荧光成像——精选推荐

荧光成像
AIS和MCID在静态荧光成像方面都做的很好，MCID公司为了能做好动态和在很低亮度下的荧光成像增加很多函数
内容提要：
1．从众多摄像头挑选一个
2．对多种颜色的荧光成像有很大的支持。

使用integrating color camecas更加的方便；为了更高的灵敏度，使用熔合2个或更多的单色视图合成多
颜色的图象；图象熔合函数被包括在内而且在对多种FISH探测针成像
时很有用
3．分析对荧光目标的自动操作和人工检测
4．图象处理包括数字deconvolution（去卷积）（可以使图象更清晰），结合了由多种有焦点位面组成的单个图象、图象算法和逻辑算法、图象
“登记”等等
5．一个瓦状的函数（TFM*，可选择的）可以代替photomontages，它构造一个大又高的分辨率来反映多视场（既适用于明视场，还适用于暗视
场）
6．荧光的亮度可以校准为你的标准
7．图象改进和背景修正有很多形式
8．M3D*模块需要的话可以增加
目录：
第一章简单的讨论：
§1.1荧光的定位和定量：
§1.1.1定位：单色的和多谱的荧光成像
§1.1.2定量：改变为荧光团环境
§1.2荧光成像系统的特点：
§1.2.1大量的测量函数
§1.2.2支持ICCD、积分型CCD和彩色CCD
§1.3荧光成像的内容：
§1.3.1摄像头：
ICCD摄想头
积分型摄想头
彩色摄想头
§1.3.2成像系统
第二章动态荧光成像：
§2.1介绍：
§2.1.1 ICCD和快速积分型CCD
§2.2 Ratiometric成像：
§2.2.1 Fura-2
§2.2.2 BCECF
§2.2.3教正背景荧光
§2.2.4 交互的激发条件
§2.2.5建立图象的比率次序
短的Inter-Ratio 时间间隔
混合短的和长的Inter-Ratio 时间间隔
§2.2.6压缩
§2.2.7从多样的比率图象（ratio images）中读取数据和制表数据 §2.2.8暴光计模式
§2.2.9校正2个激发波长
§2.3单个的激发，单个的发射
§2.4任意的平衡
参考文献
第一章简单的讨论
§1.1 荧光的定位和定量
当一个荧光团和一个易于发生的激发光子相互作用时就会发射出荧光，吸收光子后，就会导致荧光团里的一个电子从它基本的形态上升到一种高能量的级别。

然后，电子回复到它原始的级别，释放一个光子（荧光发射的），这个光子的波长取决于在回复过程中释放能量多少的。

一个给定的荧光团可以发射单个或者多种波长（建立一个发射光谱），因为电子沿着很多轨道掉落回它基本的形态。

一个荧光团发射的光谱是固定的。

成像系统适用于以下的荧光应用：
1．一个图象系统可以通过接受一个特殊的发射光谱来定位一个荧光团，比如细胞传递一个用荧光标记的蛋白质可以被采集和计
算
2．通过测量一个荧光团的亮度，图象系统可以评估一个被荧光标记的分子的浓度。

3．些微改变一个荧光团（比如捆绑FUTA2 变为Ca++）就会导致发射光谱的改变。

成像系统可以用于测量这些光谱的改变，做
为荧光团改变的指示。

在这章，将集中介绍细微荧光的应用。

而对于比较大的荧光，看《实验屏幕的图象系统》小册子。

§1.1.1 定位：单色和多谱线的荧光成像
在最简单的情况下（单色的荧光成像），单个荧光团来标记单个由分子组成的核素。

举个例子，神经胶质的有原纤维的酸的蛋白质（GFAP）用等硫酸青盐荧光素（FITC）标记后，可以用来显示使用CNS修补过的外伤。

相同的，在一个在原处的杂交的探针上做上荧光的标记，可以精确的显示mRND、DNA在一个染色体上的位置（在原位置杂交的荧光——FISH）。

多谱线的荧光成像可以在一张图象中显示多种由分子组成的核素。

每一个不连续的荧光标记都可以显示为不同的颜色。

举个例子：我们把荧光设为绿色，若丹明(一种红色荧光染料)设为红色，那么在交迭的区域就会有混合颜色（比如红和绿交迭为黄色），MCID和AIS是传输多谱线荧光的2种方法。

