第二章基因工程制药新版3
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第二章基因工程制药新版3
（3）化学合成法的实例
讫今为止，通过化学合成方法已经了近百种产 物的基因。主要有以下种类：
细菌酪氨酸t-RNA 人生长激素 α干扰素 γ干扰素 血管紧张素 人胰岛素 人生长激素抑制释放因子 溶菌酶 组织血纤维蛋白溶酶原激活剂
第二章基因工程制药新版3
3、逆转录法
（1）逆转录法的理由 （2）逆转录法的理论依据 （3）逆转录所产生的DNA的特性 （4）逆转录法的具体步骤 （5）逆转录法的实例
表达型----是指重组后插入的cDNA能够经过转录、翻译，最 终合成蛋白质。
非表达型----是指重组后插入的cDNA不能经过转录、转译， 合成蛋白质。
表达型 非表达型
质粒 PUC pBR322
噬菌体 λgt11 λgt10
第二章基因工程制药新版3
•（D2）、cDNA的片段与载体的连 接
（1）借助同型多聚体尾巴的连接方法----用3-末端脱氧核 苷酸转移酶催化，在cDNA的3’末端加上polyG（或者 polyT）的尾巴、而在载体的末端加上polyC（或者 polyA） 的尾巴，就能够实现cDNA的片段与载体DNA的连接。
经过2-3次寡聚脱氧胸腺苷酸Oligo dT-纤维素柱 之后，就可得到较高纯度的mRNA。
第二章基因工程制药新版3
• mRNA的分 离
•Oligo-dT纤维素柱
•O第二li章g基o因-工d程制T药磁新版珠3 法
•B、cDNA第一链的合成
由于mRNA的3’端常含polyA，所以可用寡聚 脱氧胸腺苷酸Oligo dT做引物，在逆转录酶催 化下，合成cDNA。
第二章基因工程制药新版3
•（2）逆转录法的理论依据
逆转录法就是从 mRNA→cDNA→DNA→mRNA→Protein的方 法。
（A）提取真核细胞的mRNA。 （B）以mRNA为模板，在逆转录酶有作用下，
反转录合成cDNA第一链。 （C）再以cDNA为模板，在DNA聚合酶的作
用下，合成DNA互补双链。
第二章基因工程制药新版3
3、真核生物DNA的提取
（1）提取方法 同2
（2）注意事项 对于纯度要求较高的DNA，必须采用氯化铯 （CsCl2）密度梯度离心法进行分离。 操作时要防止丢失线粒体DNA、和卫星DNA等密 度异常成份。 要防止低分子量的DNA的污染。
第二章基因工程制药新版3
4、病毒DNA的提取
第二章基因工程制药新版3
2、提取方法
（1）机械法----破坏细胞，释放出DNA。 （2）酶消化法---破坏细胞，释放出DNA。 （3）用酶使蛋白质变性----除去蛋白质之后，就剩
下DNA。 （4）用酚、去垢剂使蛋白质变性----除去蛋白质，
剩下DNA。
第二章基因工程制药新版3
3、分离方法
是指从大分子的 混合物中分离出 DNA。具体方法 有：
然后，再以cDNA第一链为模板，在DNA聚 合酶的作用下，合成DNA互补双链。
第二章基因工程制药新版3
• cDNA的合成方法
•mRNA
•mRNA-cDNA • Hybrid
•nick
•逆转录酶 •RNase H
•DNA聚合酶 •T4连接酶
•Nick •Translation
•T4 DNA聚合酶处理形成平头末端
第二章基因工程制药新版3
•D、cDNA的克隆和重组
（D1）、用于cDNA的克隆的载体 （D2）、cDNA的片段与载体的连接
第二章基因工程制药新版3
•（D1）、用于cDNA的克隆的载体
当cDNA的插入片段小于10Kb时，应选用质粒载体。
当cDNA的插入片段大于10Kb时，应选用噬菌体载体。细菌培养
↓
质粒扩增
↓
菌落收集
↓
溶菌技术
↓
分离技术-------采用热或者碱使DNA变性，然后再进行 冷却或者恢复到中性PH值，由于质粒DNA易于复性， 而染色体DNA则不易复性、会沉淀下来
↓
提纯技术------采用溴乙锭密度梯度离心、二碘丙锭的 氯化铯密度梯度离心，质粒DNA插入染料区带较多、 而染色体DNA插入染料区带则较少。从而可以分离。
