芜菁小孢子胚胎发生及其显微结构观察研究

植物生理与生物技术
芜菁小孢子胚胎发生及其显微结构观察研究
乔丽桃，高杰，吴玉霞
(新疆农业大学林学与园艺学院，新疆乌鲁木齐830052)
摘要：以喀什芜菁为材料，利用显微镜技术，研究小孢子胚胎发生过程。

试验结果表明，没有进行热激处理的小孢子主要是沿配子体途径发育，即从四分体，经由单核靠边期、双核期，发育成为成熟的花粉粒过程；３３℃热激处理１￣３ｄ后，小孢子改变发育途径，沿孢子体途径发育。

部分小孢子出现细胞膨大，发生第一次有丝分裂分裂，形成２—细胞，２个子细胞之一发生垂直于子细胞壁方向的分裂，形成“Ｔ”型３—细胞原胚然后沿多细胞原胚、胚柄球形胚、鱼雷形胚、心形胚最终发育成子叶型胚。

但随培养天数增加，大多数膨大的细胞不能分裂或分裂后停止发育。

关键词：芜菁；小孢子培养；胚胎发育
中图分类号：Q942文献标识码：A DOI编码：10.3969/j.issn.1006－6500.2014.05.003
Research on Microspore Embryogenesis and Microstructure Observation in Brassica rapa L.
QIAO Li-tao,GAO Jie,WU Yu-xia
(College of Horticulture，Xinjiang Agricultural University，Urumqi,Xinjiang830052，China)
Abstract:Optical microscopes were used to study feature of the microspore embryogenesis in Brassica rapa L..The research took kashgar turnips as materials.The test results showed that without heat shock treatment,the microspore is mainly along the gameto－phyte development way,that is,from tetrad,through Uninucleate at periphery,Binucleate stage to develop into mature pollen grain; after33℃heat treatment,the way of microspore embryogenesis was changed,along the sporophyte development way.Some cells swelled,following the first mitotic division took place,then was2-cell formation,one of the two daughter cells divided in vertical direction forming the"T"type3-cell proembryo,and then along the multicellular proembryo,globular-shaped embryo with a at－tached suspensor,torpedo-shaped embryo,hearted-shaped embryo,eventually developed into cotyledon-shaped embryo.But with culturing days increased,most of the swollen cells cannot divide or stop developing.
Key words：turnip;microspore culture;embryogenesis
游离小孢子培养是产生双单倍体的方法之一，对加快十字花科蔬菜植物的杂交育种速度，提高育种效率具有重要作用。

不同物种小孢子胚胎发生途径受基因型[1]、低温[2]、小孢子发育阶段[3]等很多内外因素的影响。

小孢子正常发育方向是通过不对称核分裂后发育成花粉，而要让小孢子发育成胚，就要阻断原有的配子体发育方向，使小孢子进行对称性分裂向孢子体方向发育，即对称分裂才能诱导小孢子胚发生[4]。

外界胁迫被认为是诱导小孢子从配子体发育途径转向孢子体发育途径的关键因子，并使其发生均等分裂。

目前比较常用的胁迫方式有热激预处理、低温预处理、饥饿预处理和秋水仙素预处理及高pH值等[1,3,5-6]。

其中以热激处理最为常见。

小孢子经适当的热激培养后，获得胚性，随之细胞内发生一些特有的形态学变化，如细胞核向中央移动、液泡破裂和细胞膨大等。

刘公社等[7]和姜立荣等[4]对大白菜小孢子培养中热激与非热激处理后小孢子分裂方式变化以及细胞内超微结构进行了观察，揭示了小孢子胚胎发生过程中的形态学和结构变化。

李菲等[8]通过DAPI荧光染色观察大白菜游离小孢子胚胎发生过程，发现大白菜小孢子以均等分裂途径为主要发育途径，胚胎发生的启动机制是热激诱导下，单倍体小孢子体积膨大，染色体自然加倍，从而激发
收稿日期：2014-01-24；修订日期：2014-03-04
基金项目:新疆维吾尔自治区外国专家右玉局引智项目(20106500083)
作者简介:乔丽桃(1987—)，女，山西右玉人，在读硕士生，主要从事蔬菜种质资源研究。

