细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell)

迁移试验（cell migration assay）之马矢奏春创作
试验介绍细胞迁移与侵袭试验将Transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,凹凸层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究的细胞种在上室内,因为聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,应用不合孔径和经由不合处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究.试验步调：1材料准备：可摄影显微镜,Transwell小室,孔径8μm,没包被胶的(Coster和Corning公司的也较经常应用),Transwell迁移试验的细胞培养板24孔板.细胞培养板应当与采办的Transwell小室相配套,BD公司的Matrigel,无血清DMEM,(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基,DMEM 完全培养基,1640完全培养基（也可加到20%血清）,无菌PBS,棉签,胰酶,4%多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液（0.1%（g/ml）PBS结晶紫）2步调和流程 2.1基质胶铺板：用BD公司的Matrigel 1：8（按照细胞产生mmp的量来决定）稀释,包被Transwell小室底部膜的上室面,置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶.应用提高行基底膜水化.2.2制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h,进一步去除血清的影响.但这一步其实不是必须的.②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,（用PBS洗1－2遍）,用含BSA的无血清培养基重悬.调解细胞密度至5×105/ml.2.3接种细胞①取细胞悬液100µl参加Transwell小室.②24孔板下室一般参加600µl含20%FBS的培养基,特别留心的是,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产朝气泡,下层培养液的趋化传染感动就减弱甚至消掉落了,在种板的时刻要特别留心,一旦消掉气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板.③培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭才能而定）.24h较罕有,时间点的选择除了要推敲到细胞细胞
侵袭力外,处理成分对细胞数目标影响也不成忽视.2.4成果统计直接计数法,“贴壁”细胞计数,这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后,可以附着在膜的下室侧而不会掉落落到下室里面去,经由进程给细胞染色,可在镜下计数细胞.掏出Transwell小室,弃去孔中培养液,用无钙的PBS洗2遍,甲醇固定30分钟,将小室适当风干.0.1%结晶紫染色20 min,用棉签轻轻擦掉落落上层未迁移细胞,用PBS洗3遍.400倍显微镜下随即五个视野不雅察细胞,记数.
试验材料
（1）Transwell chamber: 24-well, 8.0-μm pore membranes (Corning)
（2）细胞培养相关试剂：无血清培养基,10％血清培养基,PBS,0.02％EDTA
（3）固定液：甲醇
（4）染色液：Giemsa染液
（5）封片剂：中性树胶
（6）其他：小镊子,棉棒,载玻片,盖玻片
操纵步调
（1）所有细胞培养试剂和Transwell chamber 放在37℃温育；（2）待测细胞培养至对数成长期,消化细胞,用PBS和无血清培养基先后洗涤一次,用无血清培养基悬浮细胞,计数,调解浓度
为2×105 /ml；
（3）鄙人室（即24孔板底部）参加600－800μl 含10％血清的培养基,上室参加100－150μl细胞悬液,中断在孵箱培养
24小时；
（4）用镊子当心掏出chamber,吸干上室液体,移到预先参加约800μl甲醇的孔中,室温固定30分钟；
（5）掏出chamber,吸干上室固定液,移到预先参加约800μl Giemsa染液的孔中,室温染色15－30分钟；
（6）轻轻用清水冲洗浸泡数次,掏出chamber,吸去上室液体,用湿棉棒当心擦去上室底部膜概略上的细胞；
（7）用小镊子当心揭下膜,底面朝上晾干,移至载玻片上用中性树胶封片；
（8）显微镜下取9个随机视野计数,统计成果.
留心事项
（1）按照待测细胞体积大小选择合适孔径的chamber.经常应用的为8.0-μm孔径（如AGS细胞）,假如细胞体积较大可以推敲用10-μm孔径；
（2）按照待测细胞的迁移才能强弱调解细胞数和迁移时间.常规24-well chamber接种细胞数约为2≈5×104/well,迁移时间12≈36小时；
（3）因为Corning公司的24-Transwell内含12个自力的chamber,为了避免操纵污染,每次试验可预先另准备一块24孔通俗培养板（Corning）；
（4）假如细胞迁移才能较弱,下室液体可用3T3细胞无血清培养24小时获得的上清加50μg/ml FN（Fibronectin）,具体可查阅相关文献；
（5）细胞悬液参加膜中间,尽量包管液面程度；
（6）固定染色擦洗时动作当心,避免擦去膜底面的细胞.但必定要充分擦净膜概略上未迁移的细胞,以免影响读数.尤其是膜周边上可用细牙签或小镊子缠上湿棉花擦洗,但要当心避免将膜戳破；
（7）Chamber和膜上都无法标识表记标帜,操纵时应当心避免混淆试验组和比较组；
（8）充分晾干,避免残留水分导致镜下聚焦不一致.
