external stimulation are all dependent on the signal transduction system. The system consists of receptors, enzymes, channels and regulatory proteins. Acording to the signal transduction system, cells can feel, amplify and integrate a variety of external signals. Reversible protein phosphorylation plays an very important role in this progress.Key words: protein phosphorylation; cells signal transduction生物体对环境(包括外环境和内环境)信号变化有极高的反应性。
如精子获能的过程中精子周围环境因子以及活性氧的诱导作用等[1][2]。
细胞对外界刺激的感受和反应都是通过信号转导系统(signal transduction system)的介导实现的。
细胞受精过程课件
二. 皮层反应(cortical reaction)
精子与卵子接触，卵就开始发生一 系列深刻变化，为卵子激动 (activation), 首先是皮层变化, 即皮 层反应 . 此从精子入卵点开始， 然后波及整个皮层. 在精卵接触点皮层颗粒首先破裂， 内含物（糖蛋白类）排出，一部 分与卵外卵黄膜形成受精膜，其 余保留在受精膜和卵之间的卵周 隙中，吸水使受精膜举起。
猪中结合于 ZP2 的好象由原顶体粒蛋白 (proacrosin) 调节，它结合于透明带， 此后变成一种蛋白酶 —— 顶体粒蛋白 (acrosin)，可局部消化透明带.
3. 顶体反应的调控机制
1)离子调控 Ca2+起主导地位。哺乳动物精子中，钙主要分布于 顶体区、顶体后区的顶体外膜表面，及精子质膜内表面， Ca2+贮存区是顶体反应的激烈区。膜上有Ca 2+泵、Na + / Ca 2+ 交换器和钙离子通道3个Ca 2+转移系统参与调控细胞内Ca 2+浓 度。 Ca 2+内流是早期顶体反应的关键，在小鼠、猪、牛、豹中已获 证实。Ca 2+内流依赖于Na + / Ca 2+交换 。除Ca2+的调控以外， K+ 、Mg2+、CI-、H+也对顶体反应起调控作用 Ca2+内流可导致H+外流，使精子内部pH升高，诱发顶体反应 2)脂质调控 脂质在精子顶体反应中调控膜的流动性和“钙泵” 的活性。牛和豚鼠精获能后，顶体外膜和精子质膜上的溶血 卵磷脂含量下降，而卵磷脂含量升高。卵磷脂是由溶血卵磷 脂酸产生，并依赖于Ca2+和磷脂酶A2作用产生溶血化合物， 导致脂膜溶解，并发生胞吐作用。
MPF由调节亚基Cyclin B与催化亚基p34cdc2组成，其活化不依赖 卵母细胞的转录水平的活动，依赖于翻译水平的活动。 Cyclin B是一种周期性合成和降解的蛋白质，对p34cdc2的去磷 酸化和磷酸化具调节作用。 Cyclin B与预存在卵中无激酶活性的p34cdc2结合在一起，形成低 活性的MPF前体。在磷酸酯酶(cdc25基因产物)作用下，MPF 前体中p34cdc2的Thr一14和Tyr一15被去磷酸化, Thr - 161保持 原有被磷酸化的状态，成为具激酶活性的MPF。活化的MPF 具自我扩增作用，即通过 ( 间接 ) 活化 Cdc25 进一步使更多的 MPF前体活化。
lkb1（thr336）磷酸化多克隆抗体的制备及在细胞中表达的检测
安徽大学硕士学位论文LKB1（Thr336）磷酸化多克隆抗体的制备及在细胞中表达的检测Preparation and Intracellular Expression detection of Phosphorylated LKB1 (Thr336) Polyclonal Antibody姓名：任艳敏学科专业：细胞生物学研究方向：细胞凋亡与肿瘤发生指导教师：黄蓓完成时间： 2008-5LKB1（Thr336）磷酸化多克隆抗体的制备及在细胞中表达的检测摘要PJS综合症是一种遗传性肿瘤综合症，该病患者患肿瘤的几率增加。
致病基因编码的核定位激酶LKB1作为肿瘤抑制子在发挥作用，但是LKB1在细胞中调控的机制及生理基础都不清楚。
研究表明LKB1在细胞中被磷酸化并且Thr336磷酸化位点在LKB1抑制细胞生长中起到重要的作用。
