新城疫病毒F48E9株和La Sota株F基因在Bac-to-Bac昆虫杆状病毒系统中的表达

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新城疫病毒F蛋白在昆虫细胞中的表达及其融细胞作用

第21卷6期中国病毒学21（6）：571-574收稿日期：2006-05-16, 修回日期：2006-07-06* 江苏省教育厅资助项目(JH03-028); 全国优秀博士论文作者专项资金资助项目(200256)作者简介：王桂军(1969-)，男，安徽阜南籍，博士生，安徽农业大学副教授，从事动物病原分子生物学研究。

** 通讯作者. Corresponding author. E-mail: aijian@572 中国病毒学第21卷组病毒，而且表达的外源蛋白能够进行糖基化等修饰，具有天然蛋白的生物学活性[6]。

本研究中我们采用Bac-To-Bac杆状病毒表达系统表达了我国新城疫病毒标准强毒株F48E8株F基因，为进一步研究F基因的生物学功能和新城疫基因工程疫苗创造条件。

1材料和方法1.1细胞、载体及主要试剂转座用E.coli DH10Bac、杆状病毒转移载体pFastBac1、逆转录酶M-MLV、总RNA 提取试剂和Lipofectin脂质体转染试剂购自Invitrogen公司；pGEM-T easy vector、Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶为Promega公司产品；琼脂糖回收试剂盒为QIAGEN公司产品；FITC标记的羊抗鼠IgG为Sigma 公司产品；沉淀性TMB底物溶液购自天为时代公司；新城疫病毒F48E8株和Sf9昆虫细胞为本实验室保存；抗NDV小鼠血清由本实验室制备。

1.2 RT-PCR和F基因的克隆参考GenBank已发表的NDV F基因序列设计一对引物，5’端分别引入Bam HI和Xba I酶切位点，P1: 5’-GACGGATCCGCCCATTCAAAGTGCAAGAT-3’，P2: 5’- GCCTCTAGAGCCTCTTGTCTGCATTCACA-3’。

RNA的提取按Invitrogen公司的总RNA提取试剂液操作说明进行；在引物P1和M-MLV反转录酶作用下合成cDNA，然后立即进行PCR。

新城疫病毒F48E9株NP基因的克隆与序列分析

新城疫病毒F48E9株NP基因的克隆与序列分析柴迎梅;曹殿军;闫丽辉;刘培欣;黄永芬;汪清胤【期刊名称】《中国预防兽医学报》【年(卷),期】2002(024)002【摘要】根据NDVNP蛋白已知基因序列设计合成了一对引物,利用RT-PCR扩增出了F48E9株NP基因1598bp的片段,将该片段克隆到pMD18-T Vector上,并对所得到的重组质粒进行酶切分析、PCR鉴定,结果证明我们得到了这个基因片段的阳性重组子.为了更充分证实所得阳性质粒的可靠性,采用Sanger＇s双脱氧末端终止法对阳性重组子进行核苷酸序列测定,获得了F48E9株NP基因片段的基因序列,利用DNASIS分析软件,将F48E9株与La Sota株的相应序列进行比较,其核苷酸序列同源性为88.2%.至此,我们获得了F48E9株NP基因的全长克隆.【总页数】3页(P110-112)【作者】柴迎梅;曹殿军;闫丽辉;刘培欣;黄永芬;汪清胤【作者单位】哈尔滨师范大学生物系,150080;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江,哈尔滨,150001;哈尔滨师范大学生物系,150080;哈尔滨师范大学生物系,150080【正文语种】中文【中图分类】S852.65【相关文献】1.新城疫病毒F48E9株重组NP蛋白单克隆抗体制备及鉴定 [J], 刘文丽;刘怀然;刘培欣;张馨心;孔宪刚;陈维多2.新城疫病毒中国株F48E9融合蛋白基因序列分析 [J], 陈金顶;廖明;辛朝安3.鸡新城疫病毒F48E9强毒株NP基因的序列分析 [J], 陈珍;施少华;程龙飞;傅光华;陈红梅;万春和;林芳;林建生;黄瑜4.11株新城疫病毒广西分离株NP基因的克隆和序列分析 [J], 孙建华;谢芝勋;刘加波;唐小飞;庞耀珊;邓显文5.新城疫病毒长春株NP、P、M蛋白基因的克隆与序列分析 [J], 王承宇;金宁一;丁壮;王兴龙;金扩世;米志强;李太原;宣华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

新城疫活疫苗La Sota株免疫增强了禽网状内皮组织增生病毒对SPF鸡的致病作用

新城疫活疫苗La Sota株免疫增强了禽网状内皮组织增生病毒对SPF鸡的致病作用张亚文;季晓琳;张智慧;苏奇;常爽;徐中清;王芳;赵鹏【期刊名称】《中国动物传染病学报》【年(卷),期】2022(30)3【摘要】禽网状内皮组织增生病毒(REV)是鸡群中常见的垂直传播性病毒之一,感染后可导致鸡群发生严重的免疫抑制,对于一些未净化REV的鸡群,在免疫新城疫活疫苗后某些鸡会加重发病趋势,怀疑通过鸡胚感染的REV和新城疫活疫苗在体内发挥了协同致病作用,为此本研究开展了模拟实验。

从100枚SPF鸡胚中随机选择50枚SPF鸡胚通过卵黄囊接种REV,剩余50枚SPF鸡胚通过卵黄囊接种灭菌PBS。

待孵化出雏后鸡胚接毒组和空白鸡胚对照组各取20只SPF鸡于7日龄时免疫新城疫活疫苗(La Sota株),同时鸡胚接毒组和空白鸡胚对照组各取20只SPF鸡于7日龄时接种PBS。

结果显示:携带有REV的雏鸡再免疫活疫苗La Sota株后首先出现死亡,其体重明显低于其他组SPF鸡体重,免疫器官损伤程度比REV单独感染组更加严重,且显著高于对照组。

本研究结果表明新城疫活疫苗La Sota株免疫后增强了REV对SPF鸡的致病作用,提示我们选择净化种源的重要性。

【总页数】6页(P100-105)【作者】张亚文;季晓琳;张智慧;苏奇;常爽;徐中清;王芳;赵鹏【作者单位】山东农业大学动物科技学院;中国兽医药品监察所【正文语种】中文【中图分类】S858.31【相关文献】1.鸡新城疫、禽流感(H9亚型)、禽腺病毒(Ⅰ群,4型)三联灭活疫苗(La Sota株+TJ 株+HY株)抗体效价与鸡攻毒保护相关性试验2.鸡新城疫、禽流感(H9亚型)、禽腺病毒(Ⅰ群,4型)三联灭活疫苗(La Sota株+TJ株+HY株)抗体产生期和免疫持续期试验3.鸡新城疫、禽流感(H9亚型)、禽腺病毒(Ⅰ群,4型)三联灭活疫苗(La Sota 株+TJ株+HY株)子代通过\r母源疫苗获得被动免疫力的效力和免疫期试验4.鸡新城疫、禽流感(H9亚型)、禽腺病毒(Ⅰ群,4型)三联灭活疫苗(La Sota株+TJ株+HY株)经皮下和肌肉接种鸡的效力试验5.新城疫弱毒疫苗La Sota株对血清4型禽腺病毒致病作用的影响研究因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

影响鸡新城疫（La Sota株）活疫苗抗原病毒含量因素的探讨

影响鸡新城疫（La Sota株）活疫苗抗原病毒含量因素的探讨江兴华【摘要】鸡新城疫（La Sota株）活疫苗抗原病毒含量受多种因素的影响,如种蛋的母源抗体、种毒的病毒含量、照蛋间隔时间、抗原保存时间、抗原保存温度等。

文中主要针对以上因素进行试验,结果表明：在相同条件下用含新城疫母源抗体越高的种蛋制备的（La Sota株）活疫苗抗原的病毒含量越低;使用病毒含量高的种毒制备的抗原病毒含量高于使用病毒含量低的种毒制备的抗原;在新城疫抗原生产中照蛋间隔时间越长,所生产的抗原病毒含量越低;同一批新城疫抗原保存时间越长,抗原病毒含量越低;同一批新城疫抗原在同样的保存时间内,使用越低的保存温【期刊名称】《福建畜牧兽医》【年(卷),期】2011(033)004【总页数】3页(P7-9)【关键词】鸡新城疫;病毒含量;影响因素【作者】江兴华【作者单位】福州大北农生物技术有限公司,350014【正文语种】中文【中图分类】S858.315.3鸡新城疫是由副粘病毒引起的高度接触性传染病，是鸡病中危害最严重的一种。

鸡新城疫弱毒活疫苗是预防鸡新城疫病的主导产品，它包括多种弱毒株，La Sota株是其中最普遍的一种毒株。

在生产鸡新城疫（La Sota株）活疫苗过程中有多种因素影响抗原病毒含量，为了提高鸡新城疫（La Sota株）抗原病毒含量，笔者对影响鸡新城疫活疫苗抗原病毒含量的主要因素（如不同种蛋、种毒效价、照蛋间隔时间、抗原保存时间、抗原保存温度）进行探讨。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1 种毒鸡新城疫（La Sota株）由中国兽医药品监察所提供，由本厂进行传代繁殖后使用。

1.1.2 鸡胚 SPF鸡胚（种蛋购自山东济南斯帕法斯家禽有限公司）由本公司自行孵化；普通鸡胚（种蛋购自福州北峰鸡场）由本公司自行孵化。

1.1.3 鸡新城疫（La Sota株）抗原由本公司生产。

1.2 试验方法1.2.1 种蛋母源抗体对抗原病毒含量影响试验方法1）种蛋母源抗体检测。

新城疫病毒F48E9株HN蛋白抗原结构域区段的原核表达

ＨＮｇｎｙＰＲｗｉｐｃｆｆｍｅｈｅｇｎｓｗｅｅｉｓｒｄｂｔｅａＩｎｔｉｓｏＥ２ａａｔｒｃｅｖｇｙｃｒｅｐｎ — ｅｅｂＣｔｓｅｉｃｐｈｉｉ￣．ＴｅｅｒｅｔｅｗｅｎＳｄＮｏｓｅｆｐＴ８ｆｌａａｅｂｏｒｓｏｄｎｅｌａＩｔｅ
蛋白相互作用奠定了基础。
关键词：新城疫病毒；血凝素一经氨酸酶；神结构域；原核表达
中图分类号：７６文献标识码：文章编号：０１５１２１）７－０１０Ｑ８Ａ１０ —８８（００００９ — ４
ＰｒｋｒｏｉｐｅｓｏｆＳｒｃｕａｍａｎｆＨｅａｇＩｔｎｎ— ｏａｙｔｃＥｘｒｓｉｎｏｔｕｔｒｌＤｏｉｓｏｍｇ］ｉｉｕｎｕａｎｄａｅｉＮｅａｔｅＤｉｅｓｒｓｅｒｍｉｉｓｎｗｃｓｌｓａｅＶｉｕ
摘
要：用生物软件对新城疫病毒Ｆ８９株的血凝素神经氨酸酶（Ｎ）白进行抗原特性分析，利４ＥＨ蛋选定１２～５０位氨基７７
酸区域作为多肽表位候选区域。以ｐＣ８一Ｕ１Ｆ—ＨＮ为模板，设计引物通过ＰＲ扩增，Ｃ获得ＨＮ抗原结构域基因片段，ａＩＮｔＳｌห้องสมุดไป่ตู้ｏＩ、双酶切定向克隆到原核表达载体ｐＴ８，Ｅ２ａ获得重组质粒分别命名为ｐＴ８Ｅ２ａ—ＨａＮ。重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞
江西农业学报
２１，２７：１９００２（）９ — ４

