微生物工程 复习要点版

微生物工程
第一章微生物工程概论
1发酵的概念：利用微生物在有氧或无氧条件下的生命活动来制备微生物菌体或代谢产物的过程。

2微生物工程的组成部分
主要为六个部分1培养基的制备2无菌空气的制备3菌种和种子的扩大培养4发酵的培养和控制5发酵产品的加工处理过程6微生物过程废弃物的处理
3初级代谢产物——是微生物代谢产生的，并是微生物自身生长繁殖所必需的代谢产物，它们的生源和生物合成过程在各种微生物体内基本相同。

4次级代谢产物——是微生物在生长的稳定器合成的具有特定性生理功能的代谢产物，与菌体的生长繁殖无明确关系，它们的生物合成具有特异性，它基本上由微生物代谢产生的中间产物和初级代谢产物合成的。

5微生物微生物发酵产物的类型：菌体产品；微生物生物转化产品；微生物特殊机能的利用第二章工业微生物
1工业生产对菌种的要求：工业菌种的基本特性
1传性能稳定，有较高的生长速率
2在发酵过程中不产生或少产生与目标产物性质相近的副产物
3对原料要求不高
4易于控制培养条件
5非噬菌体溶源菌，具有抗噬菌体感染的能力
6不是病原菌，不产生任何有害的物质
2组成酶：酶的合成随菌体形成和合成，是细胞固有的酶，在菌体内含量相对稳定
诱导酶：酶的合成与环境中某个物质有关，若环境中缺少这个物质，则酶合成停止。

诱导剂：有促使酶合成的物质，一般地，最有效的诱导剂是底物结构类似物
3分解代谢阻遏现象：当同时存在两种可利用的C源或N源时，微生物优先利用的C源和N源会阻遏另外的利用慢的底物有关酶的合成。

（重点：葡萄糖效应）
4反馈抑制——末端产物过量时会抑制该反应途径中初期步骤的酶的活性。

5工业上进行过量生产的方法：
（一）遗传学方法：
1,、营养缺陷型突变型的应用：使菌种发生基因突变，致使合成途径中某一步骤发生缺失，从而丧失合成某一些物质的能力，必须在培养过程中外源补加该营养物质才能生长的突变株。