为了研究LKB1在不同细胞中的表达规律及其对细胞增殖的抑制功能，本实验通过生物信息学方法选取LKB1 Thr336位点附近10个氨基酸且使Thr336位点磷酸化，并铰链上BSA，以此为抗原，对兔子进行免疫，制备的抗血清通过Western blot检测抗体效价，并用LKB1抗体和p-LKB1(Thr336)抗体分别对人正常肝脏细胞HL7702、人胚肾细胞HEK293、小鼠肉瘤细胞S180、非洲绿猴肾细胞COS7及人结肠癌细胞Caco2检测。
结果显示，LKB1抗体不仅识别His-LKB1蛋白而且识别p-LKB1(Thr336)肽段，而p-LKB1(Thr336)抗体仅识别p-LKB1(Thr336)抗原；且在正常细胞及肿瘤细胞中LKB1和p-LKB1(Thr336)表达量有差异，在增殖越快的细胞中，p-LKB1(Thr336)表达量越高。
关键词： LKB1; 磷酸化多克隆抗体; 免疫印迹法; 生物信息学AbstractPeutz±Jeghers syndrome is an inherited cancer syndrome, which results in a greatly increased risk of developing tumours in those affected. The causative gene encodes a nuclear-localized protein kinase, termed LKB1, which is predicted to function as a tumour suppressor. The mechanism by which LKB1 is regulated in cells is not known, and nor have any of its physiological substrates been identified. Recent studies have demonstrated that LKB1 is phosphorylated in cells and Its Thr336 phosphorylation site play an important role in cell growth inhibition. To study the expression and the suppression to cell proliferation of LKB1in different cells, the LKB1Thr336 was phosphorylated and the neighboring 10-amino acid region was chosen to hinge on a BSA through Bioinformatics methods. Then the constructed peptide was used as antigen to immunize rabbits and antibody titer was performed by anti-serum western blot detection. In addition, Rabbit anti-LKB1 antibody and the p-LKB1 (Thr336) antibody were also used to assay with several cell lines, including the human liver cells HL7702, embryonic kidney cells HEK293, the mice sarcoma cells S180, the African green monkey kidney cells COS7 and the human colon cancer cells Caco2. The results showed that Rabbit-anti-LKB1 antibodies can interact with both His-LKB1 protein and p-LKB1 (Thr336) peptide, while the p-LKB1 (Thr336) antibody can only interact with p-LKB1 (Thr336) antigen. Moreover, there are quite different expression patterns