基因芯片技术检测分枝杆菌的临床应用研究
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(23/514)、4.86%(25/5⑷、10.31%(53/514)；初治组两药均敏感的比例高于复治组(P < 0.05),而复治组单耐利福平和 耐多药的比例高于初治组(均F< 0.05)；单耐利福平ropB突变位点以531CC-T)和526(A-G)为主,单耐异烟脐突 变位点以KatG基因315CG-C)为主，耐多药中突变频率最高的是531 (C-T)/315 (G-C)。检出的7种非结核分枝 杆菌中，以胞内分枝杆菌(38.14%)、鸟分枝杆菌(31.96%)和龟/脓肿分枝杆菌(16.49%)为主。结论基因芯片技术可
本研究结果显示,MTB患者利福平/ 异烟脐的耐药率为19.65%,与陕西省西 安市报道的19.52%结果较为一致眄但
盒;50°C预热BioMixerTMII芯片杂交仪 群为主，分别占比72.96%、68.29%。不 低于新疆阿克苏地区报道的34.9%叫这
20 min以上，完成后将杂交盒平稳放入
杂交仪托盘，并注意将3只或6只杂交 组别
作者单位：315010宁波,中国科学院大
学宁波华美医院、中国科学院大学宁波生命 与健康产业研究院(孙毅、胡耀仁、髙国生、丁 源华、朱育银、陈锦春);温州医科大学检验医 学院生命科学学院(孙春丽)
通信作者：陈锦春，Email： 7107838 02@
断、治疗和控制具有重要意义。基因芯 片技术作为新兴的分子生物学技术，可 在短时间内实现分枝杆菌基因突变位点
[3] 赵建平.呼吸疾病诊疗指南[M], 3版•北
京:科学出版社,2013:31-34,68-106. [4] YE RD, SUN L. Emerging functions of
serum amyloid A in inflammation [J].J Leukoc Biol, 2015, 98(6):923-929. [5] 中华医学会重症医学分会.中国严重脓 毒症/脓毒性休克治疗指南(2014) [J].中 国实用乡村医生杂志,2015,22(16):8-11. [6] 唐小娟，侯思远，刘美，等•肝素结合蛋白在 感染性肺炎诊断中的价值分析[J]•临床 检验杂志,2020,38(1):66-69. [7] GABAY J E, SCOTT R W, CAMPANELL1 D, et al. Antibiotic proteins of hu
10(2.56) 13(10.48)
13.806 < 0.05
耐药 单耐异烟月井
21(5.38) 4(4.23) 0.948 > 0.05
表2不同性别 '年龄MTB患者的耐药情况
例数
两药敏感
耐药
单耐利福平
单耐异烟腓
375
299(79.73)
18(4.80)
19(5.07)
139
114(82.01)
5(3.60)
收稿日期= 2020-12-15 (本文编辑:陈志翔)
基因芯片技术检测分枝杆菌的临床应用研究
孙毅，胡耀仁,孙春丽，髙国生，丁源华，朱育银,陈锦春
【摘要】目的探讨基因芯片技术分析结核分枝杆菌的耐药状况，以及非结核分枝杆菌菌种分布情况。方法纳入 肺科就治患者692例，利用基因芯片技术检测痰液标本的结核分枝杆菌耐药基因，以及非结核分枝杆菌菌种情况。 结果692例检测样本中，结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌分别为514例(74.17%)、178例(25.69%)。结核分枝杆菌 对利福平和异烟腓均敏感为80.35% (413/514),单耐利福平、单耐异烟腓、耐多药(利福平和异烟腓)分别为4.47%
中，体系共计20 pl,混匀后瞬时离心。将 1.4统计方法 应用SPSS 21.0统计软 位点突变1例(1.89%)=突变频率最高的 PCR扩增管置于PCR扩增仪中，按37 °C 件进行分析,计数资料比较釆用才检验。 是 531(C^T)/315(G^C),MS 3 〜4。
600 s, 94 °C 600 s； 94 °C 30 s, 60 °C 30 s, P < 0.05为差异有统计学意义。
2.5 NTM菌种分布情况97例NTM中
72 °C 40,热循环 35 次;94 °C 30 s, 72 °C 60 s,热循环10次;72 °C 420 s进行PCR
扩增反应。
2 结果 2.1基因芯片检测结果MTB 514例
种群达7种,以胞内分枝杆菌(38.14%)、 鸟分枝杆菌(31.96%)和龟/脓肿分枝杆菌 (16.49%)为主，见封三彩图1.