最好品质：
每一个荧光团在理想状态下都是独立显示的。

比如：FITC和若丹明荧光可以同时被建立。

图象熔合函数可以把2个图象合成为一张彩色图象，就可以看到组织成分之间的关系（看最上面右边的照片）。

这种方法产生最佳的图象质量，有以下三个原因：
1．可以使用高分辨率高灵敏度的制冷相机
2．荧光光学器件（激发和发射的过滤器）可以调整在每个波长的最小背景。

3．从每一个分散的氟石到最后熔合为一张图象有一套非常灵活的控制，如果一个氟石比另一个暗的话，一般来说在那个波长暴光时间要长。

非常方便
很多的荧光团同时显现出来。

基于这点，我们用光学手段对每个荧光团同时提供多个光谱激发和离散的发射波长。

用一个彩色相机拍摄这个多颜色的样本。

因为一个标准的彩色相机没有那么的灵敏，所以要用integrating彩色相机。

MCID包括3个sony DXC-950/970系列的3片彩色摄像头，还有Dage DC-330T制冷三片摄像头。

§1.1.2 定量：改变荧光团环境
改变pH（把荧光团上绑上个特殊的离子）等很多环境的因素，都可以导致荧光团发射光谱的变更。

测量这些改变是传统意义上的试管实验。

然而，发展出了很多新方法（Grynkiewicz,Poenie and Tsien,1985），这些方式使成像系统可以应用于人体细胞和细胞组成（Grinvald 1984,Guthrie,Segal and Kater,1991;
Lasser-ross and ross 1992,Regehr,Connor ang Tank 1991）,还有局部的（Blasdel 1992,Blasdel and Salama,1986,Cinelli and Kauer 1992,Haglund,Ojemann and Hochman 1992）新陈代谢或者离子环境。

图象技术可以通过感应荧光亮度的改变来定位，比如：在人体内分散的细胞，在细胞中结构实体，在一片上的一个区域或者大脑的表面。

MCID包括强大的功能，在量化荧光团环境改变的方面
§1.2 光学成像系统的特点
§1.2.1 大量的测量函数
典型的荧光测量法包括：区域、相称区域、大量的荧光目标和荧光亮度。

因此，你的图象系统应该包括密度和空间的尺寸的函数。

§1.2.2 支持ICCD、积分型CCD和彩色CCD
标准视频摄想头不是很适合荧光的应用，一个专门的低照度的摄像头是必须的，MCID 和AIS支持 ICCD和积分型CCD，你可以自由的选择。

§1.3 荧光成像系统的组成
§1.3.1 摄像头
标准的摄像头在低照度的情况下缺乏灵敏度。

低照度条件是这样定义的：发光小于20微微瓦/平方厘米，（在500nm内的）。

人眼可以看到的范围是17微微哇/平方厘米（500nm）。

人眼比标准的摄像头灵敏很多。

比如：在凝胶体中的ethidium bromide-stained DNA（细菌传染拌有绿色的荧光蛋白质GFP），这种带荧光的细胞在显微镜下人眼可以不费力气的看到，然而，同样样本就需要灵敏的摄像头来成像：
加强型CCD
ICCD有一个视频摄像头和一个图象增强器组成，增强器通过可调整的因素扩大附带照明，ICCD快又灵敏。

他们主要的缺点就是在细小的细节上效果不太好，不能采集非常昏暗样品（比如化合光、生物体的光和FISH），而且在动态范围内有很大的限制。

因此在一张图象里不能同时看到亮的和暗的因素。

ICCD 可以很好的拍摄动态荧光成像，他们的能力证明图象很快会成为一个鉴定的有利条件。

从Roper 的产品中选一个艺术类型的ICCD。

很平常的，它由高级的成分组成（包括GEN IV增强器）可以提高明暗度也有综合性能的提高。

在这个摄像头中，附带照明由图象增强器增强。

增强的光在使用者指定的时期堆积到冷冻的积分摄像头。

这个时期可以比一个视频帧的时间少，或者它可以占用很多帧的时间（Figures1-3）。

使用提高明暗度和综合性能提高，摄像头就可以采集标准ICCD捕捉不到的样本。

Figure 1
有两种典型的ICCD应用：细胞内离子变迁的荧光成像和发光成像。

为了对动态的情况进行更快的反应，合成一张视频画面。

在这方面，一个积分型的ICCD的灵敏度与艺术类型的ICCD相似。

如果是多种画面累计，那么相同的摄像头达到更高的灵敏度而且可以用于非常暗淡的样本。

Figure 2
对荧光细胞成像，使用一个中等灵敏度的摄像头，12-bit，制冷CCD摄像头（5分钟暴光），也使用我们的ICCD（one 30 second frame,averages of two and four 30 second frames）。