of LKB1 and p-LKB1 (Thr336) between normal and tumor cells. Our results also suggested that the expression levels of p-LKB1 (Thr336) are in positive correlation with the proliferation of cells.Key words：p-LKB1 (Thr336); Phosphorylated Polyclonal antibody; Western blot；Bioinformatics目录第1章绪论 (7)1.1. LKB1/STK11 的基本结构及分布 (7)1.2 LKB1/STK11的生物学功能 (7)1.3. LKB1磷酸化位点研究现状 (10)1.4.国内外LKB1 Thr336位点磷酸化抗体研究现状 (11)1.5.本实验的目的和意义 (11)第2章LKB1蛋白的生物信息分析及磷酸化抗原的设计 (14)2.1 实验有关数据库 (14)2.2 实验方法 (14)2.2.1 LKB1蛋白序列分析 (14)2.2.2.LKB1磷酸化位点分析 (15)2.2.3. LKB1抗原决定蔟的预测 (17)2.2.4. LKB1疏水性及抗原性分析 (17)2.2.5.合成肽段的设计原则 (19)2.3. LKB1抗原设计合成结果及纯度检测 (19)第3章His-LKB1重组蛋白的诱导表达及分离纯化 (21)3.1实验材料 (21)3.2实验方法 (26)3.3. SDS-PAGE检测实验结果 (30)第4章 LKB1（Thr336）多肽抗原的设计及其多克隆抗体的制备 (33)4.1 实验试剂 (33)4.2 实验方法 (33)4.2.1兔子免疫与血清处理 (33)4.2.2 Western blot方法检测抗体及效价 (34)4.3 实验结果 (36)第5章 P-LKB1（Thr336）抗体的特异性鉴定 (38)5.1 实验材料 (38)5.2 实验方法-Western blot检测抗体特异性 (38)5.3 Western Blot检测抗体特异性结果 (38)第6章 p- LKB1（Thr336）多克隆抗体的分离纯化 (39)6.1 实验材料 (39)6.2 实验方法-抗原条结合法分离纯化抗血清 (40)6.3 实验结果 (40)第7章LKB1在正常细胞及肿瘤细胞中表达的检测 (41)7.1. 实验材料与试剂 (41)7.2 实验方法 (42)7.2.1细胞培养方法 (42)7.2.4 LKB1在细胞中表达规律的检测 (45)7.3 实验结果 (45)总结 (47)1.. 结果与讨论 (47)2. 本实验创新点 (48)3. 存在的问题与展望 (48)致谢 (49)参考文献 (50)第1章绪论LKB1 基因,又名STKⅡ( serinePthreonine proteinkinase 11) 基因, 是由Hemminki 等[1]在1998 年从Peutz Jeghers syndrome ( PJS) 患者的血细胞中克隆出来的一种基因, PJS是一种常染色体显性遗传疾病，患者不但肠道、胃、胰腺发生恶性肿瘤的可能性增加, 而且在乳腺、子宫颈、肺、卵巢、睾丸发生恶性变危险度也增加，初步估计93 %的PJS 患者平均在43 岁时发生恶性肿瘤[2]。
生物学题库
一、填空题(part1)：1、显微镜的分辨率约等于光波的，通常把这一数值看作是光学显微镜分辨力的。
2、HeLa细胞具有两种中间丝，它们是和。
3、用以研究蛋白质之间相互作用的技术有、。
（酵母双杂交、噬菌体展示技术）4、单克隆抗体是细胞和细胞在聚乙二醇或灭活的病毒介导下发生融合的。
5、大分子的内吞往往是首先同质膜上的受体相结合，然后质膜内陷成，继之形成，这种内吞方式称为受体介导内吞。
6、细胞通讯信号有四种，内分泌信号、旁分泌信号、和。
7、和融合，形成异噬小体。
8、细胞SOS 细胞蛋白质在细胞内的分选的途径是____________，____________，____________。
9、近年来的研究证明线粒体内膜上的基粒F1因子是由____种共____条多肽组成，而F0因子则至少由_____条多肽组成。
10. 从种群调节的角度，可将生态因子分为＿＿＿＿和＿＿＿＿二类。
11. 种群动态的最基本研究方法有＿＿＿＿、＿＿＿＿和＿＿＿＿等。
12. 按锥体形状，可将种群划分为＿＿＿＿、＿＿＿＿和＿＿＿＿三个基本类型。
