动物检验检疫技术学习资料

8、眼睛
❖ 眼结膜表面用拭子轻轻擦拭后，放在灭菌的30% 甘油盐水缓冲保存液中送检。
❖ 有时，也采取病变组织碎屑，置载玻片上，供显 微镜检查。
9、小家畜及家禽
将整个尸体包入不透水塑料薄膜、油纸或油布中， 装入木箱内，送往实验室。
小动物,禽和鱼等可整体送检。在距离实验室很近, 又有隔离运输条件时,也可将发病小动物直接送检。

2、微生物分类鉴定中的现代方法
（1）核酸分析鉴定微生物遗传型 特点：直接比较不同微生物之间基因组的差异
主要方法
DNA的碱基组成(G+C mol%) 核酸的分子杂交法
（2）应用计算机鉴定微生物学
计算机鉴定微生物基于数值分类法 即通过广泛比较分类单位的性状特征，然后计算
它们之间的相似性，再根据相似性的数值划分类 群的一种分类方法。
三、细菌的鉴定
生物分类的传统指标 形态学特征 生理学特征 生态学特征
1、微生物分类鉴定的经典方法 纯培养的病原微生物可进行系统鉴定。 系统鉴定就是通过病原菌的形态结构、生长特征、
抗原性和病原性等检测，并用已知标准血清确定 分离细菌的属、种和型。
微生物鉴定程序通常是根据其形态生长、生化特 征等定种，最后根据抗原的免疫血清检查定型
个菌落,有利于从含有多种细菌的标本中分 离出目的菌。
A 分区划线法
首先将接种环灭菌后,沾取标本均匀涂 布于平板培养基边缘一小部分(第一 区),将接种环火焰灭菌,待冷却后只通 过第一区3-4次后连续划线(为第二区), 依次可共划线3-5区,每一区细菌数可 逐渐减少,直到分离出单个菌落为止.
B 连续划线法
②组织病理学检查样品的采集
采集包括病灶及临近正常组织的组织块，立即放入10倍于 组织块的10%福尔马林溶液中固定。组织块厚度不超过 0.5cm，切成1cm2～2cm2 。组织块切忌挤压、刮摸和用 水洗。如作冷冻切片用，则将组织块放在0℃～4℃容器中， 尽快送实验室检验。
3、液体病料
❖ 采集胆汁、脓、粘液或关节液等样品时，用烫烙法消毒采样 部位，用灭菌吸管、毛细吸管或注射器经烫烙部位插入，吸 取内部液体材料，然后将材料注入灭菌的试管中，塞好棉塞 送检。也可用接种环经消毒的部位插入，提取病料直接接种 在培养基上。
进行。试验时, 须注意实验动物的种别,年龄与体 重,试验材料和剂量,感染途径以及其它因素。 通常用来表示微生物毒力大小的单位有：
最小致死量 (M.L.D): 能使特定动物感染后,在一定时限内 发生死亡的最少活的微生物量或毒素量
半数致死量 (LD50 )： 在一定时限内能使半数动物发生感 染死亡所需的活的微生物量或毒素量。
从组织、脑脊液、血液、眼部、水泡液分离到 任何病毒均可认为具有高度病原学意义。尿液 中检出病毒也具有病原学诊断意义
从呼吸道、阴道、肠道标本分离病毒，需要考 虑这些病毒是否有无症状携带者和长期排毒者。
第四节 其它病原微生物分离及鉴定
31
螺旋体
2
立克次氏体
3
支原体
4
衣原体
一、螺旋体
1、形态结构及染色特征 螺旋体是一类菌体细长、柔软、
3、污染病料抑菌培养 如果病料被杂菌污染严重,则需采用一些对病原菌 无害,但对杂菌有杀灭或抑制作用的方法,以抑制杂 菌生长。
4、集菌处理 有些病料含菌太少,则应先作集菌处理,然后接种, 以提高检出率,其集菌方法有离心法和过滤法.
