PCR的基本步骤及注意之欧阳数创编

DNA聚合酶（DNApolymerase I）最早于1955年发现，而较具有实
fragment of E. Coli则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性,因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。

现今所使用的酶(简称Taq polymerase), 则是于1976年从温泉中的
细菌（Thermusaquaticus）分离出来的。

它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用则于80年代之后。

PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，
它是于1971年由 Dr. Kjell Kleppe提出。

他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。

而现今所发展出来的PCR则于1983由 Dr. Kary B. Mullis发展出的，Dr. Mullis当年服务于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。

Dr. Mullis 并于1985年与Saiki等人正式发表了第一篇相关的论文。

此后，PCR 的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。

随后PCR技术在生物科研和临床
应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。

Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。

PCR原理
DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。

双链DNA 在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。

在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。

因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物，DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

但是，DNA聚合酶在高温时会失活，因此，每次循环都得加入新的DNA聚合酶，不仅操作烦琐，而且价格昂贵，制约了PCR技术的应用和发展。

发现耐热DNA聚合酶Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性退火延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它
与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性退火延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

1.标准的PCR反应体系
10×扩增缓冲液10μl
4种dNTP混合物200μl
引物10～100μl
模板DNA 0.1～2μg
Taq DNA聚合酶2.5 μl
Mg2+ 1.5mmol/L
加双或三蒸水100 μl
PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即:
引物(PCR引物为DNA片段，细胞内DNA复制的引物为一段RNA链)、酶、dNTP、模板和缓冲液（其中需要Mg2+)。

引物有多种设计方法，与PCR在实验中的目的决定。

但基本原则相同
PCR所用的酶主要有两种来源：Taq和Pfu。

分别来自两种不同的噬热菌。

其中Taq扩增效率高但易发生错配。

Pfu 扩增效率弱但有纠错功能。

所以实际使用时根据需要必须做不同的选择
模板即扩增用的DNA，可以是任何来源，但有两个原则，第一纯度必须较高，第二浓度不能太高以免抑制缓冲液的成分最为复杂，除水外一般包括四个有效成分：缓冲体系，一般使用HEPES或MOPS缓冲体系；一价阳离子，一般采用钾离子，但在特殊情况下也可使用铵根离子；二价阳离子，即镁离子，根据反应体系确定，除特殊情况外不需调整；辅助成分，常见的有DMSO、甘油等，主要用来保持酶的活性和帮助DNA接触缠绕结构
2、PCR引物设计
PCR反应中有两条引物，即5′端引物和3′引物。

设计引物时以一条DNA单链为基准（常以信息链为基准），5′端引物与位于待扩增片段5′端上游的一小段DNA序列相
同；3′端引物与位于待扩增片段3′端的一小段DNA序列互补。

引物设计的基本原则
①引物长度：1530bp，常用为20bp左右。

②引物碱基：G+C含量以4060%为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。

ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。

③引物内部不应出现互补序列。

④两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3 ′端的互补重叠。

⑤引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70%，引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。

⑥引物3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是G和C。

⑦引物的5 ′端可以修饰。

如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列，包括起始密码子、终止密码子等。

v 引物设计软件
Primer Premier5.0 （自动搜索）*
vOligo6 （引物评价）
vVector NTI Suit
vDNAsis
vOmiga
vDNAstar
vPrimer3 （在线服务）
3、模板的制备
PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。

模板的取材主要依据PCR的扩增对象，可以是病原体标本如病毒、细菌、真菌等。

也可以是病理生理标本如细胞、血液、羊水细胞等。

法医学标本有血斑、精斑、毛发等。

标本处理的基本要求是除去杂质，并部分纯化标本中的核酸。

多数样品需要经过SDS和蛋白酶K处理。

难以破碎的细菌，可用溶菌酶加EDTA处理。

所得到的粗制DNA，经酚、氯仿抽提纯化，再用乙醇沉淀后用作PCR反应模板。

4、PCR反应条件的控制
①PCR反应的缓冲液提供合适的酸碱度与某些离子
②镁离子浓度总量应比dNTPs的浓度高，常用1.5mmol/L
③底物浓度 dNTP以等摩尔浓度配制，20～200umol/L
④TaqDNA聚合酶 2.5U（100ul）
⑤引物浓度一般为0.1 ～ 0.5umol/L
⑥反应温度和循环次数
变性温度和时间95℃，30s
退火温度和时间低于引物Tm值5 ℃左右，一般在45～55℃
延伸温度和时间72℃，1min/kb（10kb内）
Tm值=4(G+C) ＋2(A+T)
循环次数 :一般为25 ～ 30次。

循环数决定PCR扩增的产量。

模板初始浓度低，可增加循环数以便达到有效的扩增量。

但循环数并不是可以无限增加的。

一般循环数为30个左右，循环数超过30个以后，DNA聚合酶活性逐渐达到饱和，产物的量不再随循环数的增加而增加，出现了所谓的“平台期”。

DNA变性
退火
??延伸
Taq酶
现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，
即退火和延伸同时在60℃65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。

PCR检测
PCR反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。

荧光素（溴化乙锭，EB）染色凝胶电泳是最常用的检测手段。

电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。

但因为其简捷易行，成为了主流检测方法。

近年来以荧光探针为代表的检测方法，有逐渐取代电泳法的趋势。

PCR反应特点
特异性强
PCR反应的特异性决定因素为：
①引物与模板DNA特异正确的结合；
②碱基配对原则；
③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；
④靶基因的特异性与保守性。

其中引物与模板的正确结合是关键。

引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。

聚合酶合成反应的忠实性及TaqDNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确
度。

再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。

灵敏度高
PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克
(pg=1012)量级的起始待测模板扩增到微克(μg=6)水平。

能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；在细菌学中最小检出率为3个细菌。

简便、快速
PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性退火延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。

扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。

对标本的纯度要求低
不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。

可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。

1、预变性（Initial denaturation）
．
模板DNA完全变性与PCR酶的完全激活对PCR能否成功至关重要，建议加热时间参考试剂说明书，一般未修饰的Taq酶激活时间为两分钟。

2、循环中的变性步骤
循环中一般95℃，30秒足以使各种靶DNA序列完全变性，可能的情况下可缩短该步骤时间
变性时间过长损害酶活性，过短靶序列变性不彻底，易造成扩增失败。

3、引物退火（Primer annealing）
退火温度需要从多方面去决定，一般根据引物的Tm值为参考，根据扩增的长度适当下调作为退火温度。

然后在此次实验基础上做出预估。

退火温度对PCR的特异性有较大影响。

4、引物延伸
引物延伸一般在72℃进行（Taq酶最适温度）。

但在扩增长度较短且退火温度较高时，本步骤可省略
延伸时间随扩增片段长短而定，一般推荐在1000bp以上，含Pfu及其衍生物的衍生设定为1min/kbp。

5、循环数
大多数PCR含2540循环，过多易产生非特异扩增。

欧阳数创编
欧阳数创编。