新城疫病毒La Sota株的纯化和免疫原性分析的开题报告

新城疫病毒La Sota株的纯化和免疫原性分析的开题报告一、研究背景新城疫病毒是家禽流行性疾病之一。

其引起的流行性传染病主要包括：禽流行性新城疫、秋冬季节外寄生物病和水土传播病。

禽流行性新城疫是由新城疫病毒（NDV）引起的一种急性、高度接触性、高致死率疾病。

为了防治新城疫病毒的流行，许多疫苗对此进行了研发。

La Sota株是目前流行性的一种疫苗株，但是其疫苗的免疫原性还需进一步的探究。

本研究旨在进行新城疫病毒La Sota株的纯化和免疫原性分析，为新城疫病毒疫苗的研发提供理论依据和实验数据。

二、研究内容1.新城疫病毒La Sota株的纯化通过对新城疫病毒La Sota株的繁殖、收集和提纯方法进行优化和改进，得到高纯度的La Sota病毒株。

采用电镜、SDS-PAGE等方法检测其纯度。

2.新城疫病毒La Sota株的免疫原性分析采用免疫学技术，分析La Sota株病毒的免疫原性。

包括免疫印迹、免疫荧光、ELISA等方法，检测La Sota株病毒蛋白的免疫原性和免疫反应能力。

三、研究意义本研究的主要意义在于：1.澄清La Sota株疫苗免疫原性存在的不确定性，有利于全面提高目前已有的新城疫病毒疫苗免疫效果，避免病毒的再次爆发。

2.这些研究结果可用于进一步开发新的新城疫病毒疫苗，从而解决传统疫苗失效、病毒突变等问题。

为建立病毒疫苗的相关标准和规范提供依据。

四、研究方法1.新城疫病毒La Sota株的繁殖、收集和提纯方法优化和改进，并采用电镜、SDS-PAGE等方法检测其纯度。

2.采用免疫印迹、免疫荧光、ELISA等方法进行La Sota株的免疫原性分析，检测La Sota株病毒蛋白的免疫原性和免疫反应能力。

五、预期成果通过对新城疫病毒La Sota株的纯化和免疫原性分析，预期达成以下成果：1.得到新城疫病毒La Sota株的高纯度样品，并确定其纯度和活性。

2.明确La Sota株病毒蛋白的免疫原性和免疫反应能力。

新城疫弱毒疫苗La Sota株对血清4型禽腺病毒致病作用的影响研究

·研究论文·Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报摘要：Ⅰ群血清4型禽腺病毒（FAdV-4）是常见的家禽垂直传播性病毒，感染鸡后可导致心包积液综合征。

在生产中，先天感染FAdV-4的雏鸡免疫La Sota 疫苗时会明显加重病情，因此我们推测新城疫弱毒疫苗的免疫具有加重或诱发和垂直传播感染的FAdV-4的致病作用。

本研究随机选择50枚SPF 鸡胚通过卵黄囊接种来模拟FAdV-4先天性感染，同时以接种生理盐水SPF 鸡胚作为对照。

待孵化出雏后，接毒组和对照组各取20只7日龄SPF 鸡免疫新城疫Ⅳ系弱毒疫苗（La Sota 株），同时各组其余鸡以相同方式接种等量PBS 作为对照。

结果显示：FAdV-4感染的雏鸡在免疫La Sota 株后更容易发生严重的生长抑制和免疫器官损伤，说明免疫La Sota 株能显著增强FAdV-4致病性。

本研究结果显示，免疫弱毒疫苗La Sota 增强了垂直传播感染的FAdV-4致病性，提示家禽养殖业种源净化的重要性。

关键词：禽腺病毒；新城疫弱毒疫苗La Sota 株；致病作用中图分类号：S852.659.5文献标志码：A文章编号：1674-6422（2020）04-0001-06NEWCASTLE DISEASE ATTENUATED V ACCINE LA SOTA STRAIN ENHANCES THE PATHOGENICITY OF A VIAN ADENOVIRUS TYPE 4LIU Xiao-feng 1, HOU Li-dan 2, MA Xiao-ling 3, ZHEN Yue 1, ZHANG Ya-wen 1, ZHANG Zhi-hui 1,SU Qi 1, CHANG Shuang 1, CUI Zhi-zhong 1, LI Jun-ping 2, ZHAO Peng 1(1. College of Veterinary Medicine, Shandong Agricultural University, Tai’an 271018, China; 2. China Institute of Veterinary Drug Control,Beijing 100081, China; 3. Shanghai Pharmaceutical Group Qingdao Guofeng Pharmaceutical co. Ltd., Qingdao 266002, China)收稿日期：2019-01-09基金项目：十三五国家重点研发计划（2018YFD0500106）作者简介：柳晓锋，男，硕士研究生，兽医专业；侯力丹，女，助理研究员，主要从事动物疫苗质量评估通信作者：赵鹏，E-mail：*****************.cn；李俊平，E-mail：*******************Abstract: Fowl adenovirus serotype 4 (FAdV-4) is a common poultry vertical transmission virus, which causes hydropericardium syndrome. When raising chicks carrying congenital FAdV-4 infection, immunization with the La Sota vaccine will significantly aggravate the disease. Therefore, we speculate that the administration of the Newcastle disease Ⅳ attenuated vaccine La Sota can aggravate or induce the pathogenicity of vertical transmission of FAdV-4. In this study, 50 SPF chicken embryos were inoculated with FAdV-4 via yolk sac, and other 50 SPF chicken embryos were inoculated with saline as controls. On day 7 post hatching, 20 SPF chickens from新城疫弱毒疫苗La Sota 株对血清4型禽腺病毒致病作用的影响研究柳晓锋1，侯力丹2，马晓玲3，甄岳1，张亚文1，张智慧1，苏奇1，常爽1，崔治中1，李俊平2，赵鹏1（1.山东农业大学动物科技学院，泰安271018；2.中国兽医药品监察所，北京100081；3.上海医药集团青岛国风药业股份有限公司，青岛266002）2020,28(4): 1-6Ⅰ群禽腺病毒共12个血清型，其中血清4型Ⅰ群禽腺病毒（FAdV-4）可引起心包积水、包涵体肝炎、再生障碍性贫血、出血、轻度呼吸道疾病和产蛋量减少等病症[1]，是近年来我国流行最广泛的禽类病原之一[2]；Ⅱ群禽腺病毒主要引起火鸡出血性肠炎，代表株为火鸡出血性肠炎病毒（Hemorrhagic enteritis virus，HEV）；Ⅲ群禽腺病毒主要引起减蛋综合征，仅包含减蛋综合征病毒（Egg drop syndrome virus，EDSV）[3]。

新城疫病毒La Sota株F基因重组pGAPZα的构建

江苏农业科学
２１００年第２期
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刘超，太平．新城疫病毒Ｌｏ程ａＳｔａ株Ｆ基因重组ｐＰａ的构建［］ＧＡＺＪ．江苏农业科学，００２４２１（）：５—４７
新城疫病毒பைடு நூலகம்Ｌｏ株基因重组ｐＡＺ￣ａＳｔａＧＰｃ的构建
刘超，程太平
（长江大学动物科学学院，湖北荆州４４２）３０５
摘要：根据新城疫病毒（ＤＬｏ株Ｆ基因序列和毕赤酵母表达载体ｐＡＺｔＮＶ）ａＳｔａＧＰｏＡ多克隆位点序列，计并合设成３对引物，Ｒ以Ｔ—ＰＲ技术获得ＮＶＬｏａ株融合蛋白（）因的ＦＣＤａＳｔＦ基ｌ片段和Ｆ２片段。将目的基因和质粒ｐＡＺ￣以ＫｎＩ和ＸａＩ进行酶切，ＤＡ连接酶进行连接并转化ＥｃｅｉｉｏＩｃ，ＧＰｏＡ均ｐｂ以ＮｓｒｈａｃｌＤ－ｔ转化子经ＰＲ鉴定和ｈｃｉＩＳＣ酶切鉴定，结果表明构建的重组质粒中含有目的基因片段。将目的基因片段的测序结果与ＮＶＬｏＤａＳｔａ株Ｆ基因序
１３ＮＤＶＲＮ的提取．Ａ
目前，城疫（ｅｃｓｅｄｓａｅＮ仍然是我国养禽业新Ｎｗａｔｉｓ，Ｄ）ｌｅ中威胁最大、济损失严重、于防制的重要疫病。主要防治经难方法是疫苗接种，禽生产中长期广泛应用灭活疫苗和弱毒家

新城疫病毒与天然免疫应答_胡增垒

收稿日期：2013-04-15∗基金项目：公益性行业（农业）科研专项（201303033）∗∗通讯作者，E-mail ：xfliu@新城疫病毒与天然免疫应答∗胡增垒，刘秀梵∗∗（扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室，江苏扬州225009）新城疫病毒（Newcastle disease virus ，NDV ）是副黏病毒科禽腮腺炎病毒属的一个重要成员，是危害养禽业的一个重要病原。

同时，NDV 也是研究抗病毒天然免疫应答的一个重要的模型病毒。

病毒感染诱导天然免疫的机制、天然免疫信号通路的转导与调控以及病毒与天然免疫之间的相互作用已经成为病毒学的研究热点。

本文对NDV 诱导与调控天然免疫以及天然免疫应答与NDV 致病性之间关系的研究进行综述和讨论。

1模式受体介导的天然免疫宿主免疫系统由天然免疫系统和特异性免疫系统组成，天然免疫是机体抵抗病原微生物的第一道防线。

特异性免疫系统依靠淋巴细胞发育成熟过程中抗原受体基因的重排所产生的受体多样性对特定病原体进行特异性识别。

但是，天然免疫系统缺乏庞大的受体库，其对病原微生物的精确识别主要依靠胚系编码的天然免疫受体。

病原微生物通常含有保守且重复的分子结构，如细菌的鞭毛由重复的亚基组成，细菌DNA 含有大量未被亚基化的CpG 片段，病毒在复制过程中产生的双链RNA （double-strand RNA ，dsRNA ）和作为中间产物的单链RNA （single-strand RNA ，ssRNA ）等。