第二章因失活法 （2）菌落颜色
（3）噬菌斑颜色改变
分子鉴定法： （1）凝胶电泳 （2）分子杂交 （3）DNA序列测定
第二章基因工程制药新版3
•G、目的cDNA克隆的分离和鉴定
（1）核酸探针杂交法----根据目的蛋白质纯品 的氨基酸序列分析结果，人工合成cDNA的合成效率，可在合成体系中加 入放射性标记的dNTP，如α-32P-dATP、α-32PdCTP，这样就可通过放射自显影技术，来计算 dNTP的渗入量。
第二章基因工程制药新版3
•C、cDNA第二链的合成
先用碱水解的方法，或用RNaseH酶解的方法， 除去cDNA-mRNA杂交链中的mRNA链。
（1）DEAE—纤维 素柱层析法。
（2）羟基磷灰石 柱层析法。
第二章基因工程制药新版3
4、纯化方法
分子筛层析法。 凝胶电泳法。 乙醇、三氯醋酸、聚乙二醇沉淀法。
第二章基因工程制药新版3
（二）不同类别DNA的提取技术
1、质粒DNA的提取 2、细菌染色体DNA的提取 3、真核生物DNA的提取 4、病毒DNA的提取
第二章基因工程制药新版3
•A、mRNA的纯化
mRNA的3’端常常含polyA，它能够吸附在寡
聚脱氧胸腺苷酸Oligo dT-纤维素上，借此可以将
mRNA与其它RNA进行分离。
当RNA提取液流经寡聚脱氧胸腺苷酸Oligo dT纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被 特异性地吸附在柱上，其它RNA成份则被冲刷走 掉，最后，用低盐溶液或者蒸馏水冲刷纤维素柱， mRNA就被洗脱下来。
用少量λ噬菌体感染宿主，然后用大量的培养基 进行感染细菌的培养，最后全部细菌都会被λ 噬菌体感染。此法适应于制备大多数噬菌体。
第二章基因工程制药新版3
（三）目的基因的制备
•目的基因： •准备要分离、改造、扩增或表达的基因。
第二章基因工程制药新版3
•需要克隆的DNA片段
•编码某种蛋白质
•研究某基因与疾 病的关系
•分子克 隆
第二章基因工程制药新版3
（2）化学合成法的优缺点
n 化学合成法的优点----随意性强，可通过人工设计，进行 合成、组装非天然基因，为实施蛋白质工程提供了强有 力的手段，较小分子蛋白质或多肽编码的基因， 1530bp效果最好，1天完成。现在可达到一次合成寡核苷 酸片段长达50-60bp
n 化学合成法的缺点： （1）反应专一性不强、副反应多; （2）合成片段越长、分离纯化越困难、产率越低; （3）无法合成太长的基因，不能大于60bp; （4）人工合成基因时，遗传密码子的简并给选定密码子 带来很大困难，人工合成时，遗传密码的简并性可导致 中性突变; （5）合成费用较高。
分离技术----平衡等密度离心法、凝胶电泳法、溴乙锭 染色法。
观察技术----荧光显微镜观察。 鉴定技术----核酸杂交法、瑟萨恩印迹转移技术。
第二章基因工程制药新版3
•物理学密度梯度离心法
不同DNA 片段，其密 度不同，借 此进行密度 梯度离心， 实现分离。
第二章基因工程制药新版3
•凝胶电泳分离技术
第二章基因工程制药新版3
•（1）逆转录法的理由
真核生物的基因不能直接分离，原因： （A）单一拷贝的基因只占到真核生物基因组的十
万～千万分之一，数量十分微小，这就导致直接从真
核生物染色体上制备目的基因的极为困难。 （B）真核基因内一般都有内含子，会阻止基因的不正 常表达。 （C）将真核基因导入到原核细胞之中，由于原核细胞 中缺乏mRNA转录后的加工系统，因此，从真核基因 转录出的mRNA无法提到加工处理，也就不能成为成 熟的mRNA。
（2）加人工接头的连接法----所谓加人工接头的连接法， 是指用采用T4DNA连接酶，在cDNA的末端加上人工接头， 然后再使用特定的限制酶来切出粘性末端，从而实现与载 体DNA的连接。
第二章基因工程制药新版3
•E、将重组体导入宿主细胞