第二节 细菌分离及鉴定
一、细菌的分离与接种
1、平板划线接种法 通过平板划线后,可使细菌分散生长,形成单
第三节 病毒分离及鉴定
一、检材的采集与处理
❖ 发病初期从感染部位采集足量标本，低温运送、保存， 尽快送检，分离培养前去除标本中的沉渣、细菌、真 菌和毒性物质等，必要时需浓缩、提纯。
二、病毒的分离及鉴定
病毒检验的大致程序：临床标本→分离培养→初步鉴 定→最后鉴定
病毒分离培养方法：包括组织培养、鸡胚接种、动物 接种
溶液，容器加塞封固。 3、病理组织学检验材料的保存 ❖ 将采取的器脏组织块放入10％福尔马林溶液或95
％酒精中固定，固定液的用量为送检病料的10倍 以上。
❖ 为防病料冻结，可将固定好的组织块取出，保存 于甘油和10％福尔马林等量混合液中
三、病料的记录、包装和运送
1、送检样品的记录
❖ 送往实验室的样品应有一式三份的送检报告，一 份随样品送实验室，一份随后寄去，另一份备案
❖ 供显微镜检查的脓、血液及粘液抹片的制备方法:先将材料置 玻片上，再用一灭菌玻棒均匀涂抹或另用一玻片推抹。组织 块、致密结节及脓汁等亦可在两张玻片中间，然后沿水平面 向两端推移。用组织块作触片时，持小镊将组织块的游离面 在玻片上轻轻涂抹即可。
4、皮肤
病料直接采自病变部位，如病变皮肤的碎屑、未破裂水泡 的水泡液、水泡皮等。采取病变局部的皮肤(10cm×10cm 左右)，放入甘油盐水缓冲溶液中，或10％饱和盐水溶液 中，或10％福尔马林液中。
5、液体接种法
多用于普通肉汤,蛋白胨,水等液体培养基的接种 方法是接种环沾取菌种,倾斜液体培养基管,先在液 面与管壁交界处研磨接种物(以试管直立后液体能 淹没接种物为准),然后再在液体中摆动2-3次接种 环,塞好棉塞后轻轻混合即可。
二、细菌的培养方法
需氧培养法 二氧化碳培养法 厌氧培养法
（1）形态学特征 常用的形态学特征有 ❖ 培养特征 ❖ 细胞形态 ❖ 染色特性 ❖ 特殊的细胞结构 ❖ 运动性等
（2
❖ 营养类型 ❖ 与氧的关系 ❖ 对温度的适应性 ❖ 对pH的适应性 ❖ 对渗透压的适应性 ❖ 代谢产物 ❖ 细菌毒力
细菌毒力
病原性细菌致病能力的强弱程度称为毒力。 测定微生物毒力大小系用递减剂感染易感动物来
（3）血样种类 ①全血样品
进行血液学分析，细菌、病毒或原虫培养，通常 用全血样品，样品中加抗凝剂。
抗凝剂可用0.1%肝素、阿氏液或4.0~5%枸橼酸 钠液。
采血时应直接将血液滴入抗凝剂中，并立即连续 摇动，充分混合。也可将血液放入装有玻璃珠的 灭菌瓶内，震荡脱纤维蛋白。
②血清样品
❖ 进行血清学试验。血液中不加抗凝剂，血液在室温下静置 2h～4h，待血液凝固，有血清析出时，用无菌剥离针剥离 血凝块，然后置4℃冰箱过夜，待大部分血清析出后取出 血清，必要时经低速离心分离出血清。
（2）瘤胃内容物采集 反刍动物在反刍时，与食团从食道逆入口腔时，立即开口 拉住舌头，另一只手深入口腔即可取出少量的瘤胃内容物。
7、呼吸道
❖ 应用灭菌的棉拭子采集鼻腔、咽喉或气管内的分 泌物，蘸取分泌物后立即将拭子浸入保存液中， 密封低温保存。
❖ 常用的保存液有pH7.2～7.4的灭菌肉汤或磷酸盐 缓冲盐水。一般每支拭子需保存液5mL。
3、病毒的初步鉴定依据 ❖ 动物感染范围及潜伏期、对鸡胚的敏感性、细
胞形态变化类型、红细胞吸附、病毒干扰现象、 血凝性质、理化性质（核酸类型测定、大小形 态、乙醚敏感试验、耐酸试验）
4、病毒的最后鉴定依据 ❖主要是血清学方法（中和试验、补体结合试验、 血凝抑制试验）和分子生物学方法。
5、分离病毒的病原学意义
2、送检样品包装和运送
❖ 所采集的样品以最快最直接的途径送往实验室。
❖ 24h内的放在4℃左右的容器中运送。24h内不能 运送的，把样品冷冻，并以此状态运送
四、病料的处理
1、性状观察
采集的病料，在接种培养前,应对其性状进行观察，如是否 脓性带血或腐败，有何异味,并作记录
2、涂片
各种病料在分离培养前均应制备涂片,作革兰氏染色,镜检,以 了解细菌的形态,染色特性,并大致估计其含菌量。通过肉眼 观察和显微镜下看到的结果,对病料中可能含有的病原菌作 最初步的估价。
首先将标本均匀涂布于平板培养基边 缘一小部分,然后由此开始，在培养 基表面自左向右连续划线并逐渐向下 移动，直到下边缘。
2、斜面接种法