1）直线代谢途径中过量几类某一中间产物，途径中某一酶缺失导致累积中间产物。

2）分支途径上，某一中间产物或另一末端产物的过量生产。

图略
2、抗反馈控制突变株的应用：对反馈不敏感，对阻遏有抗性或两者都有的突变株。

1）添加末端产物结构类似物：不被菌体利用，但与末端产物一样可以干扰菌体正常代谢。

2）营养缺陷型菌株的回复突变：先利用诱变的方法，除去对末端产物反馈控制敏感的酶，使之成为缺陷型。

然后每次诱变处理，使该酶基因发生回复突变，回复突变的结果，仅仅使酶活性中心恢复而酶与末端产物的变构中心不能恢复。

3、组成型突变菌株的应用：超产突变株，采用添加和不添加的培养基交替培养的方法。

（二）生物化学的方法：1、添加前体物质，可绕过反馈控制点。

2、添加高效的诱导剂：往往是底物的结构类似物，不被酶利用，但可起相同的诱导作
用。

3、控制细胞膜的通透性：添加生物素青霉素等，使得细胞内的代谢物迅速渗透到胞外，降低代谢产物在胞内的含量，解除反馈控制。

第三章 培养基
1培养基是人工培制的供微生物生长，繁殖，代谢以产生人们所需产物的营养物质和原料。

2生理酸性物质和生理碱性物质指经过微生物生理作用后形成酸性\碱性的物质的无机氮源。

3配制培养基的原则：
1根据不同微生物的营养需要配置不同培养基
2注意各营养成分的浓度和配比
3调节合适的物理化学条件
4根据培养微生物的目的配制
5选用廉价易得原料
4培养基在生产用途上的分类：1孢子培养基：麸皮培养基，小米培养基，大米培养基 2种子培养基 3发酵培养基
第四章 灭菌技术
1常用的灭菌方法及原理：
（一）化学物质的灭菌，甲醛、苯酚、高锰酸钾
（二）辐射灭菌，常用紫外线，X 、Y 射线
（三）干热灭菌
（四）湿热灭菌
2对数残留定律：菌体某一时刻的死亡速率与当时残存的活菌数成正比
KN dt dw =- dt
dw ：菌的瞬时变化速率 K ：菌死亡反应速率
K 是判断微生物受热死亡难易程度的基本依据，它随菌种和灭菌程度而异。

在同一浓度下，k 值越小，表明微生物月耐热。

3为什么高温短时灭菌工艺比低温长时灭菌工艺效果好？
随着灭菌温度的提高，灭菌反应速率常数增加的倍数要大于营养成分被破坏的反应速率常数增加的倍数。

因此，在提高灭菌温度的条件下，灭菌时间缩短，虽然营养成分的损失速率会提高，但它提高的倍数小于菌种死亡提高是倍数，因此，营养成分的损失要比“低温长时”工艺少。

4影响培养基灭菌的因素
（1）杂菌的种类：种类细胞中的含水量
（2）灭菌温度和灭菌时间：采用高温短时灭菌法
（3）培养基的成分和物理状态：
PH ：6-8间，微生物最不易死亡
当PH<6时，H 易渗入细胞内改变细胞的生活状态
营养成分：油脂、糖、蛋白质类会增加微生物的耐热性
盐类色素等物质削弱细胞的耐热性
营养成分的颗粒状总量：
物质颗粒若小于1mm 时，=可忽略影响
（4）灭菌操作的影响
空气排出情况
搅拌
泡沫：泡沫过多会形成隔热层，影响灭菌质量（不能升温太高，加硝化剂）
5生产上培养基的灭菌方法
（一）分批灭菌（空罐灭菌）
1操作过程
（1）培养基的预热
目的：防止直接导入室温时由于蒸汽和培养基温度差过大而产生大量的冷凝水
防止直接导入蒸汽所造成的气速急剧上升而引起物料外溢
（2）培养基的灭菌
三路进气：进气口，排料口，取样口
四路出气：排气口，进料口，接种口，消除剂口
升温到120-130度，维持罐压100000Pa保持30分钟
2．分批灭菌的注意事项
1)各路蒸汽进口要通畅，防止短路逆流
2）排气量不要过大，以节约蒸汽量
3）灭菌降压结束时，应立即引入无菌空气保压口，通入无菌空气，再关闭其他两个进气口4）在引入无菌空气前，罐内压力必须低于过滤压力，否则培养基会倒流入过滤器
3．分批灭菌的特点
优点:效果好，操作简单，不需要其他设备，规模可大可小，所有发酵过程都能使用
缺点：加热和冷却时间较长，延长了发酵前的准备时间，营养成分损失大，发酵罐的利用率低
分批灭菌可用于极易发泡或粘度很大，难以采用连续灭菌的培养基灭菌
（二）连续灭菌的工艺流程
6空气净化方法
1加热灭菌：利用压缩空气产生的热量灭菌
采风-----粗过滤器-----空压机压缩-----空气储罐------空气冷却-------分过滤器----空气温度升
2辐射灭菌：局部空间空气灭菌
3静电除菌
4介质过虑灭菌
7深层过滤除菌的原理：惯性冲击阻滞作用；拦截滞留作用；布朗扩散作用；重力沉降作用；静电吸附作用
8空气过滤除菌流程：吸入空气→粗过滤器→空压机→空气贮罐→一级空气冷却（用自来水）→旋风分离器（一级分离）（去除较大的颗粒液滴）→二级空气冷却（9°冷冻机）→丝网除沫器（二级分离）（去除较小的颗粒）→加热器→总过滤器→分过滤器→发酵罐（或种子罐）第五章种子制备
1种子扩大培养的目的：为每次发酵罐投料提供一定数量代谢旺盛的种子，缩短发酵周期。