者,最终纳入患者692例。 1.2主要试剂与仪器 ABIStepOnePlus 基因扩增仪XuxScanTM 10K/B微阵列 芯片扫描仪、BioMixerTM II芯片杂交 仪、SlideWasherTM 芯片洗干仪、HybSet
基因微阵列芯片杂交盒及盒盖若干套、
晶芯MTB耐药基因检测试剂盒、分枝杆 菌菌种鉴定诊断试剂盒均由北京博奥生 物集团有限公司提供。 1.3实验方法 1.3.1基因芯片检测 1.3.1.1痰标本处理及DNA提取 取 1 ml痰标本加入等量的液化液，对痰标本 进行前处理。以13 000r/min离心5 min, 弃去上清液，加入1 ml洗液于沉淀中， 混匀后继续以10 000 r/的重要检测手段。目前结核分枝杆菌耐药和非结核分枝杆菌感染形势较严峻。 【关键词】基因芯片;药物敏感性试验;分枝杆菌
doi:10.3969^.issn,1671-0800.2021.05.008 【中图分类号】R446【文献标志码】A 【文章编号】1671-0800(2021)05-0581-03
单耐异烟脐、耐多药(利福平和异烟脐)
分别占 4.47%、4.86%、10.31%。初治组
3讨论
基因芯片是通过微阵列技术将大量 己知序列的寡核昔酸片段或基因片段作
为探针，检测利福平rpoB、异烟腓katG 和inhA等多个突变位点，以便快速检测
(在杂交盒沟槽中加入200 jil纯化水)， 两药均敏感的比例高于复治组(P < 两种一线药物的耐药性。此外，该法还
结核分枝杆菌复合群(MTB)导致 的结核病是全球重要公共卫生问题，我 国系全球结核病和耐药结核病高负担国 家之一。近年来非结核分枝杆菌(NTM) 感染呈上升态势，其引发的临床表现与 结核病十分相似叫导致在诊疗过程中常 发生误诊。因此，在感染早期快速、准确 地进行分枝杆菌菌种鉴定对于疾病的诊
基金项目：宁波市科技惠民项目 (2015C50021)
盒全部放入，以使托盘平衡;运行结核耐
药基因检测芯片杂交程序，杂交条件为 初治组
50°C杂交2 h,转速为5 r/mim。 1.3.1.4洗涤干燥使用20xSSC, 10% SDS,根据需要及实际情况，按如下比例
复治组 /值 P值
配制洗涤液I和II。洗涤液I：依次将纯
人口学特征
化水,20xSSC, 10%SDS 按照 88 ： 10 ： 2
现代实用医学2021年5月第33卷第5期
• 581 •
作为肺部细菌性感染的鉴别指标，其中HBP 可以作为G -菌肺部辭的早期诊断指标。
参考文献：
[1] 陈小龙，郝琴，薛乐PCT、CRP、PA及WEC 对重症肺炎的诊断价值[J].检验医学与 临床,2017,14(6):865-867.
