P物质缓释系统对正畸大鼠牙周破骨细胞数目的影响

Ｐ物质缓释系统对正畸大鼠牙周破骨细胞数目的影响
目的：探讨P物质纳米缓释微球的生物活性及对正畸牙周改建中破骨细胞数目变化的影响。

方法：将P物质一聚乳酸一聚乙醇酸共聚物纳米缓释微球(sP—PLGA NP)注射入正畸大鼠第一磨牙根尖水平龈下，分别在加力后1，3，7，14天后采用HE染色观察牙周组织变化和压力侧破骨细胞数目，并和单纯用P 物质以及空白对照组比较。

结果：加力后1天，三组间牙周都未发现有破骨细胞；加后3天，破骨细胞数量表现为P物质组>缓释纳米微球组>对照组，与对照组有显著性差异(P＜0．05)；加力后7天，表现为缓释纳米微球组>P物质组>对照组，与对照组有显著性差异(P＜0．05)；加力14天后，三组破骨细胞数量都有减少，但缓释纳米微球细数量最多。

结论：P物质能促进嘶中牙周破骨细胞形戍，而sP—PLGA NP能在较长时间维持这种作用。

标签：P物质；聚乳酸一聚乙醇酸共聚物；纳米微球；破骨细胞；牙齿移动P物质在正畸组织改建中发挥重要的作用，但其在体内半衰期短，很快会被
机体降解，不利于观察它的作用。

为了能在动物体内较长时间观察P物质的作用，我们选择聚乳酸一聚乙醇酸共聚物(poly lactide—co-glyc01ide，PLGA)为载体材料，应用复乳干燥法制备了P物质纳米微球。

本试验采用给正畸大鼠注射P物质缓释纳米微球，并与单纯使用P物质以及空白对照组比较，观察P物质纳米缓释微球的生物活性情况以及对牙周压力侧破骨细胞数目的影响。

1材料和方法
1．1实验动物及分组：6周龄SD雄性大鼠48只，体重：(180±20)g，解放军第四军医大学实验动物中心提供。

分笼饲养，自由摄食、饮水，饲料为本校实验动物中心提供的普通块料。

避光静养48h后进行实验。

第l组：加力后立即在第一磨牙根尖水平牙龈下注射含5×10—3rng P物质的sP—PLGA NP的PBS溶液100ul(缓释纳米微球组)；第2组：加力后立即在第一磨牙根尖水平牙龈下注射含5×10-1mgP物质的PBs 100ul(P物质组)；第3组：加力后立即在第一磨牙根尖水平牙龈下注射100ul的PBs(对照组)。

每一组中分四个亚组：加力l天组、3天组、7天组、14天组。

每一亚组4只大鼠。

1．2主要试剂与仪器：人P物质(substance P)(Sigma公司，USA)；自制P物质纳米粒及其冻干粉剂(图1)；速眠新(长春军需大学兽医研究所)；细金刚砂钻(登士柏公司)；正畸测力计(精确到1g，Swi ss)；正畸用螺旋弹簧(杭州新亚公司)；OLYMPUS数字显微镜(JaparO；JEM-2000EX 透射电镜qaparO。

1．3动物模型及标本制备：SD雄性大鼠，体重(180±20)g(7～9周)。

加力装置采用结扎丝将一根镍钛螺旋拉簧一端扎在上颌第一磨牙上，另一端结扎在上颌中切牙上，并用自凝塑料加固结扎丝与牙连接处。

加力值为50g，使磨牙向近中移动。

分别在各组时间点将各亚组大鼠处死取材：速眠新深麻，开胸经左心室插管至升主动脉进行灌注固定，先用80～lOOml生理盐水将血管内的血液冲洗干净，再注入含4％多聚甲醛的固定液400ml灌流内固定1．5h，由口腔内切开上颌骨周围软组织，剪断双侧颧突，取出上颌骨，修剪后置于4％多聚甲醛液中固定4天，然后置于由甲醛、甲酸和盐酸组成的脱钙液中脱钙10天。

将脱钙的上颌骨去除多余组织，保留磨牙，入30％蔗糖24h 4℃至组织沉底。

常规石蜡包埋后，沿近远中方向纵行切片，片厚5um。

1．4 HE染色，观察结果：切片进行HE染色：苏木素浸染lOmin，清水冲洗，入盐酸1s，冲洗，稀氨水30s，冲洗，伊红lmin，75％～100％梯度乙醇脱水，二甲苯透明，树胶封片。