通讯作者简介:高杰(1963—)，男，天津人，教授，博士生导师，主要从事蔬菜种质资源与遗传育种研究。

2014，20（5）：14-18
天津农业科学Tianjin Agricultural Sciences
第5期
小孢子进入孢子体发育途径。

笔者对芜菁小孢子进行分别培养，即未进行热激处理培养和热激培养，显微观察发现热激确实改变了小孢子的发育途径，但具体机理和过程仍需进一步探讨。

1材料和方法
1.1材料
供试材料为新疆喀什地区广泛种植的芜菁。

1.2方法
1.2.1芜菁小孢子培养及热激处理2013年3月，将喀什芜菁肉质根定植于直径为30cm的花盆中，给予正常的田间管理。

4月11日，部分芜菁开始抽薹。

待植株现蕾，于始花期，选取5~10个花序置于冰盒，选择长度为1.0~1.99，2.0~ 2.49，2.5~2.99mm的花蕾。

每一级别取15~20个花蕾，用2%NaOCl冲洗10min后用无菌水冲洗3次，然后用注射器活塞的底部旋转压榨花蕾3圈半，加4mL的NLN-13的培养基提取小孢子，然后用冷冻离心机离心3次，转速为800r·s-1。

倒掉上清，留取沉淀。

将沉淀用1mL的NLN-13培养基配制成悬浮液，用血球计数板调整小孢子密度为104个·mL-1。

然后将装有小孢子悬浮液的培养皿置于33℃恒温培养箱中，暗培养1~3d后，最后于25℃暗培养，直至出胚。

1.2.2DAPI荧光染色及显微观察与上述同期，选取5~10个花序置于冰盒，摘取花蕾，将花蕾分为1.0~1.99，2.0~2.49，2.5~2.99mm三级。

每一级别取12~15个花蕾，花蕾经消毒、研磨、分离纯化后，按照小孢子培养的步骤进行计数、培养，不同的是，不进行热激处理。

每天提取1mL的培养液，离心沉淀后，染色、制片，将制备好的切片置4℃冰箱内，过夜，在显微镜下观察。

2结果与分析
2.1DAPI染色观察芜菁小孢子不经热激处理发育为成熟花粉粒的形态及核分裂特点
被子植物中，花粉常用于指2—细胞或3—细胞时期的雄配子体，为了与此区别，一般把从四分体释放出来到形成成熟花粉之前的雄配子体称为小孢子[4]。

在显微镜下观察可见，芜菁的小孢子母细胞经过减数分裂形成4个单倍体的小孢子即四分体小孢子(图1-2)，当小孢子从四分体释放后，进一步形成明显的壁，同时体积迅速增大。

随着体积的增大，细胞核从中央移到细胞的一侧，即单核靠边期小孢子(图1-4)。

此后小孢子在正常的配子体发育途径中经历两次分裂，第1次分裂形成1个营养核和1个生殖核，称为双核期小孢子(图1-5)，同时两核间形成弧形的细胞板，小孢子分裂为两个高度不均等的细胞。

第2次分裂即生殖核发生分裂形成2个精子，小孢子发育为具有1个营养核和两2个精核的成熟花粉粒(图1-6)。

芜菁单核期小孢子发育为成熟花粉粒，其外部形态和体积也相应的发生明显的改变，这为芜菁游离小孢子培养选取适宜发育阶段的小孢子提供了可靠的形态依据。

2.2芜菁花粉小孢子细胞的膨大与分裂
对大多数物种来说，适合诱导雄核发育的花粉发育时期，是在单核小孢子第1次有丝分裂即将开始、正在进行或刚刚结束的时候[9]。

本试验选取2.0~2.49mm长的花蕾，分离小孢子进行培养。

该长度的花粉小孢子大多处于单核靠边期，经33℃热激处理，易于改变发育方向，使得花粉小孢子沿着孢子体途径发育。

热激培养1d后观察，大多数细胞出现明显膨大。

2d后膨大的细胞开始分裂，而未明显膨大的细胞一般不发生分裂。

同期观察的情况下，分裂的细胞数大大少于膨大的细胞数，这说明分裂仅发生在少部分膨大的小孢子中，这也印证余凤群等[10]关于小孢子培养后细胞的膨大是其分裂的先兆的观点。

