从粪便中提取DNA样本的方法和结直肠癌相关基因的甲基化检测方法[

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011493703.4
(22)申请日 2020.12.17
(66)本国优先权数据
201911314364.6 2019.12.19 CN
(71)申请人 武汉艾米森生命科技有限公司
地址 430000 湖北省武汉市东湖新技术开
发区高新大道818号医疗器械园B10栋
1楼
(72)发明人 张良禄　吴志诚　董兰兰　甘甜　
陈玉珠　李婷婷　
(74)专利代理机构 北京超凡宏宇专利代理事务
所(特殊普通合伙) 11463
代理人 周文波
(51)Int.Cl.
C12Q 1/6806(2018.01)
C12Q 1/6886(2018.01)C12N 15/10(2006.01)
(54)发明名称
从粪便中提取DNA样本的方法和结直肠癌相
关基因的甲基化检测方法
(57)摘要
本发明公开了从粪便中提取DNA样本的方法
和结直肠癌相关基因的甲基化检测方法，涉及基
因检测技术领域。

该方法包括：离心粪便稀释液
样本，得到第一上清液；粪便稀释液中的粪便取
自于需要进行结直肠癌或结直肠癌前病变检测
的主体；离心时，单个离心管中的粪便稀释液样
本的体积不高于2mL。

该提取方法操作简单，粪便
用量少，不需要使用大型的离心设备即可提取，
提取效果好，所提取的DNA样本用于后续甲基化
检测时具有较好的灵敏度和特异性。

权利要求书2页 说明书19页序列表2页 附图4页CN 112553302 A 2021.03.26
C N 112553302
A
1.一种从粪便中提取DNA样本的方法，所述DNA样本适用于结直肠癌或结直肠癌前病变相关基因的甲基化检测，其特征在于，其包括：
预处理步骤：离心粪便稀释液样本，得到第一上清液；所述粪便稀释液样本中的粪便取自于需要结直肠癌检测的主体；
离心时，单个离心管中的粪便稀释液样本的体积不高于2mL，优选为0.5‑1.8mL，进一步优选为1.8mL。

2.根据权利要求1所述的从粪便中提取DNA样本的方法，其特征在于，离心的参数设置如下：
转速10000‑13000rpm，时间10s‑5min。

3.根据权利要求1所述的从粪便中提取DNA样本的方法，其特征在于，所述方法还包括：
吸附步骤：将吸附剂与所述第一上清液混匀以去除所述上清液中的杂质，得到第一混合液，对所述第一混合液离心，得到第二上清液；
优选地，所述吸附剂选自交联聚乙烯吡咯烷酮；
优选地，所述交联聚乙烯吡咯烷酮为交联聚乙烯吡咯烷酮粉末或交联聚乙烯吡咯烷酮片剂。

4.根据权利要求3所述的从粪便中提取DNA样本的方法，其特征在于，
所述吸附剂与所述第一上清液的质量体积比为1:(2‑4)，优选为1:4。

5.根据权利要求4所述的从粪便中提取DNA样本的方法，其特征在于，所述方法还包括：
核酸变性步骤：对第二上清液进行变性处理以使DNA双链结构形成单链结构；
优选地，所述变性处理的温度85‑95℃，时间为5‑15min，进一步优选为10min。

6.根据权利要求5所述的从粪便中提取DNA样本的方法，其特征在于，所述方法还包括：
捕获步骤：往所述第二上清液中加入捕获剂，得到第二混合液；其中，所述捕获剂含有偶联有探针的磁珠，所述探针与待提取基因序列的某一段互补。

7.根据权利要求6所述的从粪便中提取DNA样本的方法，其特征在于，
所述捕获剂通过如下方法制得：
将含有磁珠的磁珠液与所述探针的探针液混合，得到磁珠‑探针混合液，其体积记为V1，混匀磁珠‑探针混合液以使所述探针与磁珠偶联，再将所述磁珠‑探针混合液置于磁力架上进行吸附，弃上清后，加入体积为V1的缓冲液重悬磁珠，即得所述捕获剂；
其中，所述磁珠液中的磁珠的浓度为9‑11mg/mL，所述探针液中的所述探针的浓度为9‑11uM；所述磁珠液的用量满足如下公式：V＝N*M；公式中，V代表所述磁珠液的体积，N代表待提取基因的种类数量，M＝3‑7，单位为μL，优选为M＝5；
优选地，所述磁珠液与所述探针液的体积比为1:(1‑1.5)，优选为1:1；
优选地，所述磁珠上标记有链霉亲和素，所述探针标记有生物素；
优选地，所述缓冲液含有：200mmol/LTris·HCl和100mmol/LNaCl。