病原微生物编码的这些重复且保守的结构称为病原相关分子模式（Pathogen-associated molecular pattern ，PAMP ）。

宿主细胞则编码负责识别这些分子模式的天然免疫受体，称为模式识别受体（Pattern recognition receptors ，PRRs ）。

PRRs 侦测到病原微生物后，能够诱导一系列的免疫效应。

这些效应包括受体-配体结合后启动的吞噬作用，招募免疫细胞向感染部位移动的趋化效应，补体、细胞因子、趋化因子等效应分子的产生与特异性免疫应答的调控与激活。

新城疫病毒株F48E9对CT26小鼠结肠癌的溶瘤治疗作用

中国人兽共患病学报C h i n e s e J o u r n a l o f Z o o n o s e s㊀２０１９,３５(４)D O I :１０．３９６９/j．i s s n ．１００２－２６９４．２０１９．００．０２６论㊀著新城疫病毒株F ４８E ９对C T ２６小鼠结肠癌的溶瘤治疗作用钟建平１,李㊀睿２,王国松１,洪俊平１,付㊀饶１,陈毅歆１,２厦门市重大科技创新平台项目(N o ．３５０２Z ２０１３１００１)资助通讯作者:陈毅歆,E m a i l :yx c h e n ２００８＠x m u ．e d u ．c n ;O R C I D :００００Ｇ０００２Ｇ９５９１Ｇ６３４X作者单位:１．厦门大学生命科学学院国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心,厦门㊀３６１１０２;２．厦门大学公共卫生学院分子疫苗学与分子诊断学国家重点实验室,厦门㊀３６１１０２摘㊀要:目的㊀分析新城疫病毒株F ４８E ９对C T ２６小鼠结肠癌的体内外肿瘤杀伤作用和F ４８E ９静脉注射B L A B /c 小鼠的安全性数据,评估新城疫强毒株F ４８E ９用于溶瘤治疗的潜力,为后续基于强毒株F ４８E ９进行基因组改造提供科学依据.方法㊀利用C C K Ｇ８试剂盒分析F ４８E ９对C T ２６肿瘤细胞的体外杀伤效果,通过瘤内注射病毒评价F ４８E ９对C T ２６荷瘤小鼠的溶瘤治疗效果,以及通过尾静脉注射病毒评估F ４８E ９对健康B A L B /c 小鼠的潜在毒副作用.结果㊀MO I 为０．１的F ４８E ９对C T ２６细胞生长可表现出明显的抑制作用,随着MO I 的升高,F ４８E ９对细胞生长的抑制作用明显增强;０．１m L 浓度为２ˑ１０７pf u /m L 的F ４８E ９对B A L B /c 小鼠C T ２６皮下移植瘤的生长有显著抑制作用,治疗组的平均生存期为３８．４d ,未治疗组的平均生存期为１５．２d ;免疫组化分析显示F ４８E ９对C T ２６小鼠移植瘤细胞的增殖有明显抑制作用;F ４８E ９尾静脉注射正常B A L B /c小鼠的安全性评估实验显示,该毒株对小鼠无明显副作用.结论㊀新城疫强毒株F ４８E ９对C T ２６小鼠结直肠癌有较好的溶瘤治疗潜力,可作为候选病毒株通过后续的反向遗传学改造建立更安全有效的溶瘤病毒株,为肿瘤研究与治疗提供新手段.关键词:新城疫病毒(N D V );结肠癌;溶瘤治疗;安全性评价中图分类号:R ７３㊀㊀㊀文献标识码:A ㊀㊀㊀文章编号:１００２－２６９４(２０１９)０４－０２９２－０７O n c o l yt i c e f f e c t o fN e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s F ４８E ９s t r a i n o nC T ２６m u r i n e c o l o n c a n c e rZ HO N GJ i a n Ｇp i n g １,L IR u i ２,WA N G G u o Ｇs o n g １,HO N GJ u n Ｇp i n g １,F U R a o １,C H E N Y i Ｇx i n １,２(１．N a t i o n a l I n s t i t u t e o f D i a g n o s t i c s a n dV a c c i n eD e v e l o p m e n t i nI n fe c t i o u sD i s e a s e s ,S c h o o l of L i f eS c i e n c e ,X i a m e nU n i v e r s i t y ,X i a m e n ３６１１０２,C h i n a ;２．S t a t eK e y L a b o r a t o r y o f M o l e c u l a rV a c c i n o l og y a n d M o l e c u l a rD i a gn o s t i c s ,S c h o o l o f P u b l i cH e a l t h ,X i a m e nU n i v e r s i t y ,X i a m e n ３６１１０２,C h i n a )A b s t r a c t :T o e v a l u a t e t h e p o t e n t i a l o fN e w c a s t l e d i s e a s e v i r u l e n t s t r a i nF ４８E ９f o r o n c o l yt i c t r e a t m e n t a n dm a k e a f o u n d a Ｇt i o no f g e n e t i cm o d i f i c a t i o n f o rN e w c a s t l e d i s e a s e v i r u sF ４８E ９s t r a i n ,t h e i n h i b i t o r y e f f e c t o f F ４８E ９s t r a i n o nC T ２６c o l o n c a n c Ｇe r c e l l sw a s t e s t e d b y C C k Ｇ８k i t i n v i t r o a n d o n c o l y t i c e f f e c t o f F ４８E ９s t r a i n o nC T ２６t u m o r Ｇb e a r i n g m i c e i n v i v o w a s e v a l u a t e d b y i n t r a t u m o r a l i n j e c t i o no fF ４８E ９v i r u s ,t h e s i d e e f f e c t s o f F ４８E ９s t r a i n o n ６Ｇw e e kB A L B /cm i c ew a s a l s o e v a l u a t e db yI n t r a Ｇv e n o u s i n j e c t i o no f ２ˑ１０７p f uv i r u s ．T h er e s u l t ss h o w e dt h a tF ４８E ９a ta MO Io f０．１s h o w e da no b v i o u s i n h i b i t i o no nt h e g r o w t ho fC T ２６c e l l s ．W i t h t h e i n c r e a s e o fMO I ,i t s i n h i b i t o r y e f f e c t o n c e l l g r o w t hw a s s i g n i f i c a n t l y e n h a n c e d ;t h e g r o w t ho f C T ２６m u r i n e t u m o r s u b c u t a n e o u s l y t r a n s p l a n t e d i nB A L B /cm i c ew a s s i g n i f i c a n t l y i n h i b i t e db y ０．１m LF ４８E ９s t r a i n a t ２ˑ１０７p f u /m L ．T h e a v e r a g e s u r v i v a l t i m e o f t h ev i r u s Ｇt r e a t e d g r o u p w a s３８．４d ,a n dP B S Ｇt r e a t e d g r o u p wa s１５．２d ．I mm u n o h i s t o Ｇc h e m i c a l e x p e r i m e n t s h o w e d t h a tF ４８E ９s i g n i f i c a n t l y i n h ib i t e dt h e p r o l i f e r a t i o no fC T ２６c e l l so f t r a n s pl a n t e dt u m o r i n m i c e ;s a f e t y e v a l u a t i o no fF ４８E ９s t r a i nb y t a i lv e i ni n je c t i o ni nn o r m a lB A L B /c m i c es h o w e dt h a t t h es t r a i nh a dn oo b v i o u ss i d e ef f e c t s ．T h e r e s u l t s s h o w e d t h a t N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u sF ４８E ９s t r a i nh a da g o o d t h e r a pe u t i c ef f e c t o nC T ２６c o l o r e c t a l c a n c e r i nv i t r o a n d i nv i v o a n dw a ss a f e t y o nB A L B /c m i c e ．N e w c a s t l e d i s e a s ev i r u l e n t s t r a i nF ４８E ９h a sag o o do n c o l yt i c po t e n t i a l f o r C T ２６m o u s e c o l o r e c t a l c a n c e r ,a n d c a n b e u s e d a s a c a n d i d a t e v i r u s s t r a i n t oe s t a b l i s ha s a f e r a n d m o r e e f f e c t i v e o n c o l y t i c v i r u s s t r a i n t h r o u g h s u b s e qu e n t r e v e r s e g e n e t i cm o d Ｇi f i c a t i o n ,f o r t u m o r r e s e a r c ha n d t r e a t m e n t ．２９２K e y w o r d s:N e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s(N D V);c o l o n c a n c e r;o n c o l y t i c t h e r a p y;s a f e t y e v a l u a t i o n S u p p o r t e db y t h eK e y R&DP r o g r a mo fX i a m e nC i t y(N o．３５０２Z２０１３１００１)C o r r e s p o n d i n g a u t h o r:C h e nY iＧx i n,E m a i l:y x c h e n２００８＠x m u．e d u．c n㊀㊀根据国家癌症中心发布的«２０１７中国癌症报告»显示:与２０１２年相比,我国２０１３年癌症新发人数继续上升,累计病例数从３８５万增加到３９８万,增幅３％,占当年世界新发病例的近２５％.其中,结肠癌增长趋势明显,在男性肿瘤中其发病率排第５位,在女性肿瘤中排第３位,综合死亡率排第５位,位于肺癌㊁胃癌㊁肝癌㊁食管癌之后.目前在临床上结肠癌以手术切除治疗为主,放疗化疗以及免疫治疗为辅[１].手术治疗之后,结肠癌比较容易转移和复发,是结肠癌引起患者死亡的主要原因[２].免疫治疗是最有前景的肿瘤治疗手段之一,曾入选«科学»杂志２０１３十大科学突破榜首[３].基于病毒的溶瘤治疗是免疫治疗的重要途径之一,包括人类单纯疱疹病毒(H S V)㊁新城疫病毒(N D V)㊁腺病毒(A d e n o v i r u s)㊁柯萨奇病毒(C o x s a c k i ev iＧr u s)㊁麻疹病毒(m e a s l e s v i r u s,MV)㊁呼吸道肠道病毒(r e o v i r u s)㊁水疱性口炎病毒(V S V)等在内的病毒都已被证明具有溶瘤作用[４Ｇ５],可通过直接感染裂解肿瘤细胞㊁激活机体免疫系统等多种途径发挥肿瘤的抑制或清除作用,部分病毒株已在临床治疗中显示出良好的治疗效果,其中１株改造过的H S V 溶瘤病毒已经在美国正式上市[６Ｇ８].N D V是一种单链负义R N A病毒,属于副粘病毒科,主要感染禽类,偶见患者感染事件,引起结膜炎[９]和温和的流感症状等[１０].从２０世纪６０年代至今,已有７３ＧT㊁MT HＧ６８㊁P V７０１㊁HU J㊁L aS o t a 等多个N D V减毒株或弱毒株开展了一期和二期药物临床试验[６,１１Ｇ１３],但都没有进入三期临床试验阶段,提示现有的N D V弱毒株或减毒株的治疗效果可能不够好,因此,有必要开发疗效更好的N D V溶瘤病毒株.胡立华[１４]等比较了N D V强毒株F４８E９和N D V弱毒株L a S o t a对大肠癌细胞L S１７４７的体外杀伤效果,提示F４８E９可能具备溶瘤治疗潜能,但该研究未在动物水平上评估F４８E９溶瘤抑制效果和治疗安全性.因此,本研究拟以C T２６小鼠结肠癌为模型,深入研究N D V强毒株F４８E９对C T２６肿瘤细胞和C T２６小鼠皮下移植瘤的体内外抑制作用,并通过静脉注射小鼠评价F４８E９的体内治疗安全性,从而确定N D V强毒株F４８E９是否可作为候选病毒株进行后续的反向遗传学改造,为最终建立高效安全的N D V溶瘤病毒株奠定基础.１㊀材料与方法１．１㊀病毒㊁细胞及实验动物㊀新城疫病毒株F４８E９为中国农业大学王晓佳教授馈赠;结肠癌C T２６细胞购自A T C C(＃A T C CC R LＧ２６３８);B A L B/c小鼠(６Ｇ８周龄)购自上海斯莱克实验动物有限公司(＃００３).１．２㊀实验试剂与耗材㊀细胞活力检测C C KＧ８试剂盒购自碧云天公司(＃C００４０);细胞增殖多克隆抗体K iＧ６７购自N O V U S公司(＃N B１１０Ｇ８９７１７);即用型免疫组化试剂盒U l t r a S e n i t i v eT M S P购自福州迈新公司(＃K I T９７２０),内含内源性氧化物阻断试剂㊁正常动物免疫血清(羊)㊁生物素标记的第二抗体及链霉素抗生物素蛋白Ｇ过氧化物酶;D A B显色试剂盒购自福州迈新公司(＃D A BＧ００３１);苏木精染色液购自S I GMAＧA L D R I C H公司(＃HH S１６);醇溶伊红染色液购自S I GMAＧA L D R I C H公司(＃H T１１０１１６).１．３㊀方㊀法１．３．１㊀F４８E９的培养㊁滴定㊀培养V e r o细胞,当细胞处于对数生长期并且状态良好时,消化细胞,使用细胞计数仪计数,并将３ˑ１０６个V e r o细胞铺在１０c m细胞培养板中,放置在３７ħ,５％C O２的恒温培养箱中培养.培养７２h等到细胞完全覆盖细胞板时取其中一板进行消化计数并记录.使用无血清D M E M培养基稀释F４８E９病毒液,再按照MO I＝０．１(病毒数/细胞数,MO I)感染V e r o细胞,放置在温箱中培养.培养过程中每１５m i n摇晃１次,孵育７５m i n使病毒充分吸附在细胞上,之后弃去残余的病毒液并加入１０m L含２％血清的维持液,放入培养箱中培养.培养４８h后收取细胞,反复冻融裂解细胞３次,然后使用３０００r/m i n离心细胞裂解物１５m i n,除去细胞碎片,分装上清液至病毒冻存管中并进行空斑形成实验滴定病毒的滴度,空斑实验方法参见文献[１５],保存在－８０ħ超低温冰箱中.