13. 物种形成的三个步骤是＿＿＿＿、＿＿＿＿和＿＿＿＿；物种形成的三种方式是＿＿＿＿、＿＿＿＿和＿＿＿＿。
14. 次级种群参数有＿＿＿＿、＿＿＿＿、＿＿＿＿和分布型等。
15. 生态学研究的组织层次有＿＿＿＿、＿＿＿＿、＿＿＿＿、＿＿＿，此外，还有分子和细胞水平，以及景观、生物圈水平。
16. 根据rm=ln(R0)/T可知，内禀增长力决定于＿＿＿＿、＿＿＿＿和＿＿＿＿。
17. ＿＿＿＿、＿＿＿＿是物种进化的两种动力。
18. 判断物种是否在某一生境中定居的标准是＿＿＿＿。
19. 阴性植物的光补偿点要比阳性植物的＿＿＿＿。
20. 生物学零度是指＿＿＿＿。
21. 按照生态学研究的组织层次，经典生态学又可划分为＿＿＿＿＿＿、＿＿＿＿＿、＿＿＿＿＿和＿＿＿＿＿＿等分支学科。
22. 生态因子作用具有＿＿＿＿＿、＿＿＿＿、＿＿＿＿和＿＿＿＿＿等特点。
Her-2资料
1.Her-2结构：Her2位于染色体17q21，编码分子量为185KD的跨膜糖蛋白，由胞内酪氨酸激酶结构域、跨膜区和胞外结构域(extraeellular domain，ECD)三部分组成，是具有蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinace，PTK)活性的跨膜蛋白，属于表皮生长因子受体家族的成员。
2.Her-2功能：目前还没有发现能与Her2直接结合的配体，但HER-2与其他受体结合成异二聚体后能发挥信号转导功能，与不含Her2的二聚体相比其信号更强；另一方面，Her2的异二聚体使EGFR(表皮生长因子受体)在细胞膜过表达，加速了细胞的增殖，导致肿瘤形成和生长加快。
HER-2 + 其他受体→异二聚体→发挥信号转导功能HER2的异二聚体使EGFR(表皮生长因子受体)在细胞膜过表达→细胞的增殖↑→肿瘤形成和生长↑3.Her2分子的检测目前一般采用免疫组织化学(IHC)检测Her2受体蛋白过表达，应用荧光原位杂交(FISH)和显色原位杂交(CISH)法检测Her2基因扩增的水平。
4.Her2与肿瘤发生及发展（1）文献一：Her2受体胞内区有PTK活性，自身也具有若干酪氨酸残基磷酸化位点。
当生长因子与Herl、Her3或Her4结合后，诱导蛋白膜外区构象改变，与Her2受体分子形成异二聚体，使细胞膜内侧的活性显著增加，导致受体分子Tyr互相催化发生自身磷酸化。
进而引发瀑布式的连锁反应，信号转导经细胞膜和细胞间质至细胞核，激活基因，促进有丝分裂等，从而诱发肿瘤。
较多的研究发现Her2原癌基因通过其介导的主要信号通路如Ras—Raf—Mek—MAPK(丝裂原活化蛋白激酶通路、P13K—Akt(磷脂酰肌醇一3一激酶)通路等使细胞增殖周期缩短，恶性表现增强以及抗凋亡。
（2）文献二：HER2与肿瘤的发生及发展HER2基因扩增与增加细胞分化、迁移、肿瘤侵袭、局部及远处转移、加快血管发生和减少细胞凋亡密切相关。
常见的蛋白质磷酸化位点
常见的蛋白质磷酸化位点
蛋白质磷酸化是一种常见的后转录修饰方式，可以改变蛋白质的结构和功能。
在细胞信号传导和代谢调节等生物学过程中，磷酸化是一种重要的调节机制。
以下是一些常见的蛋白质磷酸化位点：
1. 丝氨酸磷酸化位点：丝氨酸是最常见的磷酸化位点之一，能够影响蛋白质的构象和功能。
2. 酪氨酸磷酸化位点：酪氨酸磷酸化常被用于调节酪氨酸激酶的活性，从而影响信号传导和细胞增殖。
3. 赖氨酸磷酸化位点：虽然赖氨酸磷酸化不太常见，但在某些蛋白质中也会出现，并被认为与细胞周期和增殖有关。
4. 鸟氨酸磷酸化位点：鸟氨酸磷酸化在很多生物过程中都发挥了重要功能，包括细胞凋亡、代谢调节和信号传导等。
以上是一些常见的蛋白质磷酸化位点，了解这些位点对于理解细胞信号传导和调节机制非常重要。
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蛋白质酪氨酸磷酸化在代谢和疾病中的作用机制
蛋白质酪氨酸磷酸化在代谢和疾病中的作用机制蛋白质是生命的重要组成部分，它在细胞代谢中扮演重要的角色，同时它们还具有多种特定的生物学功能，如酶催化、细胞信号传导和细胞结构维护等。
而酪氨酸磷酸化（tyrosine phosphorylation）作为一种常见的蛋白质修饰方式，已经被广泛研究。
本文将就蛋白质酪氨酸磷酸化在代谢和疾病中的作用机制进行探讨。
1. 酪氨酸磷酸化的概念和基本机制酪氨酸磷酸化是通过激酶将酪氨酸置换为磷酸基团来进行的，它是一种磷酸化修饰方式之一，同时也是蛋白质修饰中最重要、最复杂和最广泛的类型之一。