λ噬菌体 感染大肠杆 菌形成噬菌 斑。以便于 使得质粒转 化到大肠杆 菌内。
1、操作条件 2、提取方法 3、分离方法 4、纯化方法
第二章基因工程制药新版3
1、操作条件
（1）含盐的中性缓冲液----以防在除去蛋白质的时 候，使核酸产生不可逆转的变性。
（2）低温条件----防止DNA在振荡、机械操作过程 中的降解、断裂。
（3）使用核酸酶抑制剂（柠檬酸、砷酸盐、EDTA） ----以防止DNA被酶解。
第二章基因工程制药新版3
（1）化学合成法的概念和分类
概念----以5’或3’-脱氧核苷酸、5’-磷酰基寡核苷酸片段为原 料，用化学方法，将其逐个缩合成基因的方法，称为化学 合成法。
1976年H.G. Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并 于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨 酸tRNA基因的论文。
第二章基因工程制药新版3
（2）特异亲合鉴定法----对于那些表达水平低,不 能纯化得到足量蛋白质的进行序列测定,利用一种 能与靶蛋结构和功 能的关系
第二章基因工程制药新版3
1、物理分离法 2、化学合成法 3、逆转录法 4、RT-PCR技术法 5、筛选新基因的其它新方法
第二章基因工程制药新版3
1、物理分离法
（1）分离方法 （2）物理分离法实例
第二章基因工程制药新版3
（1）分离方法
直接用酶切割、或者机械破碎分离法。DNA经过直接用 酶切割、或者机械破碎之后，可产生编码不同基因的 DNA片段，由于不同基因中的G-C碱基对含量、与AT碱基对含量有差异，结果就导致它们之间的密度不同， 因此通过分离技术+观察技术+鉴定技术结合，就能将 其分离。
第二章基因工程制药新版3
2、细菌染色体DNA的提取
采用冻融、溶菌酶、EDTA处理、去垢剂处理使得细胞裂解。 ↓ 裂解液用胰RNase和蛋白酶处理，使RNA和蛋白质降解。 ↓ 残留蛋白质用酚溶液、或者用（酚：氯仿=1：1）溶液进 行抽取和离心，使提大部分蛋白质因为变性而沉淀于有机 相与水相之间。 ↓ 含DNA的水相用乙醇沉淀，以获得丝状的DNA沉淀物， ↓ 沉淀物用缓冲液透析，除掉去垢剂和有机溶剂。 ↓ 最后采用氯化铯（CsCl2）进行密度梯度离心法分离。
第二章基因工程制药新 版3
2020/12/10
第二章基因工程制药新版3
三、外源DNA和目的基因的分离和获 得
（一）基本操作方法 （二）不同类别DNA的提取技术 （三）目的基因的制备
第二章基因工程制药新版3
（一）基本操作方法
细胞内的DNA大多与RNA及蛋白质形成复合物， 需要经过提取、分离、纯化，才能获得高纯度的 DNA。
要求： 1、已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 2、分子量较小的目的基因的制备
第二章基因工程制药新版3
第二章基因工程制药新版3
•基因的化学-酶促合成图解
•磷•磷酸酸化化
••退退火火
••DDNAN多A聚酶多Ⅰ聚Klen酶owⅠ片段K+ldeNnTPos w 片 段
•限制性内切酶
•分子克隆
通过凝胶电泳， 分段收集大小不 同的DNA片段，
然后用快速转化 法来检验其目的 蛋白质，进行基 因定位。实现分 离。
第二章基因工程制药新版3
（2）物理分离法实例
海胆组蛋白基因 苏芸金杆菌晶体蛋白基因 多角病毒的多角体蛋白基因 β-半乳糖苷酶蛋白基因
第二章基因工程制药新版3
2、化学合成法
（1）化学合成法的概念 （2）化学合成法的优缺点 （3）化学合成法的实例
第二章基因工程制药新版3
•（3）逆转录所产生的DNA的特 性
（A）只反映mRNA经过加工之后的基因编码 序列，而不象真核生物的原始DNA那样具有复 杂的信息承载。
（B）不含内含子，可以在任何场合进行表达。
第二章基因工程制药新版3
•（4）逆转录法的具体步骤