芜菁小孢子先是分裂1次，随后部分细胞进行多次分裂，直至最后形成子叶型胚（图2-9）。

观察发现，在培养过程中，大多数细胞停留在2—细胞（图2-2）、3—细胞阶段，即T—细胞（图2-3）阶段，不再继续发育，出图1芜菁小孢子配子体发育途径
1.芜菁花蕾分级；
2.四分体时期(40×10);
3.单核中期(40×10);
4.单核靠边期(40×10);5．双核期(40×10);6.成熟花粉粒(40×10)。

乔丽桃等：芜菁小孢子胚胎发生及其显微结构观察研究·15
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天津农业科学第20卷
现多种细胞形态并存的现象。

本试验最后只得到
一个子叶型胚，
出胚率仅有1/25(胚/蕾)。

由此推断，随着培养的进行，部分膨大和分裂的细胞可能发育受阻失去了活力。

2.3
芜菁小孢子胚胎发育过程
游离的芜菁小孢子悬浮于NLN -13培养基中，经33℃恒温培养箱热激培养48h 后，观察发现部分小孢子膨大，直径明显大于未激活的小孢子（图2-1），且个别膨大细胞已经开始第一次分裂。

随后在24℃下静置培养，具有胚状体发生能力的小孢子，分裂形成2—细胞原胚。

该原胚的2个子细胞大小相近。

随后，2个子细胞之一先发生垂直于子细胞壁方向的分裂,形成“T ”型3—细胞原胚，并继而发生垂直于平行方向的分裂，形成多细胞团的胚状体部分。

2—细胞原胚中的另一子细胞分裂较慢，一般发生平行方向分裂形成胚柄。

在小孢子培养将近15d 后，胚状体一般发育成近似于圆球状或椭圆形且携带着胚柄。

胚的主体部分显著大于胚柄部分，且细胞小而排列紧密。

随着胚状体的进一步生长，胚顶端子叶原基分化而使胚状体呈心形，此时胚柄大多已脱落并游离到液体培养基中。

随着子叶和胚轴细胞的继续分裂，胚体
积不断增大而发育成鱼雷胚。

极少数细胞多次分裂形成球型胚（图2-6，2-7）、鱼雷型胚、心型胚（图2-8）和子叶型胚（图2-9，2-10）。

观察发现，芜菁小孢子胚胎发育的过程中存在着小孢子发育的不同步性。

这与高海娜等[11]关于甘蓝小孢子处于单核靠边期的花粉小孢子在同等培养条件下胚胎群体中同时存在着各个时期的胚状体观点一致。

3
讨论
（1）本试验在热激培养1d 后，有2—细胞（图2-2）出现，这2个子细胞，大小接近。

推测芜菁小孢子热激培养后，第一次分裂方式为均等分裂，但这并不排除不均等分裂的可能性。

早期研究指出，芸薹属蔬菜小孢子胚胎发育途径既有对称分裂的B 途径，也有不对称分裂的A 途径[12]。

刘公社等[7]、李菲等[8]研究发现白菜中小孢子游离培养的胚胎发育以B 途径为主。

张菊平等[13]在研究辣椒花药培养时，得到多核花粉来源于单核小孢子的对称分裂或不对称分裂。

试验结果显示，多数胚性花粉是通过不对称的小孢子有丝分裂产生的早期双核花粉中的营养核的分裂产生的。

不结球白菜小孢子胚胎发生的过程及发育途径研究表明，不结球白菜花粉母细胞减数分裂释放出的小孢子发育到单核靠边期及稍后时期染色最深、活力最强。

多数游离小孢子培养经历的发育过程与合子胚相似，小孢子胚胎发育途径既有核对称分裂产生胚胎的途径(B 途径)，也有第1次不对称有丝分裂后营养细胞反复分裂单独发育成胚的方式（A
途径）
[14]。