[2] LINDER A, SOEHNLE1N O, AKES SON P. Roles of heparin-binding protein in bac terial infections [J]. J Innate Immunity, 2010,2(5):431-43 &
1.3.1.3芯片杂交从试剂盒B中取出 杂交缓冲液,50 °C温浴使其完全融化;将 PCR产物置于PCR仪中95 °C变性5 min, 随后立即置于冰水混合物中至少3 min； 按照9 jil杂交缓冲液,3 jil+3 jil PCR产
物的比例配制杂交混合物。按照杂交盒
(74.17%),NTM 178 例(25.69%)(其中 97例进行了种群分析)。 2.2 MTB的耐药情况 514例 MTB 中,两药均敏感占80.35%,单耐利福平、
r/min离心2 min,取上清液待用。
1.3.2分枝杆菌菌种鉴定严格按照分 2.4 MTB对利福平和异烟腓相关耐药
1.3.1.2 PCR扩增按照加样顺序准备 枝杆菌菌种鉴定诊断试剂盒说明书对菌 基因突变位点分布单耐利福平mpB突
PCR反应管，并在管盖和管身做好相应 种进行鉴定，包括MTB复合群与NTM 变位点以531 (C~T)和526 (A~G)为 标记;根据样本数量分装PCR扩增试剂 的17个种或群(胞内分枝杆菌、鸟分枝 主,均为单一位点突变;单耐异烟腓突变
0〜
18
涤己经完成，即可将芯片对称的放入甩
20〜
145
干仓,点击确定开始甩干。
40〜
169
260
182
1.3.1.5扫描判读 使用晶芯Lux- /值
ScanTM 10 K/B微阵列芯片扫描仪和晶 P值
> 0.05
12(66.67) 112(77.24) 139(82.25) 150(82.42)
• 582 •
Modern Practical Medicine, May 2021, Vol. 33, No. 5
弃去上清液。向剩余沉淀中加入50pl裂 芯MTB耐药检测芯片判别系统进行信 同性别和年龄组患者的耐药率差异均无
解液，混匀后置于沸水10 min,以10000 号读取及结果判断。
统计学意义(均F > 0.05),见表2。
的检测,区别MTB和NTM,并快速鉴定 NTM种群。本文回顾性分析中国科学 院大学宁波华美医院过去4年间应用基 因芯片技术检测痰液标本的情况，揭示 MTB的耐药状况和NTM菌种分布情 况，以期为结核及相关疾病的个体化精 准治疗提供指导依据,报道如下。
1资料与方法
1.1 一般资料 本院2016年2月至 2020年9月对1654例患者进行了痰液 基因芯片检测，排除阴性(821例)、无法 判读者(14例)及结果不全者(127例)
1/2/3,每份样本3个体系，分别分装18吐将 杆菌、戈登分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、 位点以KatG基因315(G~C)为主，均为 模板DNA即上清液及对照品以2.0 pF管， 偶然分枝杆菌、凜病分枝杆菌、浅黄分枝 单一位点突变。耐多药中双位点突变46
加入到对应的3个反应体系的PCR管 杆菌等)。
例(86.79%), 3 位点突变 6 例(11.32%), 5
man polymorphonuclear leukocytes [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1989,86(24): 5610-5614. [8] HE1NZELMANN M, KIM E, HOFME1STER A, et al. Heparin binding protein (CAP37) differentially modulates endo toxin-induced cytokine production^]. Int J Surg Investig, 2001,2(6):457-466.