2.接种量：指移入的种子液体积与接种后培养液的体积的比。

3影响种子质量的因素和控制
1.培养基（种子培养基）
2培养条件
3.种龄和接种量
4种子异常的分析：
1.菌种生长发育缓慢或过快：（1）孢子质量（2）通气情况（3）培养基的质量
2.菌丝结团——与通气搅拌有关
3.菌丝粘壁——搅拌效果不好造成菌丝粘附于罐壁，培养液中菌丝浓度下降的现象
4.菌体代谢异常——生化指标异常
第六章微生物发酵培养
1生长关联型：菌体生长，基质消耗和产物合成大体呈正比关系
产品：有C源直接氧化的初级代谢产物，如：乙醇、氨基酸、核苷酸等
2非生长关联型：产物合成与C源利用无准量关系，产物合成在菌体停止生长及底物消耗完毕后才开始，物的形成于细胞浓度有关
产品：次级代谢产物
3 Monod方程表示了菌种生长于基质浓度的关系，当基质浓度低时，随基质浓度增加，菌体生长速率加快，但基质浓度达到一定程度后，基质浓度的增加对菌体生长的影响非常小，甚至出现抑制现象
“高浓度基质对生长的抑制”：（1）高浓度基质使培养基渗透压升高
（2）高浓度基质使生长过快，发酵热大，使细胞热致死
4发酵培养方式：
一、分批培养
非稳态培养，所有工艺产数随时间而变化
二。

补料分批培养（半连续培养）
是指在分批培养中，间歇地或连续补加一种或多种成分的新鲜培养基的培养方法。

是目前最好的培养方法。

1.作用：（1）可以控制抑制性底物的浓度（a，控制前体物质的成产合成；b，使C、源一
直处于低浓度状态）
（2）可以解除或削弱分解代谢阻遏现象
2.补料方式与控制：
2.1（1）不连续流加：通过监测物质的浓度变化而确定加入补料的方式
（2）连续流加：a恒定流率操作；b指数流率操作（考虑菌体对数生长期的因素） c 恒定底物浓度操作（使某一底物浓度维持在一定范围）
2.2：控制方法
（1）无反馈控制：a 恒定流率操作 b 指数流率操作
（2）反馈控制：a 直接方式：直接以某限制性底物浓度为反馈常数
b 间接方式：以溶解氧浓度、PH、呼吸商、排气中的CO2做为反馈参数
3.适用范围
（1）、高菌体浓度培养
（2）、存在高浓度底物抑制的系统
（3）、存在葡萄糖效应的系统（存在分解代谢阻遏现象）
（4）、希望延长反映时间或补加损失水分的系统
三、连续培养
当微生物培养到对数生长期时，在发酵罐中一方面以一定速率连续不断的流加新鲜培养基，另一方面又以相同的速率连续不断的将发酵液排出，使发酵罐中的微生物生长和代谢活动始终保持在旺盛的稳定状态，而PH、温度、营养成分浓度、溶解氧等保持一定。

