妊娠大鼠肝内胆汁淤积症模型的建立

2003年2月第13卷　第1期
中国比较医学杂志
CHINESE JOURNA L OF COMPARATIVE ME LICINE February ,2003
V ol.13　N o.1
技术与方法
妊娠大鼠肝内胆汁淤积症模型的建立
田小芸　孙敬方
(南京军区南京总医院动物实验科,南京　210002)
【摘要】　目的　建立雌激素与胆酸负荷下的妊娠肝内胆汁淤积症动物模型,方法　48只Wistar 妊娠大鼠,随机分为3组,雌激素组:于妊娠第16天,颈后皮下连续注射5天苯甲酸雌二醇,5mg Πkg 体重,胆酸组:于妊娠第16天尾静脉连续注射5天游离胆酸,214mg Πkg 体重。

对照组:注射生理盐水。

于妊娠第21天,手术装置胆总管瘘管,连续收集4次胆汁。

胆汁收集前后取血、收集羊水,作石蜡切片观察肝脏的病理变化。

测定胆汁分泌量,血浆与胆汁生化指标与激素水平。

结果　雌激素(E2)处理后胆汁收集前后,血浆、羊水中和胆汁中E2均极显著升高,且显著高于胆酸处理组。

血浆中T BiL 、AST 均显著升高,CH O L 显著下降。

经雌激素和胆酸处理后的大鼠胆汁分泌量不同时间段均显著减少,胆流速度显著减慢。

病理观察显示,试验处理后孕鼠肝脏呈肝内胆汁淤积。

结果说明本试验已成功复制妊娠肝内胆汁淤积症动物模型。

【关键词】　雌激素类;胆酸类;大鼠;胆汁郁积,肝内
【中图分类号】Q95-33 【文献标识码】A 【文章编号】167127856(2003)0120024204
Establishment of Model of I ntrahepatic Cholestasis in Pregnant R ats
TI AN X iaoyun ,S UN Jing fang
(Medical Animal Experimental Center of Nanjing G eneral H ospital of P LA ,Nanjing 210002,China )
【Abstract 】　Objective T o establish an animal m odel of intrahepatic cholestasis in pregnant rats loaded with cholic acid
and estrogen.Methods Inbred Wistar rats were divided randomly into three groups.Estrogen group was injected with benzogynes 2tryl (5mg Πkg body weight )and bile acid group was injected with cholate (2.4mg Πkg body weight )for 5days starting from 16th day of pregnancy.The control group was injeced only with 0.9%NaCl.All rats were planted with a catheter into general bile duct for collecting bile samples at 21th day of pregnancy.The biological chemical parametrs and horm ones level of plasma and bile were de 2termined.The pathological lesions of livein rats were obseved.R esults The level of estrogen in plasma ,amniotic fluid and bile in estrogen group before and after estrogen treatment increased significantly ,and higher than bile acid group.In plasma of estrgen group ,level of T BiL ,AST increased and CH O L decreased significantly.The pathological changes showed intrahepatic cholestasis in pregnant rats.Conclusion The results dem onstrated it was success ful to establish an animal m odel of intrahepatic cholestasis in pregnant rats.
【K ey w ords 】　Estrogens ;Cholic acids ;Rats ;Cholestasis ,intrahepatic
[基金项目]江苏省青年基金资助(BQ98049)
[作者简介]田小芸,女(1965-),主管技师,主要从事实验动物
学与基础医学研究
胎儿期是人或动物个体发育中的重要阶段,胎
儿各器官系统的发育受来自母体和自身的多种因素
的影响。

研究母体和胎儿关系对优生优育有十分重要的意义。

妊娠肝内胆汁淤积症(Intrahepatic Chol 2estasis of Pregnancy ,CIP )是人类临床常见的高危综合征之一,发生于妊娠中、晚期,可导致早产、宫内窘迫和宫内生长发育迟缓等不良预后。