6(4.32)
0.334
0.343
0.123
例(％)
耐两药 18(4.62) 35(28.23)
56.713 < 0.05 例(％)
耐两药
39(10.40) 14(10.07)
0.012
入完成杂交的芯片，运行MTB耐药基因 P值 检测芯片洗涤程序进行洗涤，仪器屏幕 年龄组(岁)
显示“请将芯片放入甩干仓”时,表示洗
托架，芯片，盖片的顺序装配好杂交反应 0.05),而复治组单耐利福平和耐多药比 可以快速检测多种临床常见NTM。
盒;吸取13.5 jil杂交混合物经加样孔加
入芯片点阵中，注意不要将气泡加入反 应池中，盖好盒盖并用金属条密封杂交
例高于初治组(均P < 0.05) „见表1。 2.3不同性别、年龄MTB患者的耐药 情况 MTB患者以男性和40岁以上人
的比例配置；洗涤液II：依次将纯化水， 20xSSC按照99 : 1的比例配置；预热 SlideWasherTM芯片洗干仪，待仪器屏
幕显示“请放入芯片进行洗涤”时即可放
性别 男 女
/值
例数
390 124
表1 MTB的耐药情况
两药敏感
单耐利福平
341(87.44) 72(58.06)
51.408 < 0.05
本研究结果显示,MTB患者利福平/ 异烟脐的耐药率为19.65%,与陕西省西 安市报道的19.52%结果较为一致眄但
盒;50°C预热BioMixerTMII芯片杂交仪 群为主，分别占比72.96%、68.29%。不 低于新疆阿克苏地区报道的34.9%叫这
20 min以上，完成后将杂交盒平稳放入
杂交仪托盘，并注意将3只或6只杂交 组别
作者单位：315010宁波,中国科学院大
学宁波华美医院、中国科学院大学宁波生命 与健康产业研究院(孙毅、胡耀仁、髙国生、丁 源华、朱育银、陈锦春);温州医科大学检验医 学院生命科学学院(孙春丽)
通信作者：陈锦春，Email： 7107838 02@
断、治疗和控制具有重要意义。基因芯 片技术作为新兴的分子生物学技术，可 在短时间内实现分枝杆菌基因突变位点
[3] 赵建平.呼吸疾病诊疗指南[M], 3版•北
京:科学出版社,2013:31-34,68-106. [4] YE RD, SUN L. Emerging functions of
serum amyloid A in inflammation [J].J Leukoc Biol, 2015, 98(6):923-929. [5] 中华医学会重症医学分会.中国严重脓 毒症/脓毒性休克治疗指南(2014) [J].中 国实用乡村医生杂志,2015,22(16):8-11. [6] 唐小娟，侯思远，刘美，等•肝素结合蛋白在 感染性肺炎诊断中的价值分析[J]•临床 检验杂志,2020,38(1):66-69. [7] GABAY J E, SCOTT R W, CAMPANELL1 D, et al. Antibiotic proteins of hu
10(2.56) 13(10.48)
13.806 < 0.05
耐药 单耐异烟月井
21(5.38) 4(4.23) 0.948 > 0.05
表2不同性别 '年龄MTB患者的耐药情况
例数
两药敏感
耐药
单耐利福平
单耐异烟腓
375
299(79.73)
18(4.80)
19(5.07)
139
114(82.01)
5(3.60)
收稿日期= 2020-12-15 (本文编辑:陈志翔)
基因芯片技术检测分枝杆菌的临床应用研究
孙毅，胡耀仁,孙春丽，髙国生，丁源华，朱育银,陈锦春
【摘要】目的探讨基因芯片技术分析结核分枝杆菌的耐药状况，以及非结核分枝杆菌菌种分布情况。方法纳入 肺科就治患者692例，利用基因芯片技术检测痰液标本的结核分枝杆菌耐药基因，以及非结核分枝杆菌菌种情况。 结果692例检测样本中，结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌分别为514例(74.17%)、178例(25.69%)。结核分枝杆菌 对利福平和异烟腓均敏感为80.35% (413/514),单耐利福平、单耐异烟腓、耐多药(利福平和异烟腓)分别为4.47%
中，体系共计20 pl,混匀后瞬时离心。将 1.4统计方法 应用SPSS 21.0统计软 位点突变1例(1.89%)=突变频率最高的 PCR扩增管置于PCR扩增仪中，按37 °C 件进行分析,计数资料比较釆用才检验。 是 531(C^T)/315(G^C),MS 3 〜4。
600 s, 94 °C 600 s； 94 °C 30 s, 60 °C 30 s, P < 0.05为差异有统计学意义。
2.5 NTM菌种分布情况97例NTM中
72 °C 40,热循环 35 次;94 °C 30 s, 72 °C 60 s,热循环10次;72 °C 420 s进行PCR
扩增反应。
2 结果 2.1基因芯片检测结果MTB 514例
种群达7种,以胞内分枝杆菌(38.14%)、 鸟分枝杆菌(31.96%)和龟/脓肿分枝杆菌 (16.49%)为主，见封三彩图1.