8.根据权利要求6或7所述的从粪便中提取DNA样本的方法，其特征在于，所述方法还包括：
孵育步骤：将所述第二混合液静置孵育40‑90min，优选为40min。

9.一种结直肠癌相关基因的甲基化检测方法，该方法以非疾病的诊断为目的，其特征在于，其包括：采用权利要求1‑8任一项所述的方法提取得到适用于结直肠癌或结直肠癌前
病变相关基因的甲基化检测的DNA样本。

10.根据权利要求9所述的甲基化检测方法，其特征在于，所述结直肠癌相关基因选自：SDC2、TFPI2、VIM、NDRG4、SFRP1、SFRP2、BMP3、MGMT、SPG20和SEPT9。

从粪便中提取DNA样本的方法和结直肠癌相关基因的甲基化
检测方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求申请日为2019年12月19日，申请号为201911314364.6，发明名称为“从粪便中提取DNA样本的方法和结直肠癌相关基因的甲基化检测方法”的中国发明专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

技术领域
[0003]本发明涉及基因检测技术领域，具体而言，涉及从粪便中提取DNA样本的方法和结直肠癌相关基因的甲基化检测方法。

背景技术
[0004]结直肠癌是我国乃至世界范围内最常见的恶性肿瘤，我国每年新增发病人数约40万，其发病率居所有恶性肿瘤的第三位。

早期结直肠癌患者手术5年生存率可高达90％以上，中、晚期患者5年生存率仅10％左右，且大多数结直肠肿瘤生长缓慢、保持沉默或无症状，直到它们达到了一定的大小或发展阶段。

因此，结直肠癌是可以通过筛查进行干预的理想靶标。

[0005]肠镜检查是结直肠癌检测和确诊的金标准，但因其需要复杂的肠道准备过程、具有一定的侵入性且需要专业的技术人员，因此在一般人群中的普及率很低。

无创检测方法如粪便潜血检查(FOBT)和粪便免疫化学检查(FIT)的灵敏度不高，尤其是在检测I期结直肠癌和进展期腺瘤方面灵敏性较低。

甲基化是一种表观遗传修饰，其异常变化可引起DNA构象及DNA与蛋白质相互作用方式等发生改变，从而控制基因表达。

DNA甲基化在基因表达调控、细胞增殖分化、发育和基因印记等方面起着重要作用，与肿瘤的发生与发展有密切关系。

粪便中含有一定量的肠道脱落细胞，因此可通过检测这些脱落细胞中的某些DNA靶标继而对肠道的健康状况进行评估。

越来越多的研究指出，粪便DNA甲基化检测在结直肠癌无创筛查方面显示出很大的优势，其灵敏性和特异性均优于血液甲基化检测和粪便潜血检测。

2014年，FDA批准了第一款结直肠癌粪便DNA检测试剂盒Cologuard，该试剂盒可以同时检测粪便中的血红素、KRAS基因突变及另外两个基因的甲基化，其对结直肠癌的检测灵敏性和特异性分别为92％和87％。

[0006]良好的粪便DNA检测效果依赖于上游的粪便处理技术，包括粪便保存技术和粪便DNA提取技术等。

例如，用于保存粪便DNA的试剂应尽可能保持粪便中人类基因组的稳定性，同时不受其他基因组的干扰，粪便DNA提取时应尽可能地获取到为数不多的目标DNA。

现有的粪便DNA提取技术种类繁多，按照提取基因组的范围来分，可分为提取全部DNA的方法和靶向富集提取特定DNA的方法；按照提取试剂的种类，可分为机械法、磁珠法和化学法等。

应当指出的是，不同的提取方法适用于不同的应用场景，产生的检测效果也不同。

[0007]粪便基质成分非常复杂，其中含有种类众多的细菌基因组DNA、植物来源DNA和动物来源DNA，肠道或其他消化道位置的脱落细胞含量相对较少，肠道脱落细胞DNA只占从粪
便中回收到的总DNA的0.1％到0.01％，而人类DNA本身是高度异源的，肠道肿瘤细胞又只占肠道脱落细胞的1％，对于癌症早期的人体，还不到1％。