对生产的病毒进行免疫荧光实验,进一步证明F４８E９感染细胞的活性.消化V e r o细胞,然后铺板至２４孔板中,每孔２ˑ１０５个细胞.细胞贴壁生长,覆盖８０％~９０％培养孔时,进行免疫荧光实验.３９２４期钟建平等:新城疫病毒株F４８E９对C T２６小鼠结肠癌的溶瘤治疗作用一抗为本实验制备的F４８E９株N P蛋白小鼠单克隆抗体４E７,二抗为T R I T C标记的羊抗鼠荧光二抗,D A P I染细胞核[１６].使用荧光显微镜进行拍照并分析.１．３．２㊀F４８E９对C T２６细胞的体外感染抑制实验㊀胰酶消化C T２６细胞,按每孔０．１m L浓度为２ˑ１０５个细胞铺至９６孔板中;稀释F４８E９病毒,分别按MO I＝１０㊁１㊁０．１㊁０．０１感染铺板１２h后的C T２６细胞,每个病毒浓度梯度设置３孔重复;在感染７２h 后用C C KＧ８试剂盒检测细胞活力的变化,实验操作方法参照试剂盒说明书.１．３．３㊀F４８E９对C T２６细胞小鼠皮下移植肿瘤的体内抑制实验㊀培养C T２６细胞,消化制备成浓度为５ˑ１０７个/m L的细胞悬液,接种于１６只６周龄B A L B/c雌鼠右侧背部皮下,每只小鼠接种０．１m L 细胞,接种数量是５ˑ１０６个细胞;接种后持续监测皮下肿瘤的生长状态并测量肿瘤的大小,在接种约十天后挑选１０只肿瘤大小均一且体积达到８０~１００mm３的小鼠进行溶瘤治疗,随机分成两组,每组５只;治疗实验组小鼠经瘤内注射０．１m L浓度为２ˑ１０７p f u的F４８E９,未治疗对照组小鼠经瘤内注射０．１m LP B S缓冲液,每隔一天注射１针,共注射５针.每天使用数字游标卡尺测量肿瘤的尺径和观察小鼠的生存情况,肿瘤体积计算公式为V＝a b２/２(a为长径,b为短径),当小鼠皮下肿瘤任一边长的直径大于１８mm时出于动物伦理考虑判定为死亡,并实施安乐死[１７].１．３．４㊀F４８E９溶瘤治疗C T２６皮下瘤的免疫组化分析㊀按照上述方法构建C T２６细胞皮下移植瘤,选取８只肿瘤体积为８０~１００mm３的小鼠随机分成两组,每组４只;实验组为瘤内注射０．１m L浓度为２ˑ１０７p f u的F４８E９毒株,对照组为瘤内注射０．１m LP B S缓冲液,每２d注射１针病毒液,共注射３针;第３针注射２d后对全部８只小鼠实施安乐死,取出肿瘤组织进行组织化学染色[１８].组织脱蜡复水后,山羊血清封闭１h;一抗为商品化的兔多抗K iＧ６７抗体和P B S对照,４度孵育过夜,P B S洗３次;生物素标记的羊抗兔二抗常温孵育１０m i n,P B S 洗３次;过氧化物酶标记的链霉素抗生物素蛋白三抗常温孵育１０m i n,P B S洗３次;D A B显色液显色３０s,去离子水终止显色反应.使用奥林巴斯正置荧光显微镜(B X５１)和c e l l S e n sS t a n d a r d软件进行拍照并分析组织化学染色结果.１．３．５㊀F４８E９的小鼠体内安全性分析㊀取２０只６周龄B A L B/c雌鼠随机分成２组,每组１０只,称量其体重;随后进行小鼠尾静脉攻毒,实验组的每只小鼠经尾静脉注射１m L浓度为２ˑ１０７p f u的F４８E９病毒,对照组为１m LP B S缓冲液,每２d进行１次尾静脉注射,共３针;第３针注射２d后从实验组和对照组中各取４只小鼠实施安乐死,取出主要器官进行苏木素Ｇ伊红染色,其余小鼠每４d称量１次体重并观察小鼠的活动状态.取浸泡后的小鼠主要器官进行包埋脱蜡复水,苏木素染色液染色,脾脏１m i n,肾脏２m i n,肝脏８m i n,肺组织１０m i n.染色结束后,去离子水清洗三遍.盐酸酒精分化４s,迅速用去离子水终止分化,去离子水清洗三遍,去离子水返蓝４５m i n.伊红染色１m i n,去离子水终止染色.使用奥林巴斯正置荧光显微镜(B X５１)和c e l l S e n sS t a n d a r d软件进行拍照并分析组织化学染色结果.１．３．６㊀统计与分析㊀对于两组数据之间的比较,采用t检验进行统计分析;对于两组以上的数据采用方差分析进行显著性评估.当P＜０．０５时,表示结果具有统计学差异.２㊀结㊀果２．１㊀F４８E９株的培养和滴定㊀用V e r o细胞株培养扩增F４８E９,收获的病毒液分装保存于－８０ħ超低温冰箱中,经空斑形成试验法滴定,滴度为２ˑ１０７p f u/m L.F４８E９感染V e r o细胞后可以形成肉眼可见的明显病毒空斑(图１A),免疫荧光试验显示用F４８E９的N P特异性单抗能在感染F４８E９的细胞中检测到荧光信号(图１B),表明病毒株F４８E９在V e r o细胞中得到特异性扩增.２．２㊀F４８E９对C T２６结肠癌细胞的生长抑制作用㊀F４８E９株感染C T２６细胞７２h后,使用C C KＧ８法测定细胞活力水平.结果显示,当MO I＝１０㊁１㊁０．１㊁０．０１时,C T２６细胞的活力分别为４４．６％㊁５３．８％㊁８４．９％㊁９６．２％,说明新城疫病毒F４８E９株能够有效抑制C T２６细胞的生长,其抑制效果与病毒的感染剂量成正相关,即感染病毒的MO I越高,对C T２６细胞活力的抑制越明显(图２).２．３㊀F４８E９对C T２６细胞小鼠皮下移植瘤的生长抑制作用㊀在免疫功能正常的B A L B/c小鼠皮下接种C T２６细胞,等肿瘤生长至体积为８０~１００mm３时,实验组小鼠经瘤内注射F４８E９病毒液,对照组小鼠注射P B S缓冲液,持续监测肿瘤的生长和小鼠生存情况.结果显示,实验组小鼠的皮下肿瘤始终处于抑制状态,其肿瘤体积远远小于P B S对照组(图３A,B);同时,病毒实验组小鼠的中位生存期４９２中国人兽共患病学报２０１９,３５(４)图１㊀新城疫病毒株F ４８E ９的培养和滴定空斑实验(A )和免疫荧光实验(B )F i g．１㊀C u l t u r ea n dt i t r a t i o no f N e w c a s t l ed i s e a s ev i r u s F ４８E ９s t r a i nP l a q u ea s s a y (A )a n d i m m u n o f l u o Ｇr e s c e n c e a s s a y (B)(∗∗∗∗P ＜０．０００１,∗P ＜０．０５,n o ．P ＞０．０５)图２㊀新城疫病毒株F ４８E ９对C T ２６结肠癌细胞的生长抑制作用F i g ．２㊀I n h i b i t o r y ef f e c t s o fN e w c a s t l ed i s e a s e v i r u sF ４８E ９s t r a i no n t h eg r o w t ho fC T ２６c e l l s为３８d ,平均总生存期为３８．４d ,P B S 对照组的中位生存期为１４d ,平均总生存期为１５．２d .上述结果表明,新城疫病毒F ４８E ９能显著抑制C T ２６结肠癌细胞小鼠皮下移植瘤的生长,显著延长小鼠生存期(图３C ).２．４㊀F ４８E ９可抑制C T ２６荷瘤小鼠内肿瘤细胞的增殖㊀为进一步确定F ４８E ９是否通过抑制肿瘤细胞的增殖来抑制小鼠皮下移植瘤的生长,取C T ２６荷瘤B A L B /c 小鼠进行瘤内注射实验.实验组瘤内注射３针F ４８E ９病毒液,然后对小鼠实施安乐死,取出肿瘤组织进行免疫组织化学分析,观察细胞增殖标记物K i Ｇ６７蛋白的表达情况,对照组注射P B S 缓冲液.K i Ｇ６７蛋白是一种核定位蛋白,只表达于细胞分裂期,K i Ｇ６７的过表达与细胞快速增殖密切相关.免疫组化分析结果显示,注射F ４８E ９的小鼠皮下肿瘤细胞呈K i Ｇ６７阳性的细胞数明显少于注射P B S 的对照组小鼠(图４),提示新城疫病毒株F ４８E ９可能通过抑制小鼠肿瘤细胞的增殖来抑制小鼠皮下肿瘤的生长.２．５㊀新城疫病毒F ４８E ９的安全性评估㊀为评估新城疫病毒F ４８E ９的治疗安全性,取F ４８E ９对健康B A L B /c 小鼠进行尾静脉注射(n ＝１０).注射３针病毒后,实验组和对照组各取４只小鼠进行安乐死处理,然后取主要脏器进行苏木素Ｇ伊红染色,观察注射F ４８E ９病毒是否会引起小鼠器官损伤,对其余每组各６只小鼠持续监测其体重并观察动物活动状态.结果显示,接种F ４８E ９病毒的小鼠活动正常,其饮食㊁毛色等没有出现异常情况;体重监测数据表明,病毒接种组与P B S 接种组的小鼠体重未见明显差别,都没有明显的下降或波动(图５．A ),存活率都是１００％(图５．B );苏木素Ｇ伊红染色表明,病毒接种组和P B S 接种组的染色细胞未见明显差异,组织细胞都呈正常形态(图５．C ).上述结果表明新城疫病毒强毒株F ４８E ９对B A L B /c 小鼠具有良好的安全性.３㊀讨㊀论本文研究新城疫病毒强毒株F ４８E ９对小鼠结肠癌C T ２６肿瘤细胞的体内外生长抑制作用并评价其在小鼠体内的安全性.结果显示强毒株F ４８E ９在体外能显著抑制C T ２６细胞的生长,在小鼠体内能通过抑制肿瘤细胞的增殖来抑制肿瘤的生长;而且F ４８E ９对B A L B /c 小鼠的治疗具有良好的安全性,尾静脉注射病毒未对小鼠造成明显的副作用.新城疫病毒株F ４８E ９作为国内标准强毒株,国内对F ４８E ９的研究主要集中于禽类疫苗以及F ４８E ９的生物学特性等,罕见其用于溶瘤治疗的研究报道.胡立华[１４]等比较了强毒株F ４８E ９和弱毒株L a S o t a 对大肠癌细胞L S １７４７的体外杀伤效果,但是没有进行体内评价实验,本研究将F ４８E ９应用于C T ２６细胞B A L B /c 小鼠移植瘤模型的治疗研究,对F ４８E ９的肿瘤治疗潜能有更全面的认识.国外也有利用N D V 治疗C T ２６小鼠抑制瘤的研究报道,G a r c ía ＧS a s t r e [１７]等把由弱毒株N D V ＧB １株改造F 蛋白裂解位点而得到的r N D V ＧF ３a a 用于接种在B A L B /c 小鼠C T ２６肿瘤的治疗,小鼠中位生存期由P B S 对照组的１３d 延长到实验组的２３d.本研５９２４期钟建平等:新城疫病毒株F ４８E ９对C T ２６小鼠结肠癌的溶瘤治疗作用小鼠肿瘤体积的增长值(A )及其平均值(B ),荷瘤小鼠生存率,P ＜０．０１(C ),治疗１７d 后的肿瘤大小图像(D ).P B S 组为对照组.图３㊀新城疫病毒株F ４８E ９对C T ２６结肠癌细胞的小鼠皮下移植瘤的生长抑制作用F i g ．３㊀I n h i b i t o r y e f f e c t s o fN e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s s t r a i nF ４８E ９o n t h e t r a n s pl a n t e d t u m o r s i nB A L B /cm i c e ６９２中国人兽共患病学报２０１９,３５(４)P B S 对照组K i Ｇ６７蛋白呈阳性的细胞数明显高于F ４８E ９治疗组.标尺＝２０μm .图４㊀新城疫病毒株F ４８E ９抑制C T ２６肿瘤细胞的增殖F i g ．４㊀F ４８E ９s t r a i n c a n i n h i b i t t h e p r o l i f e r a t i o no fC T ２６t u m o r c e l l s f r o mt r a n s pl a n t e dm i ce 病毒处理组和P B S 对照组的小鼠体重没有明显的差异,都没有下降或者波动的现象(A ),实验组和对照组的小鼠存活率均为１００％(B ),苏木素Ｇ伊红染色表明实验组和对照组小鼠的主要器官都没有损伤(C ).标尺＝５０μm .图５㊀新城疫病毒株F ４８E ９的治疗安全性评价F i g ．５㊀S a f e t y ev a l u a t i o no fN e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s s t r a i nF ４８E ９i nB A L B /cm i c e 究使用的F ４８E ９溶瘤株可以将小鼠中位生存期由１４d 延长至３８d,显示出更好的溶瘤治疗效果.为进一步全面认识新城疫病毒株F ４８E ９的溶瘤治疗潜能,还需进行更多的后续研究,如应用更多种类的肿瘤细胞系进行体内外治疗潜能评价,应用人源结肠癌裸鼠模型进行肿瘤治疗评价,评估F ４８E ９与P D Ｇ１㊁C T L A Ｇ４与C D ４７等肿瘤抗体联用的治疗效果[１９Ｇ２０].７９２４期钟建平等:新城疫病毒株F ４８E ９对C T ２６小鼠结肠癌的溶瘤治疗作用在溶瘤治疗研究中,给药治疗起始节点的早与晚对肿瘤治疗效果影响十分明显.本研究中选取的是接种约１０d,肿瘤体积较大(８０~１００mm３)的小鼠进行治疗,而其他N D V溶瘤研究中选取的肿瘤体积较小,多为５０mm３以内[１７,１９].尽管如此,本研究中F４８E９对大肿瘤依然表现出很好治疗作用,说明N D V强毒株F４８E９具有高效的溶瘤治疗作用,对中晚期大肿瘤也具备较好的治疗潜能.另外,由于小鼠个体的差异,对同一批次的小鼠接种相同数目的肿瘤细胞,肿瘤的生长速度不尽相同[２１].本研究采取的策略是挑选肿瘤形状规则大小均一的荷瘤小鼠,再随机分组,有效地避免了肿瘤治疗点肿瘤大小差异而带来的实验偏差.关于N D V的溶瘤治疗机制研究,我们以细胞周期蛋白K iＧ６７作为细胞增殖标记物[２２],通过组织化学染色分析了F４８E９病毒处理组肿瘤组织中K iＧ６７蛋白的表达情况,证明K iＧ６７蛋白阳性细胞数明显少于P B S对照组,提示F４８E９抑制细胞增殖可能是其发挥抗肿瘤的机制之一.有研究还报道了其他新城疫病毒株的溶瘤治疗机制,如A d a m V i g i l[２３]等通过比较新城疫溶瘤毒株对接种于裸鼠和B A L B/c 小鼠C T２６肿瘤的治疗效果,证明新城疫毒株对C T２６肿瘤的治疗依赖于T淋巴细胞,又如H o n g S u i[２４]等使用新城疫毒株N D VＧD９０治疗接种于裸鼠的人源胃癌细胞,证明N D VＧD９０可能通过下调V G E FＧA和MM PＧ２来抑制肿瘤血管的生成,进而抑制肿瘤的生长.因此,后续工作还需进一步系统地研究F４８E９的溶瘤治疗机制.新城疫病毒弱毒株作为一种安全的溶瘤制剂或者肿瘤疫苗载体,已得到广泛的认可,而对于新城疫病毒强度株是否适合应用于肿瘤治疗依然存在争议,考虑的主要是强毒株的安全性.本研究通过小鼠尾静脉攻毒实验,证明N D V强毒株F４８E９对B A L B/c小鼠没有明显的毒副作用,其体内治疗具有良好的安全性.尽管新城疫强毒株在实验小鼠体内表现出了良好的安全性,但是依然存在潜在的扩散风险,需要在后续的研究中构建F４８E９株的反向遗传系统进行改造,保留其良好的溶瘤特性的同时降低潜在的风险.总之,研究初步显示新城疫病毒强毒株F４８E９对结肠癌C T２６肿瘤具有较好的治疗作用且安全性良好,展示出较好的溶瘤治疗潜能,为充分认识新城疫病毒强毒株的溶瘤治疗性能提供有用的实验数据,为后续的反向遗传改造奠定实验基础.利益冲突:无本文引用格式:钟建平,李睿,王国松,等．新城疫病毒株F４８E９对C T２６小鼠结肠癌的溶瘤治疗作用[J]．中国人兽共患病学报,２０１９,３５(４):２９２Ｇ２９８,３１９．D O I:１０．３９６９/j．i s s n．１００２Ｇ２６９２．２０１９．００．０２６参考文献:[１]张忠涛,蔡军．结肠癌多学科综合治疗协作组诊疗模式专家共识[J]．中国实用外科杂志,２０１７,１(３７):４４Ｇ４５．D O I:１０．１９５３８/ j．c j p s．i s s n１００５Ｇ２２０８．２０１７．０１．１５[２]吴琳．结肠癌根治术后肿瘤转移复发的特点和影响预后的因素[J]．中外医学研究,２０１５,１４:１２７Ｇ１２９．D O I:１０．１４０３３/j．c n k i．c f m r．２０１５．１４．０６５[３]C o u z i n F J．C a n c e ri mm u n o t h e r a p y[J]．S c i e n c e,２０１３,３４２(６１６５):１４３２Ｇ１４３３．D O I:１０．１１２６/S c i e n c e．３４２．６１６５．１４３２[４]R u s s e l lS J,P e n g KW,B e l l J C．O n c o l y t i cv i r o t h e r a p y[J]．N a t B i o t e c h n o l,２０１２,３０(７):６５８Ｇ６７０．D O I:１０．１０３８/n b t．２２８７[５]F o u n t z i l a sC,P a t e l S,M a h a l i n g a m D,e t a l．