采用该法目的是进行纯培养。其 方法是从平板分离培养物上用接 种环挑取单个菌落或者是取纯种, 移种至斜面培养基上,先从斜面底 部自下而上划一条直线,再从底部 开始向上划曲线接种,尽可能密而 匀,或者直接自下而上划曲线接种。
小鼠
猪前腔静脉采血
（2）采血方法
❖ 对动物采血部位的皮肤先剃毛(拔毛)，75%的酒 精消毒，待干燥后采血；
❖ 采血可用针管、针头、真空管或用三棱针穿刺， 将血液滴到开口的试管内。
❖ 禽类等的少量血清样品的采集，可用塑料管采集。 用针头刺破消毒过的翅静脉，将血液滴到直径为 3mm～4mm的塑料管内，将一端封口。
二、病料的保存
1、细菌检验材料的保存 将采取的器脏组织块，保存于灭菌液体石蜡、饱
和氯化钠溶液或30％甘油缓冲盐水溶液中，容器 加塞封固。液体装在封闭的毛细管或试管运送。 寄送肠道时，先清除肠内粪团，用灭菌盐水清洗 后，置于盛有上述保存剂的试管中即可。粪便可 移入灭菌容器中寄送。
2、病毒检验材料的保存 ❖ 将采取的器脏组织块，保存于50％甘油缓冲盐水
Contents
检验检疫样品 细菌分离及鉴定 病毒分离及鉴定
其它病原微生物分离及鉴定
寄生虫检查 现代生物技术的应用
（三）病料的采取方法
1、血液 （1）采血部位 ❖ 大的哺乳动物可选用颈静脉或尾静脉采血，也可采胫外静
脉和乳房静脉血。 ❖ 毛皮动物小量采血可穿刺耳尖或耳壳外侧静脉，多量采血
可在隐静脉采集，也可用尖刀划破趾垫0.5cm深或剪断尾 尖部采血。 ❖ 啮齿类动物可从尾尖采血，也可由眼窝内的血管丛采血； ❖ 兔可从耳背静脉、颈静脉或心脏采血。 ❖ 禽类通常选择翅静脉采血，也可通过心脏采血。
❖ 主要传播途径是接触传播。钩端螺旋体具有较强的侵袭力， 能通过皮肤微小伤口、眼结膜、鼻或口腔粘膜而侵入人体。
弯曲呈螺旋状、能活泼运动的原 核单细胞微生物、它的基本结构 于细菌类似。 革兰氏染色阴性，但大多不易着 色。在普通显微镜下难以看到， 常用镀银染色法染色。
2、生物学特性
螺旋体多为需氧菌，对热、酸、干燥和一般消毒 剂均敏感。
钩端螺旋体是唯一可用人工培养基培养的螺旋体。
电镜下的钩端螺旋体
3、致病性
5、肠内容物或粪便
肠道只需选择病变最明显的部分，将其中的 内容物弃去，用灭菌生理盐水轻轻冲洗；也可烧 烙肠壁表面，用吸管扎穿肠壁，从肠腔内吸取内 容物，将肠内容物放入盛有灭菌的30%甘油盐水 缓冲保存液中送检。或者，将带有粪便的肠管两 端结扎，从两端剪断送检。
6、胃液及瘤胃内容物
（1）胃液采集 胃液可用多孔的胃管抽取。将胃管送入胃内，其外露端接 在吸引器的负压瓶上，加负压后，胃液即可自动流出。
10、脑、脊髓 （1）全脑、脊髓的采集
采取脑、脊髓做病毒检查，可将脑、脊髓浸入 30%甘油盐水液中或将整个头部割下，包入浸过 消毒液的纱布中，置于不漏水的容器内送往实验 室。
（2）脑、脊髓液的采集
①采样前的准备：专用穿刺针 ②采样方法：
颈椎穿刺 、腰椎穿刺 ③采样数量：
大型动物颈部穿刺一次采集量35mL～70mL， 腰椎穿刺一次采集量15mL～30mL。
2、一般组织（包括内脏组织）
（1）采样方法
用常规解剖器械剥离死亡动物的皮肤，体腔用 消毒的器械剥开，所需病料按无菌操作方法从新 鲜尸体中采集。剖开腹腔后，注意不要损坏肠道。
（2）采样种类
①病原分离样品的采集
用于细菌分离的样品的采集，首先以烧红的刀片烫烙脏器 表面，在烧烙部位刺一孔，用灭菌后的铂耳伸入孔内，取 少量组织或液体，作涂片镜检或划线接种于适宜培养基上
❖ 在不影响检验要求原则下可因需要加入适宜的防腐剂。
❖ 做病毒中和试验的血清避免使用化学防腐剂(如硼酸、硫 柳汞等)。若需长时间保存，则将血清置20℃以下保存， 但要尽量防止或减少反复冻融。
❖ 样品容器上贴详细标签。
③血浆的采集
采血试管内先加上抗凝剂，血液采完后，将试管 颠倒几次，使血液与抗凝剂充分混合，然后静止， 待细胞下沉后，上层即为血浆。
3、倾注培养法
此法适用于乳汁和尿 液等液体标本的细菌 计数。其方法是取原 标本经适当稀释，置 于无菌平皿内,倾入 已融化并冷至50℃ 左右的培养基约立即 混匀待凝固后倒置培 养。
4、穿刺接种法
多用于双糖,明胶等具有高层的培养基进行接种 方法是用接种针挑取菌落或培养物,由培养基中
央直刺到距管底约0.3-0.5cm处.然后沿穿刺线退 出接种针； 若为双糖等含高层斜面的培养基则光穿刺高层 部分,退出接种针后直接曲线接种斜面部分。