不仅如此，粪便中还含有多聚糖、胆盐、腐殖质、胆酸等PCR抑制物，此时如果采用从粪便中提取全部基因组的做法(如现有技术CN201611113440)，庞大的基因背景和PCR抑制物将非常不利于肿瘤脱落细胞DNA的检测；现有技术CN201710332851使用探针富集人类基因组，虽然在一定程度上特异性地区分了人类基因组和其他基因组，但是仍未实现对人类特定基因的富集，且某些肿瘤来源的DNA片段化较严重，不能通过对人类基因组的整体富集实现对特定肿瘤基因的富集；另外，现有技术中还存在使用粪便量较多、要用到有机溶剂等问题，如CN201811636712，虽然使用较大的粪便量可能会增加目的基因的提取量，但这也不可避免地增加了步骤的繁琐性和成本：需要使用到特定的试剂耗材(如5mL、15mL和50mL离心管)和设备(大型离心机等)。

这增加了复杂度，严重降低检测通量、增加检测时间和成本，对于产品的使用推广造成致命限制。

然而，在同样的实验条件下减少粪便样本量势必会降低目标DNA的量，增加检测难度，因此现有技术在检测工艺和检测效果之间做取舍：即选择较大粪便稀释液样本体积提取，以保证检测效果。

[0008]综上，目前尚缺少能有效对靶基因进行富集、操作简单、对结直肠癌及其他消化道肿瘤检测灵敏性和特异性优异的粪便DNA提取方法。

[0009]鉴于此，特提出本发明。

发明内容
[0010]本发明的目的在于提供从粪便中提取DNA样本的方法和结直肠癌相关基因的甲基化检测方法。

该提取方法操作简单，不需要使用大型的离心设备即可提取，提取成本低；所提取的DNA样本用于后续检测中具有较好的灵敏度和特异性，提取效果好。

[0011]本发明是这样实现的：
[0012]第一方面，本发明实施例提供一种从粪便中提取DNA样本的方法，所述DNA样本适用于结直肠癌相关基因的甲基化检测，其包括：
[0013]预处理步骤：离心粪便稀释液样本，得到第一上清液；所述粪便稀释液中的粪便取自于需要进行结直肠癌或结直肠癌前病变检测的主体；
[0014]离心时，单个离心管中的粪便稀释液样本的体积不高于2mL，优选为0.5‑1.8mL，进一步优选为1.8mL；
[0015]所述样本稀释液包含100‑500mmol/L EDTA、50‑300mmol/L Tris·HCl和50‑200mmol/L NaCl；所述粪便稀释液样本由粪便和粪便保存液按照质量体积比为1:(3‑5)的比例(1g粪便对应使用3‑5ml粪便保存液)混合而成，优选为1:3。

[0016]现有技术的粪便DNA提取过程，通常都使用5mL、15mL或25mL规格的离心管稀释样本进行离心预处理，进而需要使用大型的离心设备。

因此具有以下弊端：(1)针对大体积类型样本，大型的离心设备离心力较低，单次离心时间长；(2)离心过程中需要配平，如果不能较好地配平，还容易出现机器故障；(3)使用大型离心设备时每次离心管数较少，离心通量低；(4)预处理过程通常需要多次离心，操作复杂，人力成本及设备成本高。

而本发明提供的方法在提取过程中，控制粪便稀释液样本体积不高于2mL，进而可以选用2mL和1.5mL规格的离心管进行离心，进而避免了使用大型的离心设备，有利于加快提取过程，提高提取过程的
便捷性，虽然相较于现有的提取方法粪便使用量减少，但同样可取得很好的提取效果，所提取的DNA样本可用于后续甲基化检测中，通过检测结果可以反应主体结直肠癌患病情况或结直肠癌前病变情况，具有较好的灵敏度和特异性。

[0017]在可选的实施方式中，离心的参数设置如下：
[0018]转速10000‑13000rpm、时间10s‑5min。

[0019]在可选的实施方式中，所述方法还包括：
[0020]吸附步骤：将吸附剂与所述第一上清液混匀以去除所述上清液中的杂质，得到第一混合液，对所述第一混合液离心，得到第二上清液。

[0021]粪便中杂质较多，通过吸附剂的使用，可以较好地去除其中的杂质，有利于后续步骤例如捕获步骤中探针对DNA样本的富集。

[0022]在可选的实施方式中，所述吸附剂选自交联聚乙烯吡咯烷酮。

[0023]在可选的实施方式中，所述交联聚乙烯吡咯烷酮为交联聚乙烯吡咯烷酮粉末或交联聚乙烯吡咯烷酮片剂。

[0024]在可选的实施方式中，所述吸附剂与所述第一上清液的质量体积比为1:(2‑4)；进一步优选为1:4。

[0025]本发明的研究发现，吸附剂的用量是影响提取效果的因素之一，优选地，控制吸附剂与所述第一上清液的质量体积比为1:(2‑4)，优选为1:4时，具有较好的提取效果。