因此,深受研究者关注。

本试验用苯甲酸雌二醇和胆酸处理怀孕后
期大鼠,以建立妊娠期肝内胆汁淤积症动物模型。

通过测定生化指标、雌激素水平,以及观察肝脏的组织病理变化来探讨该病的反应特征,为研究妊娠肝内胆汁淤积症发病机制提供依据。

1　材料和方法
1.1　动物来源　近交系Wistar大鼠,清洁级,由南京大学医学临床学院医学动物中心提供,动物质量合格证号:苏动质97001,饲养观察环境合格证号:苏动环97001。

取80只近交系雌性大鼠,以♂:♀= 1:1于下班前合笼,第二天早晨检查阴道栓,检出阴道栓的妊娠第一天。

1.2　试剂及药品　胆酸(cholate),购自Sigma公司,苯甲酸雌二醇2mgΠml,上海第九制药厂生产。

1.3　给药方法
雌激素组于妊娠第16天,颈后皮下注射苯甲酸雌二醇,5mgΠkg体重,连续5天;胆酸组用生理盐水溶解,于妊娠第16天尾静脉注射游离胆酸,214mgΠkg体重,连续注射5天;对照组注射生理盐水。

1.4　血样及胆汁收集方法　于妊娠第21天,以氯胺酮120mgΠkg体重麻醉孕鼠,眶静脉采血,分离血浆。

孕鼠乃仰卧位固定,被去皮毛,剖腹,手术装置胆总管瘘管收集胆汁,连续收集4次,前三次每20分钟收集1次,第四次收集1小时。

胆汁收集完毕,再取一次血。

1.5　羊水收集与标本采集方法　剖开子宫,将每一窝羊水收集一起,注意不要使羊水流失;观察母鼠、胎鼠肝脏外观,并分别取部分组织置于10%中性甲醛溶液中固定,做常规石蜡切片、HE染色、并于光镜下观察肝脏的病理变化。

1.6　测定指标与测定方法
11611　胆汁分泌量
11612　生化指标测定总胆红素(T BiL):酶法,试剂盒由Sclav o公司提供;丙氨酸转氨酶(A LT):酶联紫外连续监测法;天冬氨酸转氨酶(AST):酶法,试剂盒由Sclav o公司提供;碱性磷酸酶(A LK P):磷酸对2硝基酚法,试剂盒由Randox公司提供;γ2谷胺酰转肽酶(GG T)酶法,试剂盒由Trace公司提供;胆固醇(CH O L):酶法,试剂盒由Unision公司提供;总胆酸(T BA):酶法:试剂盒由Randox公司提供。

