高效液相色谱法检测克伦特罗的探讨

高效液相色谱法检测克伦特罗的探讨
建立高效液相色谱法检测动物性食品中克伦特罗残留量的方法。

方法样品经预处理后，分别以甲醇+水（45+55）和乙腈+0.02mol/L乙酸铵（30+70）作为流动相对样品进行检测。

结果以乙腈+乙酸铵作为流动相对样品进行检测有较好的峰形，回收率为79.5%～86.4%,浓度在0.50～5.0mg/L范围内的线性为0.9999，检出限为0.05mg/L。

结论用乙腈-乙酸铵为流动相检测克伦特罗的方法是快速、准确可靠，灵敏度高的方法，适合一般基层单位使用推广。

克伦特罗俗称“瘦肉精”，它是一种β肾上腺素，其制剂常用盐酸盐（即盐酸克伦特罗），它最早在临床上作为平喘药应用。

20世纪80年代初，美国氰胺公司意外发现将一定量的克伦特罗加入到饲料中，可加速动物生长，并增加瘦肉率，从而将其广泛应用于养殖业，随后我国也将此方法用于养殖业。

但克伦特罗进入机体后具有半衰期长，代谢和排泄缓慢的特点，其性质稳定不易破坏，人若食用含瘦肉精残留量过高的肉制品后，15min到6h内可出现肌痛、心动过速、头晕目眩等中毒症状。

近几年来，国内外接连发生人食用有瘦肉精残留的肉制品中毒事件，因此引起人们高度的关注。

国家标准GB/T5009.192-2003动物性食品中克伦特罗残留量的测定[1]中的检测方法有气相色谱-质谱法（GC-MS）、高效液相色谱法（HPLC）和酶联免疫法（ELISA）。

GC-MS法是定性、定量的最佳手段，但仪器昂贵，一般基层单位都没有此类仪器，不利于推广使用；而ELISA法只作为初筛方法，不能定量；一般的基层单位都有HPLC，所以选用HPLC法来进行检测较为适用，从而建立快速、准确、有效的检测方法。

1 材料与方法
1.1样品的选择
克伦特罗进入机体后，主要分布于肝脏。

因此，肌肉中的含量较肝脏、肾脏低[2]。

因此从市场上采取来自不同猪的肝与肾各2份。

1.2仪器与试剂
HP 1100高效液相色谱仪配VWD检测器，
盐酸克伦特罗标准（BW 3815，国家标准物质研究中心生产）
甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、乙酸铵（分析纯）、去离子水
其余试剂都是分析纯如：0.1mol/L高氯酸、异丙醇、乙酸乙酯、0.1mol/L磷酸二氢钠
弱阳离子交换柱（LC-WCX）（SUPELCO）
1.3样品前处理
按照国家标准GB/T 5009.192-2003动物性食品中克伦特罗残留量的测定[1]的规定用0.1mol/L高氯酸对样品进行提取、再用异丙醇+乙酸乙酯进行萃取，蒸干，再用0.1mol/L磷酸二氢钠定容，最后用LC-WCX净化后等待上机。

1.4仪器条件
色谱柱：Venusil MP C18，4.6×150mm 5µm。

流动相：分别是甲醇+水（45+55）、乙腈+0.02mol/L乙酸铵（30+70）
波长：243nm（盐酸克伦特罗在210、243nm处有较大紫外吸收，由于在210nm处流动相吸收较大而干扰样品的检测，故选择243nm作为检测波长[3]。

）
流速：1mL/min
进样量：20µL
1.5标准曲线
称取盐酸克伦特罗（纯度99.1）0.010g用甲醇定容至100ml，再稀释成0，0.50，1.00, 2.00, 3.00, 5.00mg/L的标准系列。

2 测定结果分析
2.1流动相的选择
近几年来许多人对克伦特罗的检测进行研究，如高燕红等用乙腈+0.02mol/L乙酸铵（30+70）做为流动相进行检测[4]，又如金雁等以乙腈：0.02mol/LKH2PO4+30μmol/LEDTA-2Na为流动相梯度洗脱检测[5]，而国标中规定以甲醇+水（45+55）为流动相进行检测。

由于金雁等用的是梯度洗脱检测，有些仪器并不能实现，现分别以甲醇+水（45+55）和乙腈+0.02mol/L 乙酸铵（30+70）作为流动相对标准进行检测加以比较。

结果以甲醇+水（45+55）为流动相，在12.7min出现色谱峰但峰形并不理想，见图1；而以乙腈+0.02mol/L乙酸铵（30+70）为流动相，标准在6.25min就出现色谱锋且峰形理想，如图2。

因此选择乙腈+0.02mol/L乙酸铵（30+70）做为流动相，可满足检测要求。

图1. 图2.
2.2方法的精密度试验
连续6次测定浓度为0.50mg/L的盐酸克伦特罗标准溶液，峰面积分别为56.875、56.934、56.326、57.247、57.019、57.135,测得相对标准偏差为0.57%，符合分析实验的要求。

2.3回收率实验
取1份阴性样品（即未检出含盐酸克伦特罗的样品）分别加入2种浓度的盐酸克伦特罗标准，其回收率为79.5%～86.4%(表1)。

3 结论
用乙腈+0.02mol/L乙酸铵（30+70）作为流动相，比用甲醇+水（45+55）为流动相有更好的峰形，这与色谱柱填充物各不相同有关，乙腈比甲醇更适用于此色谱柱，且检测速度更快，当有大量样品时此方法可大大提高检测效率，因此选用乙腈+乙酸铵做为流动相进行检测，（但乙腈比甲醇的毒性要大，可根据色谱柱的性质从中选择较好的又安全的流动相）；用此方法对标准进行检测，在0.50～5.0mg/L浓度范围内的相关系数为0.9999，检出限为0.05mg/L，能满足实验分析要求；但用此方法对样品进行检测，其回收率在79.5%～86.4%之间，相对较低，是由于样品预处理要经过数次提取、蒸发、萃取、净化等造成的，所以在样品预处理时应尽量避免损失；由于本仪器没有配备二极管阵列检测器（DAD）不能对样品谱图进行扫描，对样品有无其它杂质干扰较难判断，易有假阳性产生，当检出阳性样品时，使用不同的色谱柱进行比较可较好的消除假阳性的机率，若配有DAD检测器就可直接对样品谱图进行扫描确认（这是最好的定性方法）。

因此用乙腈-乙酸铵为流动相检测克伦特罗的方法是快速、准确可靠，灵敏度高的方法，适合一般基层单位使用推广。

4 参考文献
[1] 中华人民公和国卫生部.GB/T 5009-2003 食品卫生检验方法理化部分[S].北京：中国标准出版社,2004.
[2] 孙丰梅，郑志新，赵瑞平.瘦肉精与肉类食品安全[J].河北北方学院学报（自然科学版），2005，21（6）：63.
[3]刘平年.HPLC-DAD法测定猪肝中的盐酸克伦特罗[J].化学分析计量，2005，14（5）：34.
[4]高燕红，梁春穗，鲁琳.食物中毒样品中克伦特罗检测方法的比较[J].中国食品卫生杂志，2005，17（2）：167-170.
[5]金雁，姜莉，刘宁等.高效液相色谱法同时测定猪肉中克伦物罗、沙丁胺醇、土霉素、四环素残留量的研究[J].现代仪器，2007，2：65-67.。