者,最终纳入患者692例。 1.2主要试剂与仪器 ABIStepOnePlus 基因扩增仪XuxScanTM 10K/B微阵列 芯片扫描仪、BioMixerTM II芯片杂交 仪、SlideWasherTM 芯片洗干仪、HybSet
基因微阵列芯片杂交盒及盒盖若干套、
晶芯MTB耐药基因检测试剂盒、分枝杆 菌菌种鉴定诊断试剂盒均由北京博奥生 物集团有限公司提供。 1.3实验方法 1.3.1基因芯片检测 1.3.1.1痰标本处理及DNA提取 取 1 ml痰标本加入等量的液化液，对痰标本 进行前处理。以13 000r/min离心5 min, 弃去上清液，加入1 ml洗液于沉淀中， 混匀后继续以10 000 r/的重要检测手段。目前结核分枝杆菌耐药和非结核分枝杆菌感染形势较严峻。 【关键词】基因芯片;药物敏感性试验;分枝杆菌
doi:10.3969^.issn,1671-0800.2021.05.008 【中图分类号】R446【文献标志码】A 【文章编号】1671-0800(2021)05-0581-03
单耐异烟脐、耐多药(利福平和异烟脐)
分别占 4.47%、4.86%、10.31%。初治组
3讨论
基因芯片是通过微阵列技术将大量 己知序列的寡核昔酸片段或基因片段作
为探针，检测利福平rpoB、异烟腓katG 和inhA等多个突变位点，以便快速检测
(在杂交盒沟槽中加入200 jil纯化水)， 两药均敏感的比例高于复治组(P < 两种一线药物的耐药性。此外，该法还
结核分枝杆菌复合群(MTB)导致 的结核病是全球重要公共卫生问题，我 国系全球结核病和耐药结核病高负担国 家之一。近年来非结核分枝杆菌(NTM) 感染呈上升态势，其引发的临床表现与 结核病十分相似叫导致在诊疗过程中常 发生误诊。因此，在感染早期快速、准确 地进行分枝杆菌菌种鉴定对于疾病的诊
基金项目：宁波市科技惠民项目 (2015C50021)
盒全部放入，以使托盘平衡;运行结核耐
药基因检测芯片杂交程序，杂交条件为 初治组
50°C杂交2 h,转速为5 r/mim。 1.3.1.4洗涤干燥使用20xSSC, 10% SDS,根据需要及实际情况，按如下比例
复治组 /值 P值
配制洗涤液I和II。洗涤液I：依次将纯
人口学特征
化水,20xSSC, 10%SDS 按照 88 ： 10 ： 2
现代实用医学2021年5月第33卷第5期
• 581 •
作为肺部细菌性感染的鉴别指标，其中HBP 可以作为G -菌肺部辭的早期诊断指标。
参考文献：
[1] 陈小龙，郝琴，薛乐PCT、CRP、PA及WEC 对重症肺炎的诊断价值[J].检验医学与 临床,2017,14(6):865-867.