R e v i e w:o n c o l y t i c v i r o t h e r a p y,u p d a t e s a n d f u t u r e d i r e c t i o n s[J]．O n c o t a r g e t,２０１７,８(６０):１０２６１７Ｇ１０２６３９．D O I:１０．１８６３２/o n c o t a r g e t．１８３０９[６]F r e e m a nA I,Z a k a y R Z,G o m o r i J M,e t a l．P h a s e I/I I t r i a l o f i n t r a v e n o u sN D VＧHU J o n c o l y t i c v i r u s i n r e c u r r e n t g l i o b l a s t o m a m u l t i f o r m e[J]．M o lT h e r,２００６,１３(１):２２１Ｇ２２８．D O I:１０．１０１６/j．Y m t h e．２００５．０８．０１６[７]Z e m p F J,C o r r e d o r J C,L u nX,e t a l．O n c o l y t i cv i r u s e sa se xＧp e r i m e n t a l t r e a t m e n t s f o rm a l i g n a n t g l i o m a s:u s i n g a s c o u r g e t o t r e a t ad e v i l[J]．C y t o k i n eG r o w t hF a c t o rR e v,２０１０,２１(２):１０３Ｇ１１７．D O I:１０．１０１６/j．C y t o g f r．２０１０．０４．００１[８]C o f f i nR．I n t e r v i e ww i t hR o b e r t C o f f i n,i n v e n t o r o fTＧV E C:t h e f i r s to n c o l y t i ci mm u n oＧt h e r a p y a p p r o v e df o rt h et r e a t m e n to f c a n c e r[J]．I mm u n o t h e r a p y,２０１６,８(２):１０３Ｇ１０６．D O I:１０．２２１７/i m t．１５．１１６[９]M u s t a f f a B A,I b r a h i m A L,K h i m T S．Ac a s e o f h u m a n i n f e c t i o n w i t hn e w c a s t l ed i s e a s ev i r u s[J]．S o u t h e a s tA s i a nJT r o p M e d P u b l i cH e a l t h,１９７６,７(４):６２２Ｇ６２４．[１０]B u i j s P R,V a nA G,V a nN S,e t a l．I n t r a v e n o u s l y i n j e c t e d n e wＧc a s t l ed i se a s e v i r u s i n n o nＧh u m a n p r i m a t e s i s s af e t o u s e f o r o nＧc o l y t i c v i r o t h e r a p y[J]．C a n c e rG e n eT h e r,２０１４,２１(１１):４６３Ｇ４７１．D O I:１０．１０３８/c g t．２０１４．５１[１１]P e c o r aA L,R i z v iN,C o h e nG I,e t a l．P h a s e I t r i a l o f i n t r a v eＧn o u s a d m i n i s t r a t i o no fP V７０１,a no n c o l y t i cv i r u s,i n p a t i e n t s w i t ha d v a n c e ds o l i dc a n c e r s[J]．JC l i n O n c o l,２００２,２０(９):２２５１Ｇ２２６６．D O I:１０．１２００/J C O．２００２．０８．０４２[１２]L a u r i eS A,B e l l J C,A t k i n sH L,e t a l．A p h a s e１c l i n i c a l s t u d y o f i n t r a v e n o u s a d m i n i s t r a t i o no f P V７０１,a no n c o l y t i c v i r u s,uＧs i n g t w oＧs t e p d e s e n s i t i z a t i o n[J]．C l i n C a n c e rR e s,２００６,１２(８):２５５５Ｇ２５６２．D O I:１０．１１５８/１０７８Ｇ０４３２．C C RＧ０５Ｇ２０３８[１３]S i n k o v i c s J G,H o r v a t hJ C．N e w c a s t l ed i s e a s ev i r u s:b r i e f h i sＧt o r y o f i t s o n c o l y t i c s t r a i n s[J]．JC l i n V i r o l,２０００,１６(１):１Ｇ１５．D O I:１０．１０１６/S１３８６Ｇ６５３２(９９)０００７２Ｇ４[１４]胡立华,陈鹏,张沛怡,等．新城疫病毒对人类大肠癌细胞的杀伤作用研究[J]．牡丹江医学院学报,２０１０,３１(５):１１Ｇ１３．D O I:１０．３９６９/j．i s s n．１００１Ｇ７５５０．２０１０．０５．００５(下转第３１９页)８９２中国人兽共患病学报２０１９,３５(４)i n t e r f e r o n Ｇγr e l e a s ea s s a y sf o r i n c i d e n ta c t i v et u b e r c u l o s i s ::a s y s t e m a t i cr e v i e w a n d m e t a Ｇa n a l y s i s [J ]．L a n c e tI n f e c t D i s ,２０１２,１２(１):４５Ｇ５５．D O I :１０．１０１６/S １４７３Ｇ３０９９(１１)７０２１０Ｇ９[１６]K a w a m u r aL M ,G r i n s d a l e J A ,H oC S ,e t a l ．I n t e r f e r o n Ｇγr e l e a s ea s s a y s f o r p r e d i c t i o no ft ub e rc u l o s i s [J ]．L a n c e tI n f e c t D i s e ,２０１２,１２(８):５８４Ｇ５８４．D O I :１０．１０１６/S １４７３Ｇ３０９９(１２)７０１６９ＧX[１７]P a r k H J ,S h i nJ A ,K i m H J ,e t a l ．W h o l eb l o o d i n t e r f e r o n Ｇγr e Ｇl e a s e a s s a y i s i n s u f f i c i e n tf o rt h ed i a g n o s i so fs pu t u m s m e a r n e g a t i v e p u l m o n a r y t u b e r c u l o s i s [J ]．Y o n s e i M e dJ ,２０１４,５５(３):７２５Ｇ７３１．D O I :１０．３３４９/y m j．２０１４．５５．３．７２５[１８]B a s i r u d e e nS A K ,B a l a m b a l R ,A l e y a mm aT ,e t a l ．R o l e o f qu a n Ｇt i F E R O N ＧT B g o l d ,i n t e r f e r o n g a mm a i n d u c i b l e p r o t e i n Ｇ１０a n dt u b e r c u l i ns k i nt e s ti na c t i v et u b e r c u l o s i sd i a g n o s i s [J ]．P l o s O n e ,２０１０,５(２):e ９０５１．D O I :１０．１３７１/j o u r n a l ．po n e ．０００９０５１[１９]何莉,赵希唯,陈刚,等．γＧ干扰素释放试验在不同类型肺结核中的应用价值[J ]．第三军医大学学报,２０１７,３９(２０):２０１７Ｇ２０２１．D O I :１０．１６０１６/j．１０００Ｇ５４０４．２０１７０６００９[２０]易婷曲,郭建林,屈涛．结核感染T 细胞检测试验在不同类型结核病诊断中的临床意义[A ]．中国微生物学会临床微生物学专业委员会㊁医学参考报社㊁宁波大学医学院．第九届中国临床微生物学大会暨微生物学与免疫学论坛论文集[C ]．２０１８收稿日期:２０１８Ｇ０７Ｇ０３㊀编辑:林丹(上接第２９８页)[１５]梅双双,杨润德．鸡新城疫病毒强毒株的分离及生物学特性鉴定[J ]．中国预防兽医学报,２００２,２４(５):３６８Ｇ３７１．D O I :１０．３９６９/j．i s s n ．１００８Ｇ０５８９．２００２．０５．０１３[１６]王明睿,钟建平,李睿,等．新城疫病毒核蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心E L I S A 的初步建立[J ]．中国人兽共患病学报,２０１７,３３(６):４８１Ｇ４８５．D O I :１０．３９６９/j．i s s n ．１００２Ｇ２６９４．２０１７．０６．００２[１７]V i gi lA ,P a r k M S ,M a r t i n e zO ,e t a l ．U s eo f r e v e r s e g e n e t i c s t o e n h a n c et h eo n c o l y t i c p r o p e r t i e so fn e w c a s t l ed i s e a s ev i r u s [J ]．C a n c e rR e s ,２００７,６７(１７):８２８５Ｇ８２９２．D O I :１０．１１５８/０００８Ｇ５４７２．C A N Ｇ０７Ｇ１０２５[１８]K a n t h i y aK ,K h u n n a r o n g J ,T a n g j i t g a m o l S ,e t a l ．E x pr e s s i o n o f t h e p １６a n dK i ６７i n c e r v i c a l s q u a m o u s i n t r a e pi t h e l i a l l e s i o n s a n d c a n c e r [J ]．A s i a nP a cJC a n c e rP r e v ,２０１６,１７(７):３２０１Ｇ３２０６．D O I :１０．１４４５６/a p j c p．２０１６．７６[１９]Z a m a r i nD ,H o l m ga a r dR B ,S ub u d h i S K ,e t a l ．L oc a l i z e do n Ｇc o l y t i c v i r o t h e r a p y o v e r c o m e s s y s t e m i c t u m o r r e s i s t a n c e t o i m Ｇm u n ec h e c k p o i n t b l o c k ad ei mm u n o t he r a p y [J ]．S c i T r a n s l M e d ,２０１４,６(２２６):２２６Ｇ２３２．D O I :１０．１１２６/s c i t r a n s l m e d ．３００８０９５[２０]P a t r i c i aK ,L a e t i t i aF ,C h r i s t i n eT ,e t a l ．V e c t o r i z a t i o n i na no n c o l y t i cv a c c i n i a v i r u s o f a n a n t i b o d y ,a f a b a n d a s c F v a g a i n s t p r o gr a mm e d c e l l d e a t h Ｇ１(P D Ｇ１)a l l o w s t h e i r i n t r a t u m o r a l d e Ｇl i v e r y a n da ni m p r o v e dt u m o r Ｇg r o w t hi n h i b i t i o n [J ]．O n c o i m Ｇm u n o l o g y,２０１６,５(１０):e １２２０４６７．１Ｇe １２２０４６７．１４．D O I :１０．１０８０/２１６２４０２X．２０１６．１２２０４６７[２１]R u o t s a l a i n e n J J ,K a i k k o n e n MU ,N i i t t yk o s k iM ,e t a l ．C l o n a l v a r i a t i o n i n i n t e r f e r o n r e s po n s ed e t e r m i n e s t h eo u t c o m eo f o n Ｇc o l y t i c v i r o t h e r a p y i n m o u s eC T ２６c o l o nc a r c i n o m am o d e l [J ]．G e n eT h e r ,２０１４,２２(１):６５Ｇ７５．D O I :１０．１０３８/g t ．２０１４．８３[２２]S c h o l z e nT ,G e r d e s J ．T h ek i Ｇ６７p r o t e i n :f r o mt h ek n o w na n dt h eu n k n o w n [J ]．J C e l l P h ys i o l ,２０００,１８２(３):３１１Ｇ３２２．D O I :１０．１００２/(S I C I )１０９７Ｇ４６５２(２００００３)[２３]V i gi lA ,M a r t i n e zO ,C h u aMA ,e t a l ．R e c o m b i n a n t n e w c a s t l e d i s e a s e v i r u s a s a v a c c i n e v e c t o r f o r c a n c e r t h e r a p y[J ]．M o lT Ｇh e r ,２００８,１６(１１):１８８３Ｇ１８９０．D O I :１０．１０３８/m t ．２００８．１８１[２４]H o n g S ,W a n g K ,X i eR ,e t a l ．N D V ＧD ９０s u p pr e s s e s g r o w t h o f g a s t r i c c a n c e ra n dc a n c e rr e l a t e dv a s c u l a r i z a t i o n [J ]．O n c o Ｇt a r g e t ,２０１７,８(２１):３４５１６Ｇ３４５２４．D O I :１０．１８６３２/o n c o t a r g e t ．１６５６３收稿日期:２０１８Ｇ０４Ｇ０８㊀编辑:林丹关于O R C I DO R C I D (O p e nR e s e a r c h e r a n dC o n t r i b u t o r I D ,开放研究者与贡献者身份识别码),即科研人员国际唯一学术标识符,由一套免费的㊁全球唯一的１６位身份识别码构成.详见h t t p ://o r c i d ．o r g /.本刊要求作者申请O R C I D 号,以供论文出版时标记,如果您注册时没有填写O R C I D 号,请登录后通过修改个人信息补充O R C I D 号.９１３４期王霜珏等:R v ０２２０蛋白I F N Ｇγ释放试验对结核潜伏感染的诊断价值研究。