A、mRNA的纯化 B、cDNA第一链的合成 C、cDNA第二链的合成 D、cDNA的克隆和重组 H、cDNA目的基因的阳性克隆的鉴定和验证技术
（3）化学合成法的实例
讫今为止，通过化学合成方法已经了近百种产 物的基因。主要有以下种类：
细菌酪氨酸t-RNA 人生长激素 α干扰素 γ干扰素 血管紧张素 人胰岛素 人生长激素抑制释放因子 溶菌酶 组织血纤维蛋白溶酶原激活剂
第二章基因工程制药新版3
3、逆转录法
（1）逆转录法的理由 （2）逆转录法的理论依据 （3）逆转录所产生的DNA的特性 （4）逆转录法的具体步骤 （5）逆转录法的实例
表达型----是指重组后插入的cDNA能够经过转录、翻译，最 终合成蛋白质。
非表达型----是指重组后插入的cDNA不能经过转录、转译， 合成蛋白质。
表达型 非表达型
质粒 PUC pBR322
噬菌体 λgt11 λgt10
第二章基因工程制药新版3
•（D2）、cDNA的片段与载体的连 接
（1）借助同型多聚体尾巴的连接方法----用3-末端脱氧核 苷酸转移酶催化，在cDNA的3’末端加上polyG（或者 polyT）的尾巴、而在载体的末端加上polyC（或者 polyA） 的尾巴，就能够实现cDNA的片段与载体DNA的连接。
经过2-3次寡聚脱氧胸腺苷酸Oligo dT-纤维素柱 之后，就可得到较高纯度的mRNA。
第二章基因工程制药新版3
• mRNA的分 离
•Oligo-dT纤维素柱
•O第二li章g基o因-工d程制T药磁新版珠3 法
•B、cDNA第一链的合成
由于mRNA的3’端常含polyA，所以可用寡聚 脱氧胸腺苷酸Oligo dT做引物，在逆转录酶催 化下，合成cDNA。
第二章基因工程制药新版3
•（2）逆转录法的理论依据
逆转录法就是从 mRNA→cDNA→DNA→mRNA→Protein的方 法。
（A）提取真核细胞的mRNA。 （B）以mRNA为模板，在逆转录酶有作用下，
反转录合成cDNA第一链。 （C）再以cDNA为模板，在DNA聚合酶的作
用下，合成DNA互补双链。
第二章基因工程制药新版3
3、真核生物DNA的提取
（1）提取方法 同2
（2）注意事项 对于纯度要求较高的DNA，必须采用氯化铯 （CsCl2）密度梯度离心法进行分离。 操作时要防止丢失线粒体DNA、和卫星DNA等密 度异常成份。 要防止低分子量的DNA的污染。
第二章基因工程制药新版3
4、病毒DNA的提取
第二章基因工程制药新版3
2、提取方法
（1）机械法----破坏细胞，释放出DNA。 （2）酶消化法---破坏细胞，释放出DNA。 （3）用酶使蛋白质变性----除去蛋白质之后，就剩
下DNA。 （4）用酚、去垢剂使蛋白质变性----除去蛋白质，
剩下DNA。
第二章基因工程制药新版3
3、分离方法
是指从大分子的 混合物中分离出 DNA。具体方法 有：
然后，再以cDNA第一链为模板，在DNA聚 合酶的作用下，合成DNA互补双链。
第二章基因工程制药新版3
• cDNA的合成方法
•mRNA
•mRNA-cDNA • Hybrid
•nick
•逆转录酶 •RNase H
•DNA聚合酶 •T4连接酶
•Nick •Translation
•T4 DNA聚合酶处理形成平头末端
第二章基因工程制药新版3
•D、cDNA的克隆和重组
（D1）、用于cDNA的克隆的载体 （D2）、cDNA的片段与载体的连接
第二章基因工程制药新版3
•（D1）、用于cDNA的克隆的载体
当cDNA的插入片段小于10Kb时，应选用质粒载体。
当cDNA的插入片段大于10Kb时，应选用噬菌体载体。细菌培养
↓
质粒扩增
↓
菌落收集
↓
溶菌技术
↓
分离技术-------采用热或者碱使DNA变性，然后再进行 冷却或者恢复到中性PH值，由于质粒DNA易于复性， 而染色体DNA则不易复性、会沉淀下来
↓
提纯技术------采用溴乙锭密度梯度离心、二碘丙锭的 氯化铯密度梯度离心，质粒DNA插入染料区带较多、 而染色体DNA插入染料区带则较少。从而可以分离。