[0026]在可选的实施方式中，所述方法还包括：
[0027]核酸变性步骤：将上述第二上清液进行变性处理以使DNA双链结构形成单链结构。

[0028]通过变性处理，使DNA双链结构形成单链结构，在后续捕获步骤有利于探针与目标DNA片段的结合，进而可以富集大量的单链DNA，使得提取效果更好，也有利于提高后续的甲基化检测效果。

[0029]在可选的实施方式中，所述变性处理的温度85‑95℃，时间为5‑15min，进一步优选为10min。

[0030]本发明的研究发现，变性处理的时间对后续的检测效果有影响，变性时间控制在5‑15min的范围内，具有较好的提取效果，优选为10min，提取效果更佳。

[0031]在可选的实施方式中，在核酸变性步骤中，在所述变性处理前，往所述第二上清液中加入异硫氰酸胍。

[0032]在可选的实施方式中，所述方法还包括：
[0033]捕获步骤：往所述第二上清液中加入捕获剂，得到第二混合液；其中，所述捕获剂含有偶联有探针的磁珠，所述探针与待提取的基因序列某一段互补。

[0034]需要说明的是，探针的序列与待检测的结直肠癌相关基因相关，本领域技术人员可以根据检测的需要，选择合适的结直肠癌相关基因，探针的序列根据所选择的结直肠癌相关基因设计即可。

[0035]需要说明的是，待检测的结直肠癌相关基因可以是一种，也可以是多种，本领域技术人员可以根据检测的需要，选择合适种类的结直肠癌相关基因。

[0036]需要说明的是，上述的待检测的结直肠癌甲基化相关基因包括但不限于SDC2、TFPI2、VIM、NDRG4、SFRP1、SFRP2、BMP3、MGMT、SPG20和SEPT9。

[0037]采用本发明提取的方法所提取的DNA样本适用于各种结直肠癌甲基化相关基因的
甲基化检测，包括但不限于SDC2、TFPI2、VIM、NDRG4、SFRP1、SFRP2、BMP3、MGMT、SPG20和SEPT9。

[0038]在可选的实施方式中，所述捕获剂通过如下方法制得：
[0039]将含有磁珠的磁珠液与所述探针的探针液混合，得到磁珠‑探针混合液，其体积记为V1，混匀磁珠‑探针混合液以使所述探针与磁珠偶联，再所述磁珠‑探针混合液置于磁力架上进行吸附，弃上清后，加入体积为V1的缓冲液重悬磁珠，即得所述捕获剂；所述缓冲液含有200mmol/L Tris·HCl和100mmol/L NaCl；
[0040]其中，所述磁珠液中的磁珠的浓度为9‑11mg/mL，所述探针液中的所述探针的浓度为9‑11uM；所述磁珠液的用量满足如下公式：V＝N*M；公式中，V代表所述磁珠液的体积，N代表待提取基因的种类数量，M＝3‑7，单位为μL，优选的，M＝5。

M含义可以理解为单个待提取基因的磁珠液的最佳使用体积。

[0041]例如，当待提取基因为一种的时候，磁珠液的用量即为1*M，也就说是，磁珠液的用量为3‑7μL，当待提取的基因为两种的时候，所述磁珠液的用量即为2*M，也就说是，磁珠液的用量为6‑14μL，以此类推。

即磁珠液的用量由待提取基因的种类数量确定。

[0042]本发明的研究发现，磁珠液的使用量对提取效果具有影响，当待提取基因为一种的时候，9‑11mg/mL的磁珠液的使用量控制在3‑7μL的范围下，具有较高的提取效果，尤其是在5μL的用量，可以取得更好的提取效果。

[0043]在可选的实施方式中，所述磁珠液与所述探针液的体积比为1:(1‑1.5)，优选为1: 1。

[0044]本发明的研究还发现，磁珠液与探针液的体积比是影响提取效果的因素之一，将磁珠液与探针液的体积比控制在1:(1‑1.5)的范围下具有较好的提取效果，尤其是控制在1:1的比值下，具有更高的提取效果。

[0045]在可选的实施方式中，所述磁珠上标记有链霉亲和素，所述探针标记有生物素。

[0046]需要说明的是，链霉亲和素和生物素是本领域常见的偶联系统，本领域技术人员可以理解，为了使磁珠与探针偶联还可以采用其他的偶联系统例如地高辛与地高辛抗体等，无论采用何种偶联系统将探针与磁珠偶联，均属于本发明的保护范围。