实践证明，酪氨酸磷酸化可使蛋白质的运输，分泌和转录发生明显的改变，同时还能够调节基因表达和调控信号通路。
从基本机制来看，酪氨酸磷酸化的过程是可以被几个关键酶分别进行调控的，包括酪氨酸激酶（tyrosine kinase）、丝氨酸/苏氨酸激酶（Ser/Thr kinase）和酪氨酸磷酸酶（tyrosine phosphatase）等。
这些酶通过结构特定的底物-酶相互作用来实现底物的磷酸化和去磷酸化。
2. 酪氨酸磷酸化在代谢中的作用酪氨酸磷酸化在代谢中的作用不仅具有重要的调控作用，同时还对细胞能量代谢有着很深的影响。
以肌红蛋白为例，它被认为是联合代谢和能量象征，其在肌肉纤维中承担了细胞能量供应，并发挥了高效的能量储存功能。
同时，由于肌红蛋白受到了酪氨酸磷酸化的调节，因此可以通过其来改善肌肉代谢和体重管理。
另外，研究还表明，酪氨酸磷酸化可以对脂肪酸的合成和分解产生影响，并调节葡萄糖代谢途径中的酶活性，从而影响葡萄糖酮体生成和血糖水平的调节。
3. 酪氨酸磷酸化在疾病中的作用除了对代谢产生影响外，酪氨酸磷酸化在疾病中也有着重要的作用，例如糖尿病、癌症、炎症和心血管疾病等。
糖尿病是一种典型的代谢疾病，它的发展与胰岛素分泌和胰岛素抵抗的失调密切相关。
研究表明，酪氨酸磷酸化调节了胰岛素/肌红蛋白信号通路，并通过与相关激素和细胞分子相互作用，对糖尿病的发展产生极其重要的影响。
磷酸化位点_差异调控_概述说明以及解释
磷酸化位点差异调控概述说明以及解释1. 引言1.1 概述在细胞信号转导和调控中，磷酸化位点差异调控是一个广泛关注的领域。
磷酸化是一种常见的蛋白质修饰方式，通过在特定的氨基酸残基上添加磷酸基团来改变蛋白质的结构和功能。
这种修饰可以发生在蛋白质分子的不同位置，而磷酸化位点的差异调控则涉及到不同基因或亚型之间相同或相似的氨基酸残基被磷酸化的程度和效果的差异。
1.2 文章结构本文将围绕着磷酸化位点差异调控展开讨论。
首先，我们将介绍磷酸化位点及其重要性，并解释为什么研究其差异调控具有重要意义。
其次，我们将深入探讨这种差异调控机制，并提供具体的实例进行解释。
最后，我们将总结磷酸化位点差异调控的重要性和潜在应用价值，并展望未来的发展方向和研究前景。
1.3 目的本文旨在对磷酸化位点差异调控进行概述说明和解释，以增进读者对这一领域的了解。
通过分析磷酸化位点的差异调控机制和相关实例，我们希望揭示其重要性和潜在应用价值，并推动更多关于这方面的研究工作。
此外，我们还将展望未来的发展方向，以期为科学家们提供新的研究思路和探索空间。
2. 磷酸化位点差异调控2.1 什么是磷酸化位点磷酸化是一种常见的细胞信号转导过程，通过将磷酸基团添加到蛋白质的特定氨基酸残基上，从而改变蛋白质的结构和功能。
其中，磷酸化位点指的是在蛋白质分子中发生磷酸化修饰的特定位置或氨基酸残基。
2.2 差异调控的重要性磷酸化位点差异调控起着至关重要的作用，对于细胞进程、生物体发育以及各种疾病的发生和进展具有重要影响。
不同蛋白质上的磷酸化位点可以调控其相互作用、稳定性、代谢途径等多个方面。
在细胞内部，通过对特定蛋白质进行不同位点的磷酸化修饰，可以调节信号传递通路并参与细胞内各种生物学过程。
例如，在细胞周期调控中，几个关键蛋白质之间不同位点的磷酸化调控决定了细胞周期的进行和细胞分裂的发生。
此外，磷酸化位点差异调控与多种疾病的发生密切相关，如肿瘤、心血管疾病等。
2.3 差异调控的机制在细胞中，磷酸化位点的差异调控是通过激酶和磷酸酶等特定酶类的活性来实现的。
sirt蛋白定位
sirt蛋白定位
sirt蛋白是一个广泛的蛋白家族，成员数量在不同的物种中有所不同。
在哺乳动物中，sirt蛋白家族有7个成员，分别命名为SIRT1-SIRT7。
这些蛋白具有不同的亚细胞定位和功能。
1. SIRT1：主要定位在细胞核和细胞质中，具有去乙酰化酶活性，参与细胞代谢、生长和衰老等过程。
2. SIRT2：主要定位在细胞质中，参与多种细胞过程，如细胞骨架的组装和细胞分裂等。
3. SIRT3：主要定位在线粒体中，参与氧化应激和能量代谢等过程。
4. SIRT4：主要定位在细胞质中，可能参与Akt等激酶的磷酸化调节。
5. SIRT5：主要定位在线粒体中，参与蛋白质的翻译后修饰和代谢等过程。
6. SIRT6：主要定位在细胞核中，参与DNA修复和炎症反应等过程。
7. SIRT7：主要定位在核仁中，参与rDNA的转录和核糖体的合成等过程。