[2] LINDER A, SOEHNLE1N O, AKES SON P. Roles of heparin-binding protein in bac terial infections [J]. J Innate Immunity, 2010,2(5):431-43 &
1.3.1.3芯片杂交从试剂盒B中取出 杂交缓冲液,50 °C温浴使其完全融化;将 PCR产物置于PCR仪中95 °C变性5 min, 随后立即置于冰水混合物中至少3 min； 按照9 jil杂交缓冲液,3 jil+3 jil PCR产
物的比例配制杂交混合物。按照杂交盒
(74.17%),NTM 178 例(25.69%)(其中 97例进行了种群分析)。 2.2 MTB的耐药情况 514例 MTB 中,两药均敏感占80.35%,单耐利福平、
r/min离心2 min,取上清液待用。
1.3.2分枝杆菌菌种鉴定严格按照分 2.4 MTB对利福平和异烟腓相关耐药
1.3.1.2 PCR扩增按照加样顺序准备 枝杆菌菌种鉴定诊断试剂盒说明书对菌 基因突变位点分布单耐利福平mpB突
PCR反应管，并在管盖和管身做好相应 种进行鉴定，包括MTB复合群与NTM 变位点以531 (C~T)和526 (A~G)为 标记;根据样本数量分装PCR扩增试剂 的17个种或群(胞内分枝杆菌、鸟分枝 主,均为单一位点突变;单耐异烟腓突变
0〜
18
涤己经完成，即可将芯片对称的放入甩
20〜
145
干仓,点击确定开始甩干。
40〜
169
260
182
1.3.1.5扫描判读 使用晶芯Lux- /值
ScanTM 10 K/B微阵列芯片扫描仪和晶 P值
> 0.05
12(66.67) 112(77.24) 139(82.25) 150(82.42)
• 582 •
Modern Practical Medicine, May 2021, Vol. 33, No. 5
弃去上清液。向剩余沉淀中加入50pl裂 芯MTB耐药检测芯片判别系统进行信 同性别和年龄组患者的耐药率差异均无
解液，混匀后置于沸水10 min,以10000 号读取及结果判断。
统计学意义(均F > 0.05),见表2。
的检测,区别MTB和NTM,并快速鉴定 NTM种群。本文回顾性分析中国科学 院大学宁波华美医院过去4年间应用基 因芯片技术检测痰液标本的情况，揭示 MTB的耐药状况和NTM菌种分布情 况，以期为结核及相关疾病的个体化精 准治疗提供指导依据,报道如下。
1资料与方法
1.1 一般资料 本院2016年2月至 2020年9月对1654例患者进行了痰液 基因芯片检测，排除阴性(821例)、无法 判读者(14例)及结果不全者(127例)
1/2/3,每份样本3个体系，分别分装18吐将 杆菌、戈登分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、 位点以KatG基因315(G~C)为主，均为 模板DNA即上清液及对照品以2.0 pF管， 偶然分枝杆菌、凜病分枝杆菌、浅黄分枝 单一位点突变。耐多药中双位点突变46
加入到对应的3个反应体系的PCR管 杆菌等)。
例(86.79%), 3 位点突变 6 例(11.32%), 5
man polymorphonuclear leukocytes [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1989,86(24): 5610-5614. [8] HE1NZELMANN M, KIM E, HOFME1STER A, et al. Heparin binding protein (CAP37) differentially modulates endo toxin-induced cytokine production^]. Int J Surg Investig, 2001,2(6):457-466.
6(4.32)
0.334
0.343
0.123
例(％)
耐两药 18(4.62) 35(28.23)
56.713 < 0.05 例(％)
耐两药
39(10.40) 14(10.07)
0.012
入完成杂交的芯片，运行MTB耐药基因 P值 检测芯片洗涤程序进行洗涤，仪器屏幕 年龄组(岁)
显示“请将芯片放入甩干仓”时,表示洗
托架，芯片，盖片的顺序装配好杂交反应 0.05),而复治组单耐利福平和耐多药比 可以快速检测多种临床常见NTM。
盒;吸取13.5 jil杂交混合物经加样孔加
入芯片点阵中，注意不要将气泡加入反 应池中，盖好盒盖并用金属条密封杂交
例高于初治组(均P < 0.05) „见表1。 2.3不同性别、年龄MTB患者的耐药 情况 MTB患者以男性和40岁以上人
的比例配置；洗涤液II：依次将纯化水， 20xSSC按照99 : 1的比例配置；预热 SlideWasherTM芯片洗干仪，待仪器屏
幕显示“请放入芯片进行洗涤”时即可放
性别 男 女
/值
例数
390 124
表1 MTB的耐药情况
两药敏感
单耐利福平
341(87.44) 72(58.06)
51.408 < 0.05