[0047]在可选的实施方式中，所述方法还包括：
[0048]孵育步骤：将所述第二混合液静置孵育40‑90min，优选为40min。

[0049]需要说明的时，本发明对孵育的温度不作限定，在室温下进行孵育也是可行的。

[0050]本发明的研究发现，孵育的时间对提取效果的有影响，将孵育时间控制在40‑90min的范围下，可以取得较好的提取效果；优选地，控制孵育在40min，其提取效果更佳。

[0051]第二方面，本发明实施例提供一种与结直肠癌相关基因的甲基化检测方法，该方法以非疾病的诊断为目的，其包括：采用前述实施方式任一项所述的方法提取得到适用于结直肠癌相关基因的甲基化检测的DNA样本。

[0052]在可选的实施方式中，所述结直肠癌相关基因选自：SDC2、TFPI2、VIM、NDRG4、SFRP1、SFRP2、BMP3、MGMT、SPG20和SEPT9。

附图说明
[0053]为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附
图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

[0054]图1为：SDC2基因甲基化区分结直肠癌和正常样本的ROC曲线；
[0055]图2为：SDC2基因甲基化区分结直肠腺瘤和正常样本的ROC曲线；
[0056]图3为：TFPI2基因甲基化区分结直肠癌和正常样本的ROC曲线；
[0057]图4为：TFPI2基因甲基化区分结直肠腺瘤和正常样本的ROC曲线。

具体实施方式
[0058]为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。

所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

[0059]以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。

[0060]实施例1
[0061]本实施例提供的从粪便中提取适用于结直肠癌相关基因的甲基化检测的DNA样本的方法，其包括如下步骤：
[0062](1)收集粪便样本，按照比例加入粪便保存液，充分振荡混匀，得到粪便稀释液样本；
[0063]粪便和粪便保存液按照质量体积比(g：ml)为1:3(1mg：3mL)，即每g粪便对应使用3ml保存液；
[0064]粪便保存液含有：300mmol/L EDTA、200mmol/L Tris·HCl和150mmol/L NaCl。

[0065]粪便保存液的配置方法为：取800mL无菌超纯水，加入24.23g Tris碱粉末后搅拌至完全溶解,加入8.77g NaCl后搅拌至完全溶解，加入100.86g EDTA二钠盐充分搅拌，测量pH值，用浓盐酸或氢氧化钠溶液将pH调节至8.0，定容至1L，充分搅拌。

[0066](2)取1.8mL粪便稀释液样本至一洁净的2mL离心管中，12000rpm离心2min，从离心机中轻轻取出离心管，小心吸取1.2mL上清至一洁净的2mL离心管中。

[0067](3)向1.2mL的样本上清中加入吸附剂，吸附剂与上清液的质量体积比为1:4(g: mL)涡旋振荡，使其充分混匀，12000rpm离心2min。

[0068]其中，所用吸附剂为交联聚乙烯吡咯烷酮粉末或交联聚乙烯吡咯烷酮片剂。

[0069](4)将上清转移至一洁净2mL离心管中，等体积加入5mol/L的异硫氰酸胍，轻柔地颠倒混匀。

[0070](5)将步骤(4)得到的含有上清的离心管置于90℃变性10min。

[0071](6)捕获剂制备：
[0072]根据所要检测的基因的种类数量(即为提取的基因数量)，计算磁珠液(磁珠浓度为10mg/mL，标记有链霉亲和素)的使用量(磁珠液的用量确定后，捕获剂使用量即可确定)，当待测基因为一种时，磁珠液(浓度为10mg/mL)用量为3‑7μL，本实施例优选为5μL；[0073]即磁珠液的用量满足如下公式：V＝N*M；公式中，V表磁珠液的体积，N代表待提取基因的种类数量；M取值范围为3‑7，单位为μL，本实施例优选为M＝5；
[0074]计算好磁珠液的用量后，按体积比为1:1的比例，将磁珠液与的探针液(探针浓度10uM，标记有生物素)混合，得到磁珠‑探针混合液，体积记为V1，震荡混匀以使探针与磁珠偶联，再将磁珠‑探针混合液置于磁力架上进行吸附，弃上清后加入缓冲液重悬一次，震荡混匀30s，瞬时离心1s，即得捕获剂。