精子获能与顶体反应
精子获能与顶体反应PART 1 精子获能定义：精子获能是精子获得穿透卵子透明带能力的生理过程，是精子在受精前必须经历的一个重要阶段。
其实，精子在附睾内已经获得了受精能力，但由附睾分泌的一种物质附于精子表面，抑制了他的受精能力，这种物质被称为去能因子。
精子进入女性生殖道以后，去能因子的作用被解除，精子才具有真正的受精能力，这就是精子获能。
能够解除去能因子的物质称为获能因子。
特点：精子超活化运动方式：强有力的、尾部呈“鞭打样”的不对称运动（精子超活化）。
判断精子超活化的指标：轨迹速度增加、直线型降低、前向性降低、侧摆幅度增加。
使用CASA，标准不同。
生理意义：有利于精子通过输卵管腔内粘稠介质；②赋予精子穿透放射冠和透明带力学基础。
代谢方式改变获能精子以葡萄糖为主要能源，进行有氧和无氧两种功能方式。
获能精子酶系及信号系统发生变化：①腺苷酸环化酶被激活；②磷脂酶被激活；③蛋白质磷酸化加剧。
获能精子顶体素原→顶体素。
精子膜改变膜蛋白变化：①去除抑制顶体反应的稳定因子；②丢失掩盖精卵识别位点的蛋白质，暴露或重新分布与精卵识别有关的蛋白质；膜凝集素受体变化：为精卵识别创造了条件。
膜流动性变化：①去除精子膜表面遮盖物，暴露精卵识别位点；②膜通透性变化，有利于钙离子内流，增强精子活力；③精子膜出现高度特异性区域，有利于顶体反应和受精。
形态变化线粒体松散或肿胀。
作用过程和分子机制胆固醇外流精子获能与胆固醇外流(cholesterol efflux)密切相关，Petrounkina A M等表明获能过程中胆固醇外流引起精子膜流动性改变、精子膜脂类发生重排及胆固醇/磷脂比率下降,这些引起精子膜去稳定性的变化有利于获能的完成。
ROS水平变化试验证实活性氧(Reactive oxygen species,ROS)的产生是精子获能过程中最早发生的事件之一。
获能过程伴随O2-的产生,O2-的产生在获能初期(孵育开始后15 min～20 min)较高,随后缓慢降低至较低水平,甚至比非获能精子水平还低。
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ｐ Ｈ ６ ． ８ ）裂 解， ６ ０ ０ ０ ｇ离 心 ５ ｍ ｉ ｎ ，收 取 上 清，加 入 ７ ０ ｍ ｍ ｏ ｌ ／ Ｌ 巯基乙醇， １ ０ ０ ℃ 处理 ５ ｍ ｉ ｎ 。根 据 Ｂ Ｃ Ａ蛋 β 白定量检 测 ｋ ｉ ｔ 说 明 书 检 测 蛋 白 浓 度， ５ ｇ精 子 蛋 白 μ
６ （ 约 ２× １ ０ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ） 在１ ２ ％ 的分离胶上进行 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ ，
２ ０ ０ ７ ， ２ ７ （ ４ ）
孙丽娟 等： 酪氨酸磷酸化蛋白在体外获能豚鼠精子上的分布与表达
９ １
表１ 获能过程中酪氨酸磷酸化精子比例的变化（ ％） Ｔ ａ ｂ ｌ ｅ １ Ｃ ｈ ａ ｎ ｇ ｅ ｓ ｏ ｆ ｒ ａ ｔ ｉ ｏｏ ｆ ｔ ｙ ｒ ｏ ｓ ｉ ｎ ｅｐ ｈ ｏ ｓ ｐ ｈ ｏ ｒ ｙ ｌ ａ ｔ ｅ ｄ ｓ ｐ ｅ ｒ ｍａ ｔ ｏ ｚ ｏ ａｄ ｕ ｒ ｉ ｎ ｇｃ ａ ｐ ａ ｃ ｉ ｔ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ（ ％）
［ ７ ］
，２ ４ ｈ内荧光显微镜
下观察（× １ ０ ０ ０ ） ， 共计数 １ ０ ０个精子。 Ｃ Ｔ Ｃ染色判断 如下： “ Ｆ ” 型为未获能精子， 其顶体帽完整， 整个顶体布 满强黄绿色荧光； “ Ｂ ” 型为已获能精子， 其特点是顶体 依然存在， 但在顶体帽后区出现一条无或暗淡的荧光 区带； “ Ａ Ｒ ” 型为完成顶体反应精子， 顶体帽缺失， 整个 精子头部显示 淡 绿 色 或 无 荧 光。根 据 精 子 与 金 霉 素 （ Ｃ Ｔ Ｃ ）荧光结合类型为指标评价精子获能情况。精子
２ 结 果
２ ． １ 精子获能的结果 Ｃ Ｔ Ｃ染色结果显示， ７ ｈ 为精子获能的最佳时期（ 图 １ ） ， 因此， 本试验中从 ０ ｈ起至 ７ ｈ ， 选取 ０ ｈ ， ０ ． ５ ｈ ， １ ｈ ， ３ ｈ ， ５ ｈ ， ７ ｈ 六个时间段进行免疫荧光试验。