鸡新城疫病毒F48E9强毒株NP基因的序列分析

鸡新城疫病毒F48E9强毒株NP基因的序列分析陈珍;施少华;程龙飞;傅光华;陈红梅;万春和;林芳;林建生;黄瑜【期刊名称】《福建农业学报》【年(卷),期】2009(024)005【摘要】根据GenBank登录的鸡新城疫病毒NP基因序列设计引物,利用RT-PCR对F48E9强毒株NP基因进行扩增,将扩增产物经纯化后连入pMD18-T载体,通过PCR和酶切鉴定出阳性重组质粒,经测序后获得F48E9 NP基因序列.经分析发现该基因的ORF总长为1 470 bp,编码489 aa,NP蛋白有4个高度保守的Cys位点,分别位于第55、78、139、213位,且在401～440位和461～481位区域变异较大.将F48E9株与19株参考毒株的相应序列进行比较得到核苷酸序列同源性为87.9%～92.3%,氨基酸序列同源性较高,为92.2%～98.0%,遗传进化分析表明F48E9株相对独立,与参考毒株的遗传距离较远.【总页数】5页(P385-389)【作者】陈珍;施少华;程龙飞;傅光华;陈红梅;万春和;林芳;林建生;黄瑜【作者单位】福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建,福州,350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建,福州,350013;福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福建,福州,350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建,福州,350013;福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福建,福州,350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建,福州,350013;福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福建,福州,350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建,福州,350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建,福州,350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建,福州,350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建,福州,350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所,福建,福州,350013;福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福建,福州,350013【正文语种】中文【中图分类】S85【相关文献】1.基因修饰对鸡新城疫病毒F48E9株HN基因DNA疫苗表达效力的影响 [J], 贺笋;石星明;王云峰;王玫;冉多良;童光志2.基因Ⅶ型NDV强毒株F基因重要功能区的克隆与序列分析 [J], 林进秋;王淑敏;顾万军3.1株乌鸡新城疫病毒强毒株的分离鉴定与F基因的遗传进化分析 [J], 刘一飞;薛俊龙;马馨;王国艳;王志宇;张伟业4.利用M基因鉴别新城疫病毒中强毒株与弱毒株RT-nPCR方法的建立 [J], 朱小甫;吴旭锦5.新城疫病毒F48E9株NP基因的克隆与序列分析 [J], 柴迎梅;曹殿军;闫丽辉;刘培欣;黄永芬;汪清胤因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