从100W的氙灯中发出的光，有99%都被吸收了。

可以看到ICCD的图有很多颗粒，但是制冷的CCD几乎不能看清楚。

做比较的典型的制冷CCD和ICCD的价格基本相同。

高灵敏度的制冷CCD（T1）可以做做得更好，可能比ICCD还好。

然而它需要长时间的积分，而且贵。

Figure 3
积分型ICCD积分来增加信号和噪声平台有多大效率。

我们在1-20视频画面的范围内来测量一个中等密度的目标（每张视频画面1/30秒）。

在得到最大增强时暴光。

信号增加很快。

背景却增加的很慢。

因此，和我们的积分型的相同这也可以有效的增强灵敏度。

积分型摄想头
积分型摄想头就象电影。

它们长时间堆积光。

一般的，积分型摄想头比ICCD可以提供更好的图象和更宽的动态范围。

不制冷的积分视频摄想头比较便宜，非常适合拍摄有免疫标志的细胞和亮的凝胶体这些适度的亮的样本。

对于更暗的样本，冷却的（0度左右）和制冷的（0度以下）积分视频摄想头都是划算的。

然而，不要期待任何一个视频摄想头在苛刻的样本都可以运行。

积分视频技术为了降低价格牺牲了灵敏度和动态范围（最多8-10bit）
在积分视频的上一个台阶就是一个价格适度提高积分型摄想头的大家族，它们有高分辨率和10-12bit的灵敏度。

比如：Xillix MicroImager和Hamamatsu C-4742适当的priced的摄想头，它们有高分辨率：1280*1024和中度的动态范围（10或12bit）。

Xillix不是制冷的，而且在积分时间提高到几秒的时候很有效。

比它有一点贵的Hamamtatsu有冷却功能，所以积分时间可以在长些。

这些摄想头适合拍摄中等亮度的荧光样本。

也同样可以拍摄较暗淡的EtBr凝胶体。

对于更难拍摄的样本我们使用“科学等级”——制冷摄象机。

对于“科学等级”摄想头的准确定义还在变化中，但是一般来说这些设施都是全覆盖的CCD（大多数标准视频CCD的表面都不是用来获取图象的），高精度数字转换器（>12bit），还有为了比标准摄想头获得更好灵敏度的高制冷系统。

“科学等级”摄想头适用于中等灵敏度的快速构造，或者是高灵敏度高精确度的慢速格式。

快速制冷积分型摄想头（FCI）是高速度（10 FPS）、高精确度（高速10-12bit）和中等动态范围的结合。

通过改变积分时间，FCI可以应用在很多领域中：显微镜明场、定量的射线自显迹法、凝胶体分析和荧光。

特别的，FCI摄想头可以在中等频率下产生高质量的比率荧光。

关于FCI摄想头在比率荧光方面的应用，看本文挡的下一部分。

FCI摄想头放弃了一些灵敏度换以来快速度。

对于最暗淡的样本，需要慢传出和高精度的摄想头（16 bit）。

极高灵敏度的摄想头有Roper Industries （Princeton和Photomterics）和Spectral instruments。

这些摄想头和——用于深景观察，高分辨率，16-bit精确度，有能力即使是非常暗淡的样本也可以在几秒内拍到的摄想头——相似。

获得更多细节，可以看Ultra-Low Light Imaging。

彩色摄想头
使用彩色摄想头拍摄多谱的荧光很便利，多样的氟石可以成像在单个获得物内。

然而他们也有缺点
1．彩色摄想头不是特别灵敏，需要清楚的光照样本和/或者长时间暴光。

长时间暴光的结果很复杂因为只有少数彩色摄想头可以制冷。

不制冷的话，积分时间就要限制在几秒内。

2．多谱线的激发和发射的过滤器比单色的过滤器往往是产生更高等级的背景和更宽波长的顶点
3．离散的氟石往往产生非常不同的亮度，最佳的情况就是每个氟石都有一个单独的积分时间。