活力 ＞ ８ ０ ％； 体外获能培养 ７ ｈ ， 精子活力 ＞ ８ ０ ％。 １ ． ４ 获能的评价 采用金霉素（ Ｃ Ｔ Ｃ ） 染色法
０ ｈ ０ ． ５ ｈ １ ｈ － ５ ８± ２ ． １ ６ ３ ｈ － ７ ２± ４ ． ５ ５ ５ ｈ － ８ ８± ４ ． ５ ５ ７ ｈ － ９ ２± ５ ． １ ０
３ ０ ． ６ ７± 精子头部 ４± ３ ． ５ ６ １ ． ２ ５ ３ ３ ． ３ ３± 头部 ＋ ５± ３ ． ２ ７ ３ ． ８ ６ 鞭毛
６ 度＞ １ ０ ０× １ ０ ｃ ｅ ｌ ｌ ｓ ／ ｍ ｌ ， 精子按照目测评定法测得精子 ［ ６ ］
胶上的蛋白在 ７ ５ Ｖ ， ４ ℃下 ２ ． ５ ｈ转至 Ｐ Ｖ Ｄ Ｆ膜上， 膜用 ５ ％Ｂ Ｓ Ａ／ Ｐ Ｂ Ｓ ０ ． １ ％Ｔ ｗ ｅ ｅ ｎ 常温封闭 １ ｈ ， 一抗（ 抗磷酸酪 Ｐ Ｂ Ｓ ０ ． １ ％Ｔ ｗ ｅ ｅ ｎ ２ ０＝ １ ∶ ２ ０ ０ ０ ）４ ℃孵 氨酸单克隆抗体： 育过夜， 二抗（ 辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠 Ｉ ｇ Ｇ ： Ｐ Ｂ Ｓ ）孵 育 １ ｈ 。根 据 说 明 用 ０ ． １ ％Ｔ ｗ ｅ ｅ ｎ ２ ０ ＝１∶ １ ０ ０ ０ Ｓ ｕ ｒ ｐ ｅ ｒ Ｅ Ｃ ＬＰ ｌ ｕ ｓ 超 敏 发 光 试 剂 盒 检 测 特 异 蛋 白 条 带。 仅用二抗孵育作为阴性对照。 １ ． ７ 统计处理 用 Ｓ Ｐ Ｓ Ｓ 软件处理进行数据处理， 结果用平均数 ± 标准 差 （ 珋 ｘ±ｓ ） ， 用 Ｋ ｏ ｄ ａｌ ｏ ｔ ｔ ｉ ｎ ｇ图像条带灰度。
２ ． ３ 获能过程中蛋白酪氨酸磷酸化水平的变化 豚鼠精子体外获能培养 ０至 ０ ． ５ ｈ ， Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎｂ ｌ ｏ ｔ 仅 检测到一种分子量为 ４ ０ ｋ Ｄ ａ 的酪氨酸磷酸化蛋白（ 图 ３ ） ， 且这种蛋白的酪氨酸磷酸化水平随着获能的进行 呈递增趋势。体外培养 １ ｈ ， 检测到另一种 ８ ０ ｋ Ｄ ａ 的酪 氨酸磷酸化蛋白（ 图３ ） ， 此蛋白酪氨酸磷酸化水平在体 ｈ 达到最高峰， 后随获能的进行呈递减趋 外获能培养 ３ 势。体外培养 ３ ｈ后共检测到 ４ ０ ｋ Ｄ ａ、 ４ ５ ｋ Ｄ ａ 和８ ０ ｋ Ｄ ａ 三种蛋白（ 图３ ） ， 其中 ４ ５ ｋ Ｄ ａ 的蛋白酪氨酸磷酸化水 平自 ３ ｈ 后呈递增趋势。
图１ Ｔ Ａ Ｌ Ｐ培养液中发生顶体反应的精子百分比 Ｆ ｉ ｇ ． １ Ｔ ｈ ｅｐ ｅ ｒ ｃ ｅ ｎ ｔ ａ ｇ ｅｏ ｆ ａ ｃ ｒ ｏ ｓ ｏ ｍｅ ｒ ｅ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎｓ ｐ ｅ ｒ ｍａ ｔ ｏ ｚ ｏ ａｉ ｎＴ Ａ Ｌ Ｐ
２ ． ２ 获能过程中酪氨酸磷酸化的蛋白分布 间接免疫荧光法检测发现， 未经获能液孵育的豚 鼠精子中有 ３ １ ％ 在头部呈现酪氨酸磷酸化位点， 但仅 见微弱的荧光， ５ ％的这类精子在精子鞭毛区发现磷酸 化位点。获能液孵育 ３ ０ ｍ ｉ ｎ后， 精子鞭毛中段开始有 可见的酪氨酸磷酸化位点分布， 且随着时间推移， 蛋白 酪氨酸磷酸化位点向鞭毛主段延伸， 至获能液中培养 ３ ｈ ， ７ ２ ％ 的精子在整个精子头部、 鞭毛主段和中段都发 ， ａ ～ｄ ； 表１ ） 。豚鼠精子体外培 生酪氨酸磷酸化（ 图２ 养７ ｈ ， 发生蛋白酪氨酸磷酸化的精子增加到 ９ ２ ％， 通过 抗磷酸酪氨酸单克隆抗体和 Ｒ ｈ ｏ ｄ ａ ｍ ｉ ｎ ｅ 标记的羊抗鼠 Ｉ ｇ Ｇ检测发现， 精子头部和鞭毛区的荧光明显（ 表１ ； 图 ２ ， ｆ ） 。
［ １ ］
得很大进展， 但目前关于（ 体外） 获能过程中， 酪氨酸磷 酸化蛋白在精子上的分布及酪氨酸磷酸化水平的变化 规律少有报道， 而对豚鼠精子蛋白酪氨酸磷酸化的研 究仍为空白。本实验研究豚鼠精子获能前后酪氨酸磷 酸化蛋白在精子上的分布特征， 为探讨豚鼠精子获能 的分子机理奠定基础。
。真核细胞中， 蛋白的磷酸化 ／ 去磷酸化是调节蛋