细胞侵袭试验（cell invasion assay）
试验材料
（1）Matrigel (BD 5mg/ml),-20℃保管
（2）其余材料同迁移试验
操纵步调
（1）Matrigel在4℃住宿融化；
（2）用4℃预冷的无血清培养基稀释Matrigel至终浓度1mg/ml,冰上操纵；
（3）在chamber上室底部中间垂直参加100μl稀释后的Matrigel,37℃温育4－5小时使其干成胶状；
（4）后续步调同迁移试验（1-8）.
留心事项
（1）Matrigel在过高或过低的温度均易凝固,是以操纵所需枪头和离心管应提前在4℃预冷；
（2）铺胶时包管液面程度,胶的厚度平均一致,切勿产朝气泡；（3）其他留心事项同迁移试验.
其他
Transwell做肿瘤侵袭试验的具体步调
(1) 基质胶准备：将冻存于－80度冰箱的BD matrigel 4渡住宿（24h）,变成液态；（2）取300ul无血清培养基,参加60ul（或50ug/每室）Matrigel ,混匀,（4℃操纵,最好在冰浴上）,参加上室各100ul（3个室）；放入37℃培养箱中,孵育4-5h （>5h）；此间经常不雅察,当消掉“白色层”时,说明已经变成固态.注释：无血清培养基和基质胶按1：5稀释,每孔加50ul,在37℃培养箱中1-2h.（3）消化细胞,无血清培养基洗3次,计数,配成细胞悬液；（4）用无血清培养基洗 Matrigel洗1次；每孔参加100ul细胞悬液；（5）下腔室中参加500ul含有20％FBS前
提培养基；（6）37℃培养箱中,孵育20-24h；（7）掏出transwell用PBS洗2遍, 5%戊二醛固定,4℃；（8）参加结晶紫（0.1%）染色或Giemsa染色（5－10min）,室温0.5h,PBS洗2遍,用棉球擦去上概略细胞,显微镜下不雅察.
迁移试验transwell在24孔板中浸泡1小时；消化细胞,无血清培养基洗 2 次,计数,配成细胞悬液,每孔参加100ul细胞悬液；加药刺激；下腔室中参加前提培养基或其他刺激因子；37℃培养箱中,孵育 20-24h；掏出 transwell用 PBS洗2遍,5% 戊二醛固定, 4℃；PBS洗2遍,参加结晶紫（0.1%）染色,室温0.5h,PBS 洗 2 遍,用棉球擦去上概略细胞,显微镜下不雅察计数10 摄影,记录.侵袭试验取 300ul 无血清培养基 ,参加 30ul （或 50ug/ 每室） Matrigel ,混匀,（ 4 ℃ 操纵,最好在冰浴上）,参加上室各 100ul （ 3 个室）；放入37 ℃ 培养箱中,孵育 4-5h （ >5h ）；消化细胞,无血清培养基洗 3 次,计数,配成细胞悬液；用无血清培养基洗 Matrigel 洗 1 次；每孔参加 100ul 细胞悬液；下腔室中参加 600ul 无血清前提培养基；37 ℃ 培养箱中,孵育 20-24h；掏出 transwell 用 PBS 洗 2 遍, 5% 戊二醛固定, 4 ℃ ；PBS 洗 2 遍,参加结晶紫（ 0.1% ）染色,室温 0.5h , PBS 洗 2 遍,用棉球擦去上概略细胞,显微镜下不雅察
transwell小室是否可以频频应用,该若何消毒
用棉签轻轻擦去胶和背面细胞,清水冲洗,超声清洗,低挡,30min,清水3×5min,蒸馏水3×5min,室温凉干,用前紫外线小室正面3h,背面6h,微波,低火10min×2,效果很好.。