2.连续培养在工业上的应用
①酒精、啤酒、醋酸等一次代谢产物
②酵母。

细菌等菌体产品（单细胞蛋白）
③污水生化处理
3.连续培养目前存在的问题
①无菌状态的保持
②菌种的变异和退化
③均匀性和稳定性
5影响发酵过程的主要因素
1生物热——分解代谢释放出来的能量一部分用于生物合成，一部分形成ATP，其余部分释放出来，这部分热称为生物热
特点：具有剧烈的时间性
2 Q发酵=Q生物+Q搅拌-Q蒸发-Q辐射-Q显
3 PH值对发酵的影响
①影响酶的活性
②影响微生物细胞膜所带的电荷状态，改变细胞的通透性
③影响某些组分的解离
④影响代谢产物的质量和比例
4 PH的控制
①配制合适的培养基，使培养基具有一定的PH缓冲能力
②直接加酸或碱
③添加营养基质进行控制
5摄氧率（耗氧速率）：单位体积培养液单位时间内消耗的氧量
6吸强度：单位质量的干菌体单位时间内消耗的氧量 Y=Q（氧气）·X
临界氧浓度：指不影响菌体呼吸的最低氧浓度（为不影响微生物的生长，要求C溶氧>C临界）
7影响微生物需氧量的因素
①微生物的种类及生长阶段
②培养基的成分及培养条件
③培养基中溶解氧的浓度
④CO2
8影响氧传递的因素
9改善溶氧不足的措施：
（1）提高溶氧能力：提高Kla ：a提高搅拌转速b提高空气流速
（2）限制需氧：最适菌体浓度，通过菌体的生长来限制需氧，使得N与R达到系统平衡。

（3）改善供养条件新措施：a氧载体：指不溶于培养基但是能够吸附或包裹溶解氧的物质（增加氧和液体的接触面积）
b在菌体内导入与氧有亲和力的血红蛋白
10泡沫对发酵的影响：
降低发酵罐的装料系数
增加了菌群的非均一性
增加了染菌的机会
大量泡沫逸液，造成损失
为了消泡而加入消泡剂，增加下游加工的困难。

11泡沫的控制：
（1）控制泡沫的途径：
a．调整培养基的成分b机械消泡或消泡剂消泡
C筛选不产生液态泡沫的菌种。

（2）工业上泡沫的控制：
机械泡沫：设置泡沫浆
化学消泡：天然油脂类聚醚类高级醇类高级醇类硅树脂类
12发酵异常：
1营养物质消耗
2 PH过高或过低
3溶氧水平：a。

降低太快生长不能回升----污染好气性细菌b：回升太快---污染噬菌体
4 泡沫
5 菌体浓度过高或过低
13染菌的检查与判断
1 镜检：涂片染色镜检
2平板划线或斜面培养检查
3酚红肉汤培养检察
4通过发酵参数的异常变化
14杂菌污染的防治：
1 种子带菌及其防治：
种子染菌：种子污染了芽孢杆菌酵母菌葡萄菌等主要原因是无菌操作不严格
防治措施：
（1）培养基及设备灭菌要彻底
（2）注意接种的无菌要求
（3）加强菌种保藏管理
2空气带菌及其防治措施：
（1）提高风口，加强前过滤除油除水过程
（2）定期检查，定期灭菌，设备及时维护
（3）加强厂区环境，清洁卫生
3灭菌不彻底造成染菌及其防治：
（1）保证蒸汽质量应达到相应温度和压力要求
（2）严格操作
（3）设备加工应良好，避免存在死角或短路
4 设备渗透造成的染菌及其防治：
（1）要求设备加工良好，应采取一些防治措施保护金属设备
（2）定期检查
5操作不当引起的染菌及其防治：
（1）无菌操作不严
（2）发酵各个工序的衔接应严格操作与管理
15噬菌体污染的原因：
a菌种带有噬菌体或是溶源性细菌
b厂区周边环境噬菌体含量高容易通过空气过滤系统或设备渗漏等进入发酵罐
16噬菌体污染的防治：
a保证菌种本身不带噬菌体溶源性排除实验
b严格控制污菌的排放
c净化环境做好厂区清洁工作
a．药物防治：阻止噬菌体吸附（EDTA）阻止噬菌体复制（抗生素）
17噬菌体污染后的处理：
a发酵液灭菌后放掉，严禁发酵液任意流失
b全部停产，对环境进行全面清洁和消毒
c更换生产菌种，筛选抗噬菌体的生产菌。