也就是说：暗淡的氟石比亮的需要更长的
积分时间，可是彩色摄想头在采集多谱线的图象时只有一种积分时
间。

4．彩色摄想头对每个主要的颜色都分配8bit（256灰阶）。

相比较而言，单色积分摄想头一般的分配给任何一个单独氟石的图象都可
以从10到16bit。

就算是由最好的制冷彩色摄想头得到的图象，也比每次只对一个氟石成像后合成的质量要差。

另一方面，也不能否决在一张图象中获得多种氟石的吸引力。

选择权在你，MCID和AIS都可以提供很多彩色摄想头，包括积分彩色摄想头。

§1.3.2成像系统
从ICCD得到的一帧视频（1/30内完成）会非常的多粒。

低照度的成像通过real-time averaging改进质量。

因此，ICCD摄想头是任何成像系统的高帧频能力的一个上界。

如果成像系统还可以建立比率（ratios）和荧光背景减少那就更好了。

积分型CCD摄想头给图象系统带来了一个挑战。

比如：在定量的密度计量学或比率成像时使用积分型CCD摄想头要求有以下几点：
1．图象分析软件必须控制多样的暴光和摄想头的数据参量传输。

2．成像系统必须接受和校准高密度的数据（大多数积分型CCD都支持10bit的数据或者更高）
3．图象系统应该与积分型CCD之间有一个快速的界面。

比如：Xillix MicroImager和Hamamatsu C-4742摄想头支持数据直接的进入异步的数
字转换器通过MCID。

一般有目的的界面（SCSI）都会时成像目的变
慢。

第二章动态荧光成像
§2.1介绍
MCID 在标准的图象分析包中包括针对动态荧光的专门软件。

这样有2个好处：a）实验室中一般目的的图象分析者就可以测量ratiometric不需要任何添加软件的费用。

B）动态荧光成像在学术上并不一定非要成为独立的问题。

而是分析、存档、注解、增加，还有其他一些在荧光成像时很容易实现的，这些都可以使用我们熟悉的MCID函数
即时的动态成像
对于一些荧光成像系统，要求不管多大数据量的及时图象都要记录在一个视频存储器里面，因为在实验之后还要处理时使用。