11613　雌二醇(E2)采用放射免疫分析法(双抗法),试剂盒由天津德普公司提供。

1.7　数据处理　使用SPSS统计处理系统,计算 x±s。

2　实验结果
2.1　不同处理下胆汁收集后大鼠血浆、羊水和胆汁中雌二醇含量的变化　见表1。

不同处理下胆汁收集前血浆中与肝胆代谢有关的生化指标变化见表2。

不同处理孕鼠胆汁流量和胆流速度的变化见表3。

表1　不同处理下大鼠血浆、羊水和胆汁中雌二醇含量的变化(nm olΠL)
T ab.1　Estradiol level in plasma,bile and amniotic fluid in each group rats(nm olΠL)
组别G roup
血浆Plasma
胆汁收集前Before bile collection胆汁收集后A fter bile collection
羊水Amniotic fluid胆汁Bile
雌激素组Estrogen group69.837±86181533△△331942±21195233△△31041±1186833△△1071624±11512333胆酸组Cholic acid group31449±5176501662±0110801063±010********±83176对照组C ontrol group01726±0143901789±0121401041±010********±41049 33P<0.01、3P<0.05vs对照组;33P<0.01、3P<0.05vs control group
△△P<0.01、△P<0.05vs胆酸组;△△P<0.01、△P<0.05vs cholic acid group
表2　不同处理下胆汁收集前血浆中与肝胆代谢有关的生化指标变化
T ab.2　Changes of biochemical parameters in plasma of each group rats
组别G roup
T Bil
(UΠL)
A LT
(UΠL)
AST
(UΠL)
A LK P
(UΠL)
GG T
(UΠL)
CH O L
(mm olΠL)
T BA
(μm olΠL)
雌激素组Estrogen group1146±0.2733△△30.20±20.38168.90±61.0033△△103.80±34.51 1.60±1.840.47±0.2533△△21.86±15.06胆酸组Ch olic acid group 1.05±0.2529.27±7.02112.82±26.9984.45±26.993 1.64±1.03 1.60±0.27341.69±17.5633对照组C ontrol group 1.11±0.1430.70±5.81111.20±33.51114.60±21.530.90±0.57 1.87±0.2722.05±10.05 33P<0.01、3P<0.05vs对照组;33P<0.01、3P<0.05vs control group
△△P<0.01、△P<0.05vs胆酸组;△△P<0.01、△P<0.05vs ch olic acid group
表3　不同处理下不同时间大鼠胆汁分泌量和胆流速度变化
T ab.3　Changes of v olume and rate of bile excretion in each group rats
时间
T ime (min )胆汁分泌量
(μl )
V olume of bile
excretion (μl )雌激素组
Estrogen group 胆酸组
Ch olic acid group 对照组
C ontrol group 胆流速度
(μl ・100g -1・min -1)Rate of bile excretion
(μl ・100g -1・min -1)
雌激素组Estrogen group 胆酸组
Ch olic acid group 对照组
C ontrol group 0-20120.33±45.9933234.55±34.90236.57±59.27 2.39±0.963 4.24±0.50 3.79±0.7220-40102.33±42.2333△207.73±41.32211.14±90.42 2.20±0.8933△ 3.75±0.59△△ 3.50±0.8240-6085.44±36.8933△△208.86±46.86220.36±79.02 1.79±0.7733△△ 3.78±0.77△ 3.35±0.9460-120217.67±121.7433539.73±109.76624.64±196.71 1.51±0.8433△△ 3.24±0.60△△ 3.17±0.730-120
525.78±238.4633
1190.86±207.52
1296.71±409.62
1.65±0.9933△△
3.64±0.60△△
3.30±0.76△
33
P <0.01,3P <0.05vs 对照组;33P <0.01,3P <0.05vs control group
△△P <0.01,△P <0.05
vs 同组内0-20min ;△△P <0.01,△P <0.05vs intragroup 0-20min
2.2　组织病理学变化
正常孕鼠肝脏肝板以中央静脉为中心,呈放射
状排列、肝板规则,肝窦扩张良好,见图1;实验组孕鼠肝脏细胞排列紊乱,肝细胞肿胀、肝窦狭窄。

细胞脂肪变性,胞质内含有胆汁样物质,见图2、3;胎鼠肝髓外造血明显,肝窦充血,见图4。

图1　对照组孕鼠肝脏(HE ×200)
Fig.1　N ormal hepatic histology in control
rats
图2　实验组孕鼠肝脏细胞胞内含有胆汁样物质(HE ×400)
Fig.2　Intrahepatocellular bile 2like element in m odel
rats
图3　实验组孕鼠肝脏细胞脂肪变性(HE ×400)
Fig.3　Hepatocellular liparoid denaturalization in m odel
rats
图4　胎鼠肝髓外造血明显,肝窦充血(HE ×200)
Fig.4　Extramedullary hematopoiesis in fetal liver and
congestion in hepatic sinus in m odel rats
3　讨论
雌激素组E2水平显著高于胆酸组和对照组,雌激素组胆汁中E2水平也高于对照组,羊水中E2水平显著高于胆酸组和对照组,这显然是外源给入
所致。