[0075]上述的探针与待提取的结直肠癌相关基因的序列互补，其序列由需要提取的结直肠癌相关基因序列设计而得。

结直肠癌相关基因的种类数量和对应的探针序列均可以根据实际需求确定。

[0076](7)杂交孵育：将步骤(6)制得的经过重悬的捕获剂迅速向步骤(5)变性后的上清液中加入，颠倒混匀，孵育40min。

[0077](8)吸磁分离：步骤(7)的混合液6min吸磁，弃上清，取磁珠沉淀。

[0078](9)漂洗：向步骤(9)的2mL离心管加入1mL漂洗液(EDTA(PH8.0，5mM)、Tris‑HCl (PH8.0，20mM))，震荡混匀5s，瞬时离心2～4s，置于磁力架上吸磁2min，弃上清。

[0079](10)重复步骤(9)。

[0080](11)洗脱：向步骤(10)的2mL离心管中加入40μL洗脱液，轻轻震荡混匀，吸磁2min，将上清转移至一洁净离心管中，即得所需DNA样本，该DNA可以用于后续结直肠癌相关基因的甲基化检测，根据甲基化的检测结果即可反应主体的结直肠癌患病情况或结直肠癌前病变情况。

[0081]当然，需要说明的是，所提取的DNA也可以进行其他类型的检测，并不限于甲基化检测，如一些基因的突变和结直肠癌的发生和发展相关，这些基因包括但不限于KRAS和TP53。

[0082]当然，所提取的DNA也可以进行其他肿瘤的检测，例如消化道肿瘤食管癌、胃癌、胰腺癌和胆囊癌等。

[0083]实施例2
[0084]本实施例提供了结直肠癌的检测方法，其包括如下步骤：
[0085](a)从粪便中提取DNA样本
[0086]采用实施例1的方法从粪便中提取DNA样本，以SDC2和TFPI2基因为目标提取基因，在步骤(6)的捕获探针序列如下：
[0087]SDC2：TGCTTGCGGCACTCCCGTGTAACTCCTATG；
[0088]TFPI2：AAACTTTCTCCTGTAGTCCAGACGGGGACG。

[0089]得到以SDC2基因甲基化检测为主的DNA样本。

[0090]另外，在检测SDC2和TFPI2基因时，需要同时检测看家基因β‑actin以作为内参，以β‑actin为目标提取基因时，在步骤(6)的捕获探针序列如下：
[0091]ATTGGCAAGAGCCCGGCTCAGACAAAGACCC。

[0092](b)亚硫酸盐转化
[0093]亚硫酸盐可将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，通过这种方法实现甲基化与非甲基化序列的区分，本实施例所用核酸转化试剂盒为ZYMO RESEARCH的EZ DNA Methylation‑Gold TM Kit，具体实验操作参见厂家说明书。

[0094]需要说明的是，在其他的实施方式中，可以通过其它方法检测标志物的甲基化情况，如亚硫酸盐测序、亚硫酸盐焦磷酸测序、微数组、质谱分析、变性高液相层析法、焦磷酸
测序法、甲基化DNA免疫沉淀法与定量聚合酶链式反应、甲基化DNA免疫沉淀测序法或纳米孔测序法等。

[0095](c)甲基化特异性PCR(Methylation Specific PCR,MSP)
[0096]对经步骤(b)转化后获得的DNA，采用MSP方法对SDC2和TFPI2基因的甲基化敏感位点进行检测，β‑actin作为内参基因，SDC2、TFPI2和β‑actin引物和探针序列见下表1，PCR反应体系见表2，PCR反应条件见表3。

[0097]表1 SDC2、TFPI2和β‑actin引物和探针序列
[0098]
[0099]
[0100]上述SDC2探针、TFPI2和β‑actin探针的5'端标记有荧光基团，3'端标记有淬灭基团，其中SDC2探针的荧光基团为FAM，淬灭基团为MGB‑NFQ，TFPI2探针的荧光基团为ROX，猝灭基团为MGB‑NFQ，β‑actin探针的荧光基团为VIC，淬灭基团为MGB‑NFQ。

[0101]表2 MSP反应体系
[0102]组分规格体积(μL)
缓冲液10× 2.5
dNTPs各2.5mM2
SDC2正向引物10μM0.5
SDC2反向引物10μM0.5
SDC2探针10μM0.5
TFPI2正向引物10μM0.5
TFPI2反向引物10μM0.5
TFPI2探针10μM0.5
β‑actin正向引物10μM0.5
β‑actin反向引物10μM0.5
β‑actin探针10μM0.5。