这种双站模式（记录和分析）如果要是在不即时的情况下不但需要很多花费（必须要购买一个计算机控制的VCR或者一个视频光学磁盘）而且还会退化图象。

更进一步的话，实验的结果在数据被导入之前还不能知道。

与之不同的是：MCID可以获得大量的几乎无间隔的图象，而且是在不记录为视频的情况下。

把这种获得的图象直接传到计算机里的形式称为即时的动态成像。

即时的动态成像简单、费用低（不需要VCR或者视频光学磁盘）、而且实验操作的结果可以马上被观察到。

§2.1.1 ICCD和快速积分型CCD
动态荧光成像系统一般的需要合并几个ICCD摄想头。

ICCD有相当的灵敏度而且获得图象迅速。

而它最主要的缺点有：在图象内动态范围有很严格的限制（样本的所有部分都必须有相同的亮度）、相应的分辨率也很低。

不过最新的技术（比如GEN3）可以获得更好的分辨率，可动态范围的限制还是一样。

积分型摄想头则可以更得到非常好的图象质量（高分辨率和宽动态范围）。

然而积分型摄想头很罕见的用于动态成像。

首先：积分型的没有ICCD 快，一张积分型摄想头拍摄的图象与ICCD拍摄的比需要更多的光照或者更长时间的暴光。

其次，大多数积分型摄想头把图象从摄想头传输到计算机时艘非常的慢。

虽然低分辨率的图象（比如32*32）可以传输的很快，传输时间可以是一秒，或者高点分辨率的是2秒。

传输时间、积分时间和计算机响应时间加起来，典型的fura-2 inter-ratio intervals（640*480）需要一秒种或者更多。

这对于大多数动态应用来说太低了。

FCI摄想头提高了把图象数据传输到计算机的时间，获得图象时比只有积分时间的快很多。

不好的是FCI摄想头的灵敏度是折中的。

比如，T1有16位的灵敏度和慢的读出速度（200KHz）。

这种摄想头允许最短的可能积分时间，但是要花很长时间来传出这些数据。

相反的，FCI摄想头一般都是10位的灵敏度，需要更长时间的暴光。

但是，它们读出速度快（提高到5FPS）。

对于非常暗淡或者易碎的样本，我们需要高灵敏度的摄想头。

FCI摄想头做不到而且慢的读出速度是不可避免的。

对于相应亮度的样本，我们可以通过FCI摄想头牺牲一些灵敏度来换取快的读出速度。

如果你“单元”可以忍耐相当亮度的照明，除了MCID在FCI摄想头下使用时产生的250-750微秒的图象的时间间隔。

比率图象可以在一秒的时间内得
到，而且是宽动态范围和高细节分辨率（Figure4）。

如果你需要更短的图象的时间间隔，就可以选择ICCD。

Figure 4
ICCD摄想头和FCI摄想头比率响应都很稳定。

比率可以对AM溶液中激发出来的340和380nm激发物进行计算得出，或者通过加强获得（Hamamatsu C2400）或者通过暴光时间的改变（Hamamatsu C4880）。

加强获得改变5%-100%的范围。

伴随着一次改变，建立一个比率图象，从视野的中心开始读取（340nm；380nm；比率）。

要注意避免褪色。

FCI摄想头的设置是：X2 binning，暴光时间是50-2220微秒，按照平等的比例增加340nm和380nm的积分时间。

2种摄想头都有很好的线性。

尽管算来算去对于ICCD相关的变量比率只表现出很小的改变（大约 2nM Ca++）。

然而很明显的FCI摄想头有更好的稳定性，灰度等级在整个暴光区域都非常线性。

这些数据表明在FCI的积分周期中比率的标准都很稳定。

这就可以在对不同的单元时方便的改变积分周期了。

对于ICCD重新校准一些主要改变。

这在视场中心之外的区域是很正确的。

§2.2 Ratiometric成像：
比例成像（Ratiometric imaging）在显示光谱改变时有它的优势，荧光染料在绑住它的目标离子时就会产生光谱改变。

MCID支持多种形式的比例成像，包括fura-2(Ca++)和 BCECF（pH）。

§2.2.1 Fura-2
钙的鳌合剂（fura-2）用来测量胞液中的游离Ca++的浓度。

Fura-2饱和钙形式的最大吸光率：大约335NM。

钙的游离形式的最大吸光率大约362NM。

荧光的亮度比率通常是340：380，但是这个比率会因为溶液里饱和的和游离的钙的数量的多少而改变。

因而，与340图象的亮度关系就可以反映出fura-2相对于Ca++比例的增加。

细胞自己孵化或者注射fura-2形成了分散的340和380nm的图象。

340和380nm的图象通过适当的背景来校正后，一个比率图象就成形了。

340nm和380nm的比率可以通过下面这个简单的方程来估计Ca++的浓度。

Rmin是荧光亮度的比率（340：380），在最小的Ca++浓度时得到。

Rmax 也是荧光亮度比率（340：380）在饱和的Ca++浓度时得到。

F0/Fs是在380nm 下最小Ca++浓度和饱和Ca++浓度的荧光亮度的比率。

是关于fura-2和
Ca++的平衡分裂常数，一般都定为225
（Grynkiewicz,Poenie ,Tsien,1985;Williams,Fay,1990）。

任何一个实验室都要在自己的条件下校准fura-2技术。

光谱颜色表现出来的比率图象可以表征钙的浓度。

通过调节颜色和亮度也可以独立的表现这个比率。

在这方面，亮度反映原始构成的图象亮度（本质上
等于图象中那点上比率的confidence），而颜色则反映钙的浓度（Tsien and Harootunian,1990）。

§2.2.2 BCECF
为了测细胞内的pH而产生的一种流行的染料就是BCECF（Rink,Tsien and Pozzan,1982;Bright et al.,1987）。