第二章因失活法 （2）菌落颜色
（3）噬菌斑颜色改变
分子鉴定法： （1）凝胶电泳 （2）分子杂交 （3）DNA序列测定
第二章基因工程制药新版3
•G、目的cDNA克隆的分离和鉴定
（1）核酸探针杂交法----根据目的蛋白质纯品 的氨基酸序列分析结果，人工合成cDNA的合成效率，可在合成体系中加 入放射性标记的dNTP，如α-32P-dATP、α-32PdCTP，这样就可通过放射自显影技术，来计算 dNTP的渗入量。
第二章基因工程制药新版3
•C、cDNA第二链的合成
先用碱水解的方法，或用RNaseH酶解的方法， 除去cDNA-mRNA杂交链中的mRNA链。
（1）DEAE—纤维 素柱层析法。
（2）羟基磷灰石 柱层析法。
第二章基因工程制药新版3
4、纯化方法
分子筛层析法。 凝胶电泳法。 乙醇、三氯醋酸、聚乙二醇沉淀法。
第二章基因工程制药新版3
（二）不同类别DNA的提取技术
1、质粒DNA的提取 2、细菌染色体DNA的提取 3、真核生物DNA的提取 4、病毒DNA的提取
第二章基因工程制药新版3
•A、mRNA的纯化
mRNA的3’端常常含polyA，它能够吸附在寡
聚脱氧胸腺苷酸Oligo dT-纤维素上，借此可以将
mRNA与其它RNA进行分离。
当RNA提取液流经寡聚脱氧胸腺苷酸Oligo dT纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被 特异性地吸附在柱上，其它RNA成份则被冲刷走 掉，最后，用低盐溶液或者蒸馏水冲刷纤维素柱， mRNA就被洗脱下来。
用少量λ噬菌体感染宿主，然后用大量的培养基 进行感染细菌的培养，最后全部细菌都会被λ 噬菌体感染。此法适应于制备大多数噬菌体。
第二章基因工程制药新版3
（三）目的基因的制备
•目的基因： •准备要分离、改造、扩增或表达的基因。
第二章基因工程制药新版3
•需要克隆的DNA片段
•编码某种蛋白质
•研究某基因与疾 病的关系
•分子克 隆
第二章基因工程制药新版3
（2）化学合成法的优缺点
n 化学合成法的优点----随意性强，可通过人工设计，进行 合成、组装非天然基因，为实施蛋白质工程提供了强有 力的手段，较小分子蛋白质或多肽编码的基因， 1530bp效果最好，1天完成。现在可达到一次合成寡核苷 酸片段长达50-60bp
n 化学合成法的缺点： （1）反应专一性不强、副反应多; （2）合成片段越长、分离纯化越困难、产率越低; （3）无法合成太长的基因，不能大于60bp; （4）人工合成基因时，遗传密码子的简并给选定密码子 带来很大困难，人工合成时，遗传密码的简并性可导致 中性突变; （5）合成费用较高。
分离技术----平衡等密度离心法、凝胶电泳法、溴乙锭 染色法。
观察技术----荧光显微镜观察。 鉴定技术----核酸杂交法、瑟萨恩印迹转移技术。
第二章基因工程制药新版3
•物理学密度梯度离心法
不同DNA 片段，其密 度不同，借 此进行密度 梯度离心， 实现分离。
第二章基因工程制药新版3
•凝胶电泳分离技术
第二章基因工程制药新版3
•（1）逆转录法的理由
真核生物的基因不能直接分离，原因： （A）单一拷贝的基因只占到真核生物基因组的十
万～千万分之一，数量十分微小，这就导致直接从真
核生物染色体上制备目的基因的极为困难。 （B）真核基因内一般都有内含子，会阻止基因的不正 常表达。 （C）将真核基因导入到原核细胞之中，由于原核细胞 中缺乏mRNA转录后的加工系统，因此，从真核基因 转录出的mRNA无法提到加工处理，也就不能成为成 熟的mRNA。
（2）加人工接头的连接法----所谓加人工接头的连接法， 是指用采用T4DNA连接酶，在cDNA的末端加上人工接头， 然后再使用特定的限制酶来切出粘性末端，从而实现与载 体DNA的连接。
第二章基因工程制药新版3
•E、将重组体导入宿主细胞
λ噬菌体 感染大肠杆 菌形成噬菌 斑。以便于 使得质粒转 化到大肠杆 菌内。