新城疫病毒F48E9株HN蛋白抗原结构域区段的原核表达

新城疫病毒F48E9株HN蛋白抗原结构域区段的原核表达郭建军;范汉东;杨一兵【摘要】利用生物软件对新城疫病毒F48E9株的血凝素神经氨酸酶(HN)蛋白进行抗原特性分析,选定172～570位氨基酸区域作为多肽表位候选区域.以pUC18-F-HN为模板,设计引物通过PCR扩增,获得HN抗原结构域基因片段,SalⅠ、NotⅠ双酶切定向克隆到原核表达载体pET28a,获得重组质粒分别命名为pET28a-HNa.重组质粒转化大肠杆菌感受态细胞BL21,筛选出阳性克隆,诱导表达并取产物进行分析.结果表明,HN抗原结构域基因片段获得了融合表达,Western-blotting分析证实表达产物HN与NDV阳性血清具有免疫反应性.为进一步研究HN蛋白抗原结构域的免疫原性以及HN蛋白与F蛋白相互作用奠定了基础.【期刊名称】《江西农业学报》【年(卷),期】2010(022)007【总页数】4页(P91-94)【关键词】新城疫病毒;血凝素-神经氨酸酶;结构域;原核表达【作者】郭建军;范汉东;杨一兵【作者单位】江西省科学院,微生物研究所,江西,南昌,330029;江西省科学院,微生物研究所,江西,南昌,330029;江西省科学院,微生物研究所,江西,南昌,330029【正文语种】中文【中图分类】Q786新城疫(Newcastle disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的一种高度接触性、急性败血性禽类传染病，发病率和死亡率较高［1］。

据国际病毒分类委员会(ICTV)报告，将NDV列入副粘病毒亚科下的新属Avulavirus内，基因组包含6个基因，其结构为3’NP-P-M-F-HN-L 5’，共编码6个主要蛋白［2］，其中HN和F蛋白是其主要的致病相关性和免疫保护性抗原［3］，在免疫应答和致病过程中起着极其重要的作用［4］，HN蛋白在病毒侵染过程中起识别受体的作用，而F蛋白则介导病毒与宿主细胞的融合［5］。

新城疫病毒中国标准强毒株F_（48）E_9株F基因的酶切分析

新城疫病毒中国标准强毒株F_（48）E_9株F基因的酶切分
析
王莉林;张莹;曹殿军;霍龙飞;卢景良
【期刊名称】《生物技术》
【年(卷),期】1996(6)6
【摘要】含新城疫病毒Ｆ４８Ｅ９株Ｆ基因的重组质粒ｐＢＦＦ经单酶切，双酶切分析，结果表明，中国的标准强毒株Ｆ４８Ｅ５株的Ｆ基因与国外的一些强毒株相比有较大的差异，多出一个ＢａｍＨＩ酶切位点，一个ＳｅａＩ酶切位点，三个ｐｓｔＩ酶切位点，少了一个ｐｓｔＩ酶切位点。

【总页数】3页(P11-13)
【关键词】新城疫病毒;F基因;酶切分析;病毒
【作者】王莉林;张莹;曹殿军;霍龙飞;卢景良
【作者单位】哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室
【正文语种】中文
【中图分类】S852.65
【相关文献】
1.新城疫野毒株与F_(48)E_9强毒株对不同抗体水平雏鸡的感染试验 [J], 程相朝;张春杰;李银聚;吴庭才;郑祥海
2.新城疫病毒F_(48)E_8株核衣壳蛋白基因的克隆及其酶切分析 [J], 姜焱;吴艳涛;刘伟忠;刘秀梵;张如宽
3.新城疫病毒F_(48)E_(9)株HN基因的克隆与酶切分析 [J], 曹殿军;刘春丽;王莉林;张莹;卢景良
4.新城疫病毒F_(48)E_9株M NP F和HN基因的真核表达 [J], 闻晓波;闫丽辉;曹殿军;刘培欣;刘春国;步志高
5.新城疫病毒F_(48)E_9株病毒F基因表达盒的火鸡疱疹病毒转移质粒载体构建[J], 张雪莲;魏荣;陈溥言
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新城疫病毒La Sota株HN基因的克隆与序列分析

新城疫病毒La Sota株HN基因的克隆与序列分析刘颖;金丽颖;申燕;高冬妮;平文祥;葛菁萍【期刊名称】《中国农学通报》【年(卷),期】2015(31)14【摘要】旨在从分子生物学角度进一步研究新城疫病毒La Sota株HN基因,探究NDV La Sota HN基因的遗传变异情况。

研究以试验室冻存的p NDV-HN为模版,根据Gen Bank中登录的NDV La Sota株序列设计引物扩增HN基因,将其克隆到pMD18-T载体后进行鉴定,对鉴定正确的重组质粒p MD-NDV-HN进行测序分析。

应用生物信息学软件对新城疫病毒Lasota株HN基因进行系统进化树分析、氨基酸序列同源性分析、糖基化位点、蛋白结构跨膜区分析及磷酸化位点预测分析。

核苷酸序列测定结果表明:HN基因的序列长度为1743bp,该基因的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)总长为1716 bp,编码571个氨基酸。

生物信息学表明:试验获得的HN基因具有6个潜在糖基化位点及12个半胱氨酸残基,第5个潜在糖基化位点(508-510 aa)发生缺失及第123位半胱氨酸残基被色氨酸残基取代。

La Sota株HN基因编码的蛋白质中有29个丝氨酸、10个酪氨酸和16个苏氨酸可能成为蛋白激酶磷酸化位点。

将试验获得的La Sota株HN基因序列和推导的氨基酸序列与新城疫毒株的HN基因相应序列比较后发现,它们的核苷酸序列同源性和氨基酸序列同源性最高均可达到99%,表明HN基因在种属间具有较高的保守性。

研究为新城疫病毒的分子病毒学研究奠定了基础。

【总页数】7页(P89-95)【关键词】新城疫病毒;HN基因;基因克隆;序列分析【作者】刘颖;金丽颖;申燕;高冬妮;平文祥;葛菁萍【作者单位】黑龙江大学生命科学学院/微生物省高校重点试验室【正文语种】中文【中图分类】Q786【相关文献】1.新城疫病毒HN09-69株P基因的克隆、序列分析及表达 [J], 陈礼朋;王忠田;岳旭龙;王泽仁;高文明;李双亮;张宇耕;崔保安;李新生2.云南省新城疫病毒分离株F基因和HN基因克隆与序列分析 [J], 李师师;赵焕云;张文东;张武林;吕粤;岳亮;张应国;胡述光;张富强3.新城疫病毒西藏分离株HN基因克隆与序列分析 [J], 朱洪云;田广搂4.新城疫病毒F_(48)E_8株HN基因的克隆和序列分析及与国外NDV HN基因的同源性比较 [J], 李太元;金宁一;丁壮;王兴龙;金扩世;吕杰;米志强;殷震5.10株新城疫病毒广西分离株HN蛋白基因的克隆与序列分析 [J], 刘加波;谢芝勋;唐小飞;庞耀珊;邓显文因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

新城疫f48e9病毒体外诱导的鸡t淋巴细胞程序性死亡

中国农业科学　2000,33(1):82～86Scientia Ag ricultura Sinica新城疫F48E9病毒体外诱导的鸡T淋巴细胞程序性死亡刘胜旺,陈洪岩,孔宪刚,刘永刚,卢景良(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所,兽医生物技术国家重点实验室,哈尔滨　150001)摘要:应用流式细胞仪及DN A琼脂糖凝胶电泳技术研究了我国鸡新城疫标准强毒F48E9株体外诱导鸡T淋巴细胞的程序性死亡现象。

同时,对其灭活毒以及从该毒株提取的囊膜蛋白诱导鸡T淋巴细胞的程序性死亡现象进行了观察,并以健康SP F鸡胚尿囊液作为对照。

结果发现,F48E9株及其灭活毒体外均可诱导鸡T淋巴细胞发生程序性死亡,而从病毒中提取的囊膜蛋白及SPF鸡胚尿囊液无此特性。

新城疫F48E9株体外诱导鸡T淋巴细胞程序性死亡这一现象初步表明,新城疫强毒F48E9株感染鸡T淋巴细胞数量的减少和功能的降低以及由此所致的感染鸡免疫功能的降低可能和病毒诱导鸡T淋巴细胞发生程序性死亡有关。

关键词:新城疫F48E9病毒;鸡T淋巴细胞;程序性死亡中图分类号:S858.31　文献标识码:A　文章编号:0578-1752(2000)01-0082-05新城疫病毒可以感染包括鸡淋巴细胞在内的多种细胞〔3,4〕。

病毒对鸡淋巴组织和淋巴细胞的损害作用很早就引起人们的注意〔5,6〕。

研究表明,新城疫病毒感染可引起鸡胸腺和脾脏的皮质部和生发中心局灶性淋巴细胞的空泡形成和破坏,使胸腺、脾脏和外周血液淋巴细胞数量减少〔6～8〕。

目前,对于新城疫病毒引起鸡淋巴样细胞减少的机制进行了较多的研究。

表明坏死是导致鸡淋巴组织及其他组织中淋巴细胞数量减少的原因之一〔7,9〕。

近年来,程序性死亡导致不同类型细胞的死亡现象引起了人们的广泛关注。

研究表明,细胞的程序性死亡是有别于坏死的一种生理现象,该过程不伴随细胞膜的破裂和细胞内蛋白分解酶的释放,因此不引起组织和细胞周围的炎症反应。

新城疫病毒F48E9株F-HN蛋白融合基因在毕赤酵母中的表达

新城疫病毒F48E9株F-HN蛋白融合基因在毕赤酵母中的表达郭建军;范汉东;杨一兵;罗成【摘要】利用重叠PCR技术拼接新城疫病毒F蛋白基因和HN蛋白基因,并将构建好的融合基因克隆到载体pET28a,经测序后融合基因插入表达载体pPIC9K中,在启动子AOX I和α交配因子信号肽的作用下,分泌表达融合蛋白F-HN.重组质粒pPIC9K-F-HN经Sac Ⅰ线性化后,电击转化毕赤酵母GS115,经G418筛选得到转化子.PCR扩增鉴定后,用甲醇诱导表达,SDS-PAGE分析结果表明,目的蛋白为分泌性表达,分子量约为86.5 ku；Western-blot结果表明融合蛋白具有良好的免疫反应性,为下一步研究高效亚单位基因工程苗奠定基础.【期刊名称】《广东农业科学》【年(卷),期】2011(038)020【总页数】4页(P130-133)【关键词】新城疫病毒;F-HN基因;共表达;毕赤酵母【作者】郭建军;范汉东;杨一兵;罗成【作者单位】江西省科学院微生物研究所,江西南昌330029;江西省科学院微生物研究所,江西南昌330029;江西省科学院微生物研究所,江西南昌330029;江西省科学院微生物研究所,江西南昌330029【正文语种】中文【中图分类】S852;Q786新城疫（Newcastle disease，ND）也称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟，是由新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）引起的一种可使多种禽类发生感染和死亡的急性、高度接触性传染病。