（2）图2-4，2-5类似胚柄的结构的出现，意味着细胞在发育初期出现极性分化。

很可能与小孢子的不均等分裂相关，有待进一步探讨。

这一现象说明同样处在单核靠边期的小孢子其生理状况却差异极大，这对发育的调控提出了更高的要求。

李春玲等[15]对灯笼椒、牛角椒、羊角椒、线形椒和朝天椒等辣(甜)椒游离小孢子的培养与观察表明：小孢子最初的细胞分裂有均等和不均等两种方式，胚胎发生过程与合子胚发育过程极相似，直到心形胚以前均可观察到胚柄的存在。

（3）游离小孢子在NLN-13液体培养基中发育的启动时间极不一致，热激培养3d 后可观察到多种胚性小孢子共存，与此同时仍观察到不少
图2
33℃热激处理后芜菁胚胎发生过程
1：未激活的小孢子(40×10)；2：热激后膨大细胞和2-细胞(40×10)；3：T-细胞(40×10)；4~5：带柄球形胚(40×10)；6~7：鱼雷形胚(40×10)；8：心形胚(40×10)；9~10：子叶型胚；11~12：胚再生。

·16
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单核小孢子，它们可能继续发育或已经失去活性。

余凤群等[10]在油菜型甘蓝小孢子的离体培养中发现，在培养4~5d后部分细胞已进行多次分裂，但仍有一些细胞停留在2—细胞、3—细胞阶段，出现2—细胞、3—细胞与多细胞团并存的现象。

然而从培养细胞的活力测定结果来看，培养4~5d 后小孢子的存活力显著低于细胞膨大和分裂的细胞频率，说明部分膨大或分裂的小孢子可能发育受阻而失去了活力。

（4）获得小孢子胚状体是芜菁小孢子培养应用于育种实践的先决条件。

从本试验来看，只有极少数小孢子最终能发育成胚状体。

材料基因型是胚状体产生的先决条件，其次就是胚胎诱导。

诱导的方式有离心、低温、高温、射线、甘露醇等方法，目的是从生理生化上改变细胞生理状态、改变其分裂方式和发育途径[16-19]。

试验中常采用高温进行诱导，效果相对较好。

该方法被广泛用于芸薹属植物的花药培养和游离小孢子培养。

栗根义等[20]研究表明，高温预处理在白菜游离小孢子培养中也收到了良好的效果。

试验证明，接种后33~35℃，暗培养24h，对胚状体诱导的效果最为理想。

周伟军等[21]对油菜游离小孢子分别进行32℃和30℃热击暗培养3d和7d后转入常温(24℃)下培养，其胚胎发生好，产胚率高，获得了大量正常胚体。

结球甘蓝游离小孢子经过34℃处理48h 后，许多小孢子开始膨大，第3天就可看到第一次分裂，培养25～30d后可发育成不同时期的胚，25℃恒温培养的小孢子没有发生分裂现象，说明高温热激预处理是促进细胞对称分裂，改变小孢子发育方向的主要条件[22]。

为了提高小孢子胚产量，减少小孢子在通向胚状体形成途径的死亡，应该改善分离小孢子的条件，或是通过改善培养条件和培养方法，以减少分离过程造成小孢子的死亡，提高小孢子有效膨大和分裂的比例。

4结论
本试验在显微镜下观察芜菁游离小孢子热激培养与小孢子正常发育为成熟花粉粒的过程，比较两者在小孢子形态与核分裂方式的差别。

结果显示，单核靠边期小孢子在不同发育途径下其外部形态和细胞核分裂方式都发生了明显改变：沿配子体途径正常发育的小孢子从单核期到双核前期，圆球形小孢子体积有所增大，但双核后期小孢子即由圆球形变为椭圆形。

正常发育下单核小孢子发生不均等分裂，形成一个大的营养细胞，营养细胞内包含一个小的生殖细胞；而诱导向孢子体途径发育的小孢子，经热激启动后小孢子仍保持圆球形，但体积明显膨大，光学显微镜下观察，启动膨大的小孢子细胞先经过一次分裂，形成大小相近的2—细胞，此后体积发生一系列分裂，最终形成胚状体。

由此可以初步判断热激启动的小孢子孢子体发育途径，单核小孢子变为二倍体的单细胞。

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