1、操作条件 2、提取方法 3、分离方法 4、纯化方法
第二章基因工程制药新版3
1、操作条件
（1）含盐的中性缓冲液----以防在除去蛋白质的时 候，使核酸产生不可逆转的变性。
（2）低温条件----防止DNA在振荡、机械操作过程 中的降解、断裂。
（3）使用核酸酶抑制剂（柠檬酸、砷酸盐、EDTA） ----以防止DNA被酶解。
第二章基因工程制药新版3
（1）化学合成法的概念和分类
概念----以5’或3’-脱氧核苷酸、5’-磷酰基寡核苷酸片段为原 料，用化学方法，将其逐个缩合成基因的方法，称为化学 合成法。
1976年H.G. Khorana提出了用化学方法合成基因的设想，并 于1979年在science上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨 酸tRNA基因的论文。
第二章基因工程制药新版3
（2）特异亲合鉴定法----对于那些表达水平低,不 能纯化得到足量蛋白质的进行序列测定,利用一种 能与靶蛋结构和功 能的关系
第二章基因工程制药新版3
1、物理分离法 2、化学合成法 3、逆转录法 4、RT-PCR技术法 5、筛选新基因的其它新方法
第二章基因工程制药新版3
1、物理分离法
（1）分离方法 （2）物理分离法实例
第二章基因工程制药新版3
（1）分离方法
直接用酶切割、或者机械破碎分离法。DNA经过直接用 酶切割、或者机械破碎之后，可产生编码不同基因的 DNA片段，由于不同基因中的G-C碱基对含量、与AT碱基对含量有差异，结果就导致它们之间的密度不同， 因此通过分离技术+观察技术+鉴定技术结合，就能将 其分离。
第二章基因工程制药新版3
2、细菌染色体DNA的提取
采用冻融、溶菌酶、EDTA处理、去垢剂处理使得细胞裂解。 ↓ 裂解液用胰RNase和蛋白酶处理，使RNA和蛋白质降解。 ↓ 残留蛋白质用酚溶液、或者用（酚：氯仿=1：1）溶液进 行抽取和离心，使提大部分蛋白质因为变性而沉淀于有机 相与水相之间。 ↓ 含DNA的水相用乙醇沉淀，以获得丝状的DNA沉淀物， ↓ 沉淀物用缓冲液透析，除掉去垢剂和有机溶剂。 ↓ 最后采用氯化铯（CsCl2）进行密度梯度离心法分离。
第二章基因工程制药新 版3
2020/12/10
第二章基因工程制药新版3
三、外源DNA和目的基因的分离和获 得
（一）基本操作方法 （二）不同类别DNA的提取技术 （三）目的基因的制备
第二章基因工程制药新版3
（一）基本操作方法
细胞内的DNA大多与RNA及蛋白质形成复合物， 需要经过提取、分离、纯化，才能获得高纯度的 DNA。
要求： 1、已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 2、分子量较小的目的基因的制备
第二章基因工程制药新版3
第二章基因工程制药新版3
•基因的化学-酶促合成图解
•磷•磷酸酸化化
••退退火火
••DDNAN多A聚酶多Ⅰ聚Klen酶owⅠ片段K+ldeNnTPos w 片 段
•限制性内切酶
•分子克隆
通过凝胶电泳， 分段收集大小不 同的DNA片段，
然后用快速转化 法来检验其目的 蛋白质，进行基 因定位。实现分 离。
第二章基因工程制药新版3
（2）物理分离法实例
海胆组蛋白基因 苏芸金杆菌晶体蛋白基因 多角病毒的多角体蛋白基因 β-半乳糖苷酶蛋白基因
第二章基因工程制药新版3
2、化学合成法
（1）化学合成法的概念 （2）化学合成法的优缺点 （3）化学合成法的实例
第二章基因工程制药新版3
•（3）逆转录所产生的DNA的特 性
（A）只反映mRNA经过加工之后的基因编码 序列，而不象真核生物的原始DNA那样具有复 杂的信息承载。
（B）不含内含子，可以在任何场合进行表达。
第二章基因工程制药新版3
•（4）逆转录法的具体步骤
A、mRNA的纯化 B、cDNA第一链的合成 C、cDNA第二链的合成 D、cDNA的克隆和重组 H、cDNA目的基因的阳性克隆的鉴定和验证技术