摘要 为研究豚鼠精子获能过程中蛋白酪氨酸磷酸化的变化规律， 将豚鼠精子悬浮于改良的 Ｔ Ａ Ｌ Ｐ获能培养基中， 在５ ％Ｃ Ｏ 孵箱 ３ ７℃ 培养， 以精子与金霉素（ Ｃ Ｔ Ｃ ）荧光结合类型为指标评 ２ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎｂ ｌ ｏ ｔ 方法检测酪氨酸磷酸化的蛋白在精子上的分布 价精子获能状态， 用免疫荧光技术和 Ｗｅ 以及酪氨酸磷酸化水平的变化。结果显示， 随着获能的进行， 发生蛋白酪氨酸磷酸化的精子占总 精子的百分比增加， 由未获能前的 ３ ６ ％增至获能 ７ ｈ时的 ９ ２ ％。酪氨酸磷酸化的蛋白分布变广， 由精子头部扩增至精子头部、 鞭毛主段和中段。另外， 有８ ０ ， ４ ５ ， ４ ０ ｋ Ｄ ａ 的三种蛋白发生酪氨酸磷 酸化， 其中 ４ ０ ｋ Ｄ ａ 的蛋白酪氨酸磷酸化水平自精子体外培养后呈递增趋势， ４ ５ ｋ Ｄ ａ 的蛋白酪氨酸 磷酸化自培养 ３ ｈ 后发现并呈递增趋势， 而８ ０ ｋ Ｄ ａ 的蛋白酪氨酸磷酸化水平在精子培养 ３ ｈ时最 高， 后呈递减趋势。 关键词 精子获能 酪氨酸磷酸化 豚鼠 中图分类号 Ｑ ２ ５
精子获能是精卵受精前， 精子在雌性生殖道内经 过一段时间后成熟的过程， 只有获能的精子才具有受 精能力。精子在获能过程中发生一系列变化， 包括精 子质膜流动性增加， 胆固醇外流， 离子流动， 酪氨酸磷 酸化蛋白增多， 精子超激活运动以及顶体反应的诱导 等。其中 蛋 白 酪 氨 酸 磷 酸 化 是 翻 译 后 加 工 修 饰 过 程
９ ０
中国生物工程杂志 Ｃ ｈ ｉ ｎ ａＢ ｉ ｏ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ
Ｖ ｏ ｌ ． ２ ７Ｎ ｏ ． ４２ ０ ０ ７
海申能博彩生物科技， Ｋ ３ ０ ０ ０ ） ， 辣根过氧化物酶标记的 山羊 抗 小 鼠 Ｉ ｇ Ｇ（ 南 京 大 治 生 物 技 术 有 限 公 司， Ｄ Ｚ ０ ０ ４ ０ ） ， 其余生化试剂均用分析纯。豚鼠精子体外获 能培养基采用改良的 Ｔ ｙ ｒ ｏ ｄ ｅ获能培养基 （ Ｔ Ａ Ｌ Ｐ ） ， ｐ Ｈ ７ ． ８ ， 临用前加 ３ｍ ｇ ／ ｍ ｌ Ｂ Ｓ Ａ 。主要仪器有二氧化碳 培养箱， 倒 置 显 微 镜， 荧光正置显微镜（ Ａ ｘ ｉ ｏＩ ｍ ａ ｇ ｅ ｒ Ａ Ｌ ） 等。 １ ． ３ 豚鼠精子的采集 打开豚鼠腹腔， 暴露两侧输精管和附睾， 在洁净定 性滤纸上剔除其周围结缔组织和脂肪后， 使用解剖针 穿刺附睾尾部， 镊子挑取精子入培养基中， 在５ ％Ｃ Ｏ ２ 培养箱 ３ ７ ℃培养 ７ ｈ 。采用血球计数法测得豚鼠精子密
精子上存在分子量为 ９ ５ｋ Ｄ ａ 的蛋白发生酪氨酸磷酸化 以来， 有关精子获能时蛋白酪氨酸磷酸化的研究已取
收稿日期： ２ ０ ０ ６ １ １ ２ ０ 修回日期： ２ ０ ０ ７ ０ １ ２ ６ ３ ０ ４ ７ １ ２ ４ ３ ） 国家自然科学基金资助项目（ 电子信箱： ｋ ｌ ｊ １ ５ １ １ ２ ０ ３ ＠１ ６ ３ ． ｃ ｏ ｍ 通讯作者，
白生物活性最普遍的方式之一， 通过它能调节细胞的 许多生理活动。成熟精子是高度分化的特异细胞， 不 能转录翻译合成新的蛋白质。因此， 蛋白酪氨酸磷酸 化对精子运动力的维持、 精子获能、 超激活运动以及顶 体反应等生理过程十分重要， 这在小鼠、 人和其他许多
２～ ４ ］ 物种上都有报道 ［ 。 ５ ］ 自 Ｌ ｅ ｙ ｔ ｏ ｎ 等［ 首次用磷酸化特异性抗体证明小鼠
１ 材料和方法
１ ． １ 试验动物 种用公豚鼠（ 体重 ７ ２ ０～ ７ ５ ０ ｇ ） ， 购自南京江宁区青 龙山动物繁殖场。 １ ． ２ 试剂与仪器 金 霉 素 （ 南 京 大 治 生 物 技 术 有 限 公 司 分 装， Ａ １ ９ ４ ６ ） ，荧 光 防 淬 灭 剂 （Ｖ Ｅ Ｃ Ｔ Ａ Ｓ Ｈ Ｉ Ｅ Ｌ Ｄ ，Ｖ ｅ ｃ ｔ ｏ ｒ ，Ｉ ｎ ｃ ． ） ， 抗磷酸酪氨酸单克隆抗体（ Ｃ ｅ ｌ ｌ Ｌ ａ ｂ ｏ ｒ ａ ｔ ｏ ｒ ｉ ｅ ｓ Ｓ ｉ ｇ ｎ ａ ｌ ｉ ｎ ｇ ， ＃９ ４ １ １ ） ，Ｒ ｈ ｏ ｄ ａ ｍ ｉ ｎ ｅ标 记 的 羊 抗 鼠 Ｉ ｇ Ｇ （ Ｃ ａ ｌ ｂ ｉ ｏ ｃ ｈ ｅ ｍ ， ＃ ４ ０ １ ２ １ ７ ） ， Ｓ ｕ ｒ ｐ ｅ ｒ Ｅ Ｃ ＬＰ ｌ ｕ ｓ 超敏发光液（ 普 利莱基 因 技 术 有 限 公 司， ＃ Ｐ １ ０ １ ０ａ ｎ ｄ＃ Ｐ １ ０ ２ ０ ） ， 预染 ｍ ａ ｒ ｋ ｅ ｒ （ Ｆ ｅ ｒ ｍ ｅ ｎ ｔ ａ ｓ ， ＃ Ｓ Ｍ ４ ４ １ ） ， Ｂ Ｃ Ａ蛋白定量检测 ｋ ｉ ｔ （ 上