新城疫是当今全球范围内最严重的家禽传染病之一，也是我国所有禽病中危害较大的一种[1]。

NDV属于副粘病毒科副粘病毒亚科腮腺炎病毒属，NDV基因组编码6种结构蛋白，两种非结构蛋白。

NP、P和L蛋白与病毒基因组构成核衣壳，HN、F和M存在于囊膜，其中 F蛋白负责病毒穿入细胞，产生细胞融合和溶血作用；HN蛋白负责把病毒吸附到细胞受体和破坏细胞受体。

新城疫病毒(NDV)F基因的克隆及其真核表达重组质粒的构建

新城疫病毒(NDV)F基因的克隆及其真核表达重组质粒的构建许发芝;仲大莲;余为一
【期刊名称】《安徽农业大学学报》
【年(卷),期】2003(30)3
【摘要】应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术和一对自行设计的引物,从新城疫病毒(NDV)F48E9株扩增出长度为1664bp的DNA片段。

与已报道的NDV-融合蛋白(F)基因比较,两者大小一致。

经限制性内切酶反应,获得两个预期大小的片段。

将克隆的F基因定向插入真核表达质粒pcDNA3中,经酶切和测序鉴定,证明构建的重组质粒含有NDV-F基因。

【总页数】5页(P280-284)
【关键词】新城疫病毒;F基因;真核表达重组质粒;构建
【作者】许发芝;仲大莲;余为一
【作者单位】安徽农业大学畜牧水产学院
【正文语种】中文
【中图分类】S852.659.5
【相关文献】
1.新城疫病毒(NDV)HN基因真核表达重组质粒构建 [J], 秦春圃
2.真核表达NDV F基因重组质粒的构建及其在CEF细胞中的转染 [J], 刘兆球;姜世金;常维山
3.猪ASC及Ub基因的克隆及真核表达重组质粒的构建 [J], 樊钰莹;华思红;王志
鹏;孙永科;杨玉艾
4.弓形虫SAG1、SAG3基因的克隆和复合基因SAG1/SAG3真核表达重组质粒的构建 [J], 陈晓燕;马济宏
5.新城疫病毒(NDV)HN基因真核表达重组质粒的构建 [J], 仲大莲;余为一;刘兢;李向明;郭霄峰
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鸡新城疫病毒F48E9的纯化及其HN基因片段的原核表达的开题报告

鸡新城疫病毒F48E9的纯化及其HN基因片段的原核表达的开题报告1.研究背景鸡新城疫病毒（Newcastle disease virus, NDV）是一种单股负链RNA病毒，属于副粘液病毒科，是家禽生产中的重要病原体之一。

该病毒对家禽健康和养殖业产生了重大的经济影响。

目前，NDV的防疫主要以疫苗为主，但是由于NDV的致病性变异性和细胞内复制和转录机制的特殊性，NDV疫苗的研究和开发一直面临着很大的挑战。

因此，进一步了解NDV的分子机制和筛选高效的疫苗毒株是很有必要的。

2.研究内容本研究的主要研究内容是将鸡新城疫病毒F48E9分离、纯化，并通过PCR扩增其HN基因片段，利用原核表达系统进行HN基因的表达。

2.1 病毒的分离和纯化首先，从病鸡的病变组织中收集NDV病毒粗提物，采用蔗糖密度梯度离心法进行纯化。

然后，通过电镜观察和SDS-PAGE电泳分析确定NDV的纯度和完整性。

2.2 HN基因片段扩增和构建表达载体根据NDV的基因组序列，设计HN基因片段的引物并通过PCR扩增。

PCR产物经过酶切后与表达载体pET-28a(+)连接，构建HN基因的原核表达载体pET-28a(+)-HN。

2.3 原核表达和纯化将重组质粒pET-28a(+)-HN转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，诱导蛋白表达。

通过亲和柱层析法进行蛋白纯化，并通过SDS-PAGE电泳分析蛋白纯度和完整性。

3.研究意义本研究能够通过分离和纯化NDV病毒在表达的HN基因，探究其在病毒复制和感染中的作用和机制，同时得到高效的HN基因表达系统，为进一步筛选高效NDV疫苗毒株提供参考。

此外，本研究方法还可用于NDV基因工程药物的研究开发及制备。

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新城疫病毒Ｆ８９和Ｌｏａ株４株ＥａＳｔ
Ｆ基因在Ｂｃｔ— ａａ— Ｂｃ昆虫杆状病毒系统中的表达ｏ
袁萍，闫丽辉冉多良。刘培欣，，，闻晓波，曹殿军
（．中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，医生物技术国家重点实验室，尔滨１００；．疆农业大学动物１兽哈５０１２新医学院，鲁木齐乌８０５）３０２
ｏｆＣＡＡＳ，Ｈａｂｎ，５０１．ｏｌｇｆＡｎｍａｄｃｎ，Ｘｉｊｎｒｃｌｕａｉｅｓｔｒｉ１００；２ＣｌｅｏｉｌＭｅｉｉｅｅｎｉｇＡｇｉｕｔｒｌＵｎｖｒｉａｙ，
Ｕｒｍｑ，３０５ｕｉ８０２）Ａｂｓｒｃ：Ｆｅｅｏｆｓｒｉ８ａｄｓｒｉｏｔｆｎｗｃｓｌｓａｅｖｒｗｅｅｎｅｔｄｎｏｈｔａｔｇｎｔａｎＦ４Ｅ９ｎｔａｎＬａＳａｏｅａｔｅｄｉｅｓｉｕｓｒｉｓｒｅｉｔｔｅｔａｎｆｒｖｃｏｒｐｓＢａＨＴＡｔｃｓｒｃｔｒｃｒｓｅｅｔＦａｔｃｏｏｎｔｕｔｗｏｅｏｍｂｎａｔｅｔｒｐｓＢａＨＴ— ８ＦｎｄＦａｔｉｎｖｃｏｓ（ＦａｔｃＦ４ａｐｓ —
ＹＵＡＮｎｇ，ＹＡＮ — ，ＲＡＮｏｌｎ，ＰｉＬｉｈｕｉＤｕ —ｉｇａ
ＬＵｅｘｎ，Ｅａ — ｏ，ＡＯＤｉ — ｎＩＰｉｉＷＮＸｉｂＣａｊ — ｏｎｕ
（１．ＮａｉａｙＬａｏｒｔｙｏｔｒｎａｙＢｉｔｃｏｏｇＨａｂｎＶｅｅｉａｙＲｅｅｒｈＩｔｔｔｔｏｎｌＫｅｂａｏｒｆＶｅｅｉｒｏｅｈｎｌｙ，ｒｉｔｒｎｒｓａｃｎｓｉｕｅ
实ＮＥ株和Ｌｏａ的Ｆ蛋白均获得正确表达，表达的重组Ｆ蛋白分子量约５Ｄ，明在昆虫细胞ＤＶＦ。ａＳｔ株所６ｋ证内表达并部分糖基化，有良好的免疫原性，表达Ｆ基因并建立适合国内应用的ＥＩＡ诊断方法奠定了基础。具为ＬＳ关键词：新城疫病毒；Ｆ基因；组杆状病毒；蛋白表达重中图分类号：Ｑ７６８文献标识码：Ａ
ＥｘｒｓｉｎｏｓｏｏｅｎＧｅｅｏｗｃｓｌｓａｅＶｉｕｐｅｓｏｆＦｕｉｎＰｒｔｉｎｆＮｅａｔｅＤｉｅｓｒｓ
Ｆ４Ｅ９ａｄＬａＳｔｎＢａ。ｏ－ｃＢａｕｏｉｕｙｔｍ８ｎｏａｉｃ－ ’ ｔＢａｃｌｖｒｓＳｓｅ
Ｂｃ — ａ，ｒｓｅｔｅｙｏｉｉｅｒｃｍｂｎｎｓｗｅｅｓｒｅｅｎＩＡＭＰｃｌｒｆｅｒｎｆｒ — ａＨＴＬＦ）ｅｐｃｉｌ．ＰｓｔｖｅｏｉａｔｒｃｅｎｄｉｖＢ／ｕｔｅａｔｒｔａｓｏｍａｕ
摘
要：将新城疫病毒（Ｅ株和Ｌｏａ株）Ｆ。ａＳｔＦ基因插入至杆状病毒转移载体ｐａｔａ州ＨＴＡ中，别构建ＦｓＢｃ分
重组质粒ｐａｔａＨＴＦ８ｐａｔａＨＴＬＦ然后转化ＥｃｌＤＨ５，Ｌ／ＦｓＢｃ－４Ｆ，ＦｓＢｃ — ａ，．ｏｉａ以ＢＡＭＰ平板筛选阳性重组子并测序。测序正确后转化至ＥｃｉＨ１Ｂｃ受态细胞中，抗性培养和蓝白斑筛选，选出白色菌落后，取重组．ｏｌＤ０ａ感经筛提Ｂｃｄ（别命名为ｒａｍｉ、４ａｍｉｓ分ＢｃｄＦ８－Ｆ和ｒａｍｉＬＦ，ＰＲ鉴定正确后，阳性重组Ｂｃｄ转染Ｓ９昆虫细Ｂｃｄａ）经Ｃ－将ａｍｉｓｆ胞。在昆虫细胞内，重组Ｂｃｄ经复制，达，配，成重组杆状病毒，ＳＳＰＥ和Ｗｅｔｎｂｏ分析，ａｍｉ表装形经Ｄ－ＡＧｓｅ — ｌｒｔ证
ｔｏｎｔｃｌＤＨ５ｎｄｆｒｈｅｒｄｎｔｆｅｔｅｔｉｔｏｎｄｉｎｉｏＥ．ｏａａｕｔｒｗｅｅｉｅｉｉｄｗｉｈｒｓｒｃｉｎｅｏｎｕｌａｅｉｅｔｏｎｃｅｓｓｄｇｓｉｎａｄＰＣＲｎｄａｗｅｅｓｑｕｎｃｄＴｏｅｅａｅｅｏｒｅｅｅ．ｇｎｒｔｒｃｍｂｉａｂｃｄｎｎｔａｍｉｓ，ｔｅｈｐｏｉｉｅＦａｔｃｓｔｖｐｓＢａＨＴ— ８Ｆ，ｐｓＢａＨＴ— ＦＦ４ＦａｔｃＬａｗｅｅｔａｓｏｍｅｎｏＥ．ｃｌｒｒｎｆｒｄｉｔｏｉＤＨ１Ｂａ．Ｗｈｉｅｂａｔｒａｃｏｉｓ０ｃｔｃｅｉｌｏｌｎｅｗｅｅｓｌｃｅａｐｓｔｖｒｃｍｂｉａｒｅｅｔｄｓｏｉｉｅｅｏｎｎｔ
维普资讯
新疆农业大学学报
２０，９２：～８０６２（）５
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