雌激素注射后血液中T BiL、AST均显著升高, CH O L显著下降;T BiL升高可能是因胆汁分泌减少,而对T BiL排泄没有影响。

AST为细胞酶,正常时肝细胞中含量也较高,AST升高一般提示由于细胞受到损害胞膜发生破裂式通透性提高,这些酶进入血浆。

给孕鼠直接注入胆酸造成孕鼠血胆酸升高,在肝脏中淤积。

经雌激素和胆酸处理后的大鼠胆汁量与对照相比,不同时间段雌激素组与对照组相比胆汁溶量显著减少,胆流速度显著减慢,这说明雌激素和胆酸确有淤胆作用。

以上结果说明:本试验已成功复制妊娠肝内胆汁淤积症动物模型,且方法简便,易于操作。

参考文献
1]　奉曲旭,张圣道1胆汁的代谢及其与胆固醇结石的形成1医学综述,1998,4:597-600
2]　汪承柏1胆汁的排泄障碍与肝内胆汁淤积,临床肝胆病杂志, 1986,2:120-121
3]　Accatinol,Pizarro M,K oening C S,et al.E ffects of diosgenin,a plant2 derived steroid,on bile secretion and hepatocellular cholestasis in2
duced by estrogens in the rat.Hepatology,1998,28:129-140
〔收稿日期〕2001212225
论著摘要
日粮不同的钙营养水平对生长比格犬钙磷代谢的影响
吴怀文　刘源　安星兰　王志红
(军事医学科学院实验动物中心,北京　100071)
【中图分类号】Q493199 【文献标识码】B 【文章编号】167127856(2003)0120027201
日粮中钙磷的含量、配比都会影响机体钙磷代谢状况,体内钙稳定平衡的异常常引起疾病。

日粮中钙不足或过量,对骨骼成长、成型造成障碍,尤其生长阶段的犬。

试验选用20只(雌雄各半)生长阶段的比格犬,采用完全随机化设计方案,随机分配到5个处理中。

每个试验处理为日粮钙的添加水平016%、019%、112%、115%和118%。

每天定量饲喂,饮用去离子水,试验开始时准确称重。

试验过程中,进行全收粪,采用杨胜法进行处理和制样。

按国标来测定钙磷含量。

试验结束时,采空腹24小时后试犬后腿静脉血,制备血清样品。

用北京中生生物工程高技术公司生产的试剂盒及荷兰产VIT A LAB MICRO型半自动生化仪测定血清钙、磷、碱性磷酸酶。

试验数据利用G LM方法进行统计分析。

提高日粮的钙水平线性增加比格犬钙的吸收量(P< 0101)。

因为动物在生长期钙磷的吸收以被动方式占主导地位,钙磷吸收与钙磷的进食成一定的函数关系。

在低钙组钙的表观消化率显著的高于其他各组(P<0101)。

机体为了调节钙的稳态平衡,升高表观消化率来补偿日粮低的钙含量,以维持机体钙的需要。

表明机体通过调节钙的吸收率来适应日粮的高或低钙含量。

磷的吸收有赖于机体钙的代谢状况,磷的有效利用率受肠道中钙量的影响,肠道中大量的钙与磷结合成不溶性的钙—磷复合物,降低磷的吸收利用率。

另一方面也由于随钙浓度升高,肠道对钙磷的主动吸收的降低了。

因此随钙进食量的上升磷的吸收量线性减少(P< 0101),相应的磷的吸收率显著下降(P<0101)。

不同钙水平的处理组间血清钙浓度无显著变化(P> 0101),在正常参考值范围之内(212～310mm olΠl)。

本试验试犬的碱性磷酸酶活性,在日粮不同的钙水平之间无明显的变化,各处理与正常钙组的差异不显著(P>0101)。

说明在该试验日粮的钙磷水平条件下,机体尚未动用骨中的钙就能维持钙的稳态平衡。

〔收稿日期〕2002211213。