BCECF荧光在可见光波长范围内很强，激发峰值是在503nm，而发射峰值是在525nm。

2个峰值都是由pH控制的，在酸性环境下减弱，在碱性环境下增强。

然而在436-439nm，荧光不受pH约束。

因此，通过独立的pH图象和不独立的pH图象就可以建立一个比率。

理论上，这种比率不会受到一些不相关的因素的影响，比如染料浓度，照明亮度等等。

为了测量 pH要设置一个过滤器，这个过滤器包括440和495nm的激发过滤器、一个515nm的二向色的镜子和一个535nm的发射过滤器。

背景要求在440-495nm。

所有的程序有有点象Ca++那个。

PH可以通过下面的方程算出。

R是格式化的495/440nm的荧光比率，在每个波长，pH7时，通过评价图象每个部分的亮度来获得。

我们给pK一个初始值7.17，不过还是建议你在自己的条件下标定。

BCECF有很多方法可以校准：使用K+/H+的离子载体，尼日利亚菌素，对已知pH值的细胞进行曝光（Thomas,et al.,1979）。

§2.2.3 校准荧光背景
我们通过2张激发图象建立一张比率图象（将使用340和380nm作为标准例子）。

比率将受到激发图象的3个主要因素的影响。

1．2个激发波长的背景的自身荧光和增强的偏亮。

2．照明视野的空间变化（阴影错误）
3．细胞内的fura-2荧光
如果我们在使用线阵摄想头或者阴影错误在每个激发波长都是一样的时候，并不需要背景校准。

在这些情况下，比率的方法不受背景的影响。

然而，摄想头（尤其是ICCD）不是线阵的，而且在随着波长在改变。

MCID提供三种模式来在比率形成前校准激发图象。

1．Subtractive：移动自身荧光和增强剂或者摄想头偏移
对任何一个340和380nm的图象背景评价。

在比率计算出来以前从340和380图象中减去背景评价。

在整个视野都有相同背景错误的
情况下很普通的使用，而且就一步。

2．Pvroportional:校准阴影错误
2种独立的方法：逐点（pixel-by-pixel）的阴影校准；整张激发图象的校准。

在每次激发获得一个空白区域（阴影区域）。

在每个阴
影区域，每个象素的错误以比例的方式快速传递。

之后，在比率在计
算出来之前，激发图象通过适当的比例就被校准了。

3．Subtractive+Pvroportional：
Subtractive 和Pvroportional的阴影校准都被使用，联合使用。

§2.2.4 交互的激发条件
从2个激发波长的图象来计算出个比率图象。

最简单的情况下，每个激发波长拍摄一个单个的图象然后建立一个比率。

然而，图象的任何顺序在比率建立之前都要获得和处理。

举个例子：在获得以下图象是我们使用帧平均来减少噪声：
1．在340nm平均8帧
2．过滤器轮换改变位置
3．在380nm平均8帧
4．建立比率
在图象平均的时间内（264ms平均8帧），样本也许会表现出bleaching （漂白）。

那么，340nm激发会导致更多的漂白，这样就会使比率数据有了偏差。

为了最小化这个问题，MCID允许有激发间隔，比如：
1．在340nm平均2帧
2．过滤器轮换改变位置
3．在380nm平均2帧
4．过滤器轮换改变位置
5．在340nm平均2帧
6．过滤器轮换改变位置
7．在380nm平均2帧
8．建立比率
在340和380nm条件下的交替使得由于在第一个波长时漂白造成比率偏差的可能性降低。

获得任意激发图象的顺序都是有可能的。

举个例子，我们可以指定一个20同步（timed）比率的间隔，每秒钟使用一次380nm图象。

然而，340nm图象每三秒使用一次。

在建立比率方面，MCID可以使用接近340nm图象建立比率，然后比率可以使用到每一个380nm图象。

§2.2.5建立图象的比率次序
Ca++动力学观察需要建立一个成功的比率。

为比率建立存储图象的最快方法就是存到图象卡的内存和/或者计算机中。

M5在图象卡上有24MB快速内存。

M5+有72MB。

当这些存储器满了以后，每个系统都可以使用非常大的计算机RAM来提高和扩展线上比率信息。

给定的拥有大内存容量的现代PC，再长的快速比率成像时间（成千上百的比率）都可以，是在没有VCR或者OMDR资源下。

短inter-Ratio时间间隔
光度计是在高频率的比率测量时的工具。

光度计执行一个简单的任务，在很小的时间间隔内，使用一个场所和发生的比率测量来测量综合的密度。

相反的，图象分析器必须获得大量在组织内描述离子的空间分配的数据。

就好象成百上千的光度计在同时读出，每一个都是图象的一小部分。

这就是荧光比率图象比制作光度计测量需要更多时间的原因。

比率成像的速度依赖于很多因素，包括：
1．不同激发波长的速度可以会改变。

2．帧平均和积分的设备。