每个标本取包含根尖周的切片二三张，每张切片在×40显微镜下观察压力侧牙周近根尖处组织，计数单个视野内破骨细胞数量(三核以上为纳入标准)。

1．5统计学处理：测量所得数据以x±s表示，结果用SPSS 11．0作统计学分析。

多组均数问差异性比较用方差分析(F检验)，三组问两两比较用LSD-t检验。

P＜0．05为差异有显著性。

2结果
2．1P物质纳米球胶体溶液混悬透明。

在电镜下，该纳米球表面光滑圆整，球体均匀度好，粒径分布较均匀，平均粒径(22．32±5．41)nm，见图l。

冻干粉剂为白色疏松粉末，无塌陷或萎缩现象。

4℃下放置3个月后，冻干粉再分散性良好，在生理盐水中均匀分布呈乳状液，无沉淀，表明纳米粒稳定性及再分散性良好。

P物质纳米球的载药量为(32．08±1．67)×10。

(g／g)，包封率为(66．28±3。

56)％。

该纳米微球在12天内能够一直持续释放P物质，突释期内P物质释放度为25．64％，12天后释放度为77．46％。

2．2组织切片显示：加力后1天，压力侧牙周间隙缩窄，牙周膜中有形成份减少，可见无细胞区的玻璃样变，未见破骨细胞；加力3天后，压力侧牙周组织玻璃样变性区增大，牙周膜纤维开始出现破坏，邻近的骨吸收陷窝增大，增深，可见有破骨细胞(图2)；加力7天后压力侧透明样变性区缩小，牙槽骨呈锯齿状吸收陷窝，内可见较多的破骨细胞(图3)；加力14天后压力侧牙槽骨吸收仍然明显，骨表面陷窝内有破骨细胞存在，但“锯齿”显著变小(图4)。

加力后1天，三组间牙周都未发现有破骨细胞；加力后3天，破骨细胞数量明显增加，并且P物质组>缓释纳米微球组>对照组(P＜0．05)；加力后7天，破骨细胞数量继续增多，缓释纳米微球组>P物质组>对照组(P＜0．05)；加力14天后，三组破骨细胞数量都有减少，但缓释纳米微球组数量最多，多于其它两组，但均和对照组问则无统计学差异。

该结果提示我们所制备的SP-PLGA NP能缓慢释放活性物质，同时也表明P物质能促进局部破骨细胞形成。

3讨论
P物质是一种由11个氨基酸组成的多肽易被酶水解，在体内半衰期仅有几分钟，导致其局部或全身应用的生物利用度低。

为此，本研究制备了P物质纳米微粒，能够持续释放P物质，并维持在有效生理浓度内，以利于在较长时间观察它的作用。

我们是以PLGA为载体材料，采用了单因素正交设计优化P物质纳米微粒制备工艺。

应用PLGA包封P物质，既可以起到缓释作用，又可以利用材料的疏水性保护因子活性。

PLGA是PLA(聚乳酸)和PGA(聚乙醇酸)的共聚物。

由于其具有易于合成、质量稳定，生物惰性、生物可降解性、降解速度可调节性和良好的可塑性等优点，近些年来被大量用作控释系统的骨架材料。

实验证明PLGA具有良好的生物相容性，不会引起明显炎性反应、免疫反应和细胞毒性反应。

PLGA也是美国FDA批准最早的可用于人体的高分子载药材料。

目前对于亲水性药物以PLGA为载体制备载药微球一般用复乳溶剂挥发法。

复乳法主要用于亲水性药物，例如蛋白质、疫苗等。

P物质易溶于水，溶解度为lmg／m1。

所以我们在选择制备方法时，采用了复乳法。

所制备的SP—PLGA纳米微球球体均匀度好，冻干粉为白色疏松粉末，再分散性良好。

P物质在骨质改建中具有促进骨吸收的功效。

Goto等通过大鼠颅骨实验研究发现，极微量的sP就可使颅骨的骨吸收增加。

此外，在培养的家兔破骨细胞中加入sP可使破骨细胞内的钙离子浓度增加，从而使破骨细胞的骨吸收活动增加。

这种现象可被SP受体的阻断剂所阻断。

这些试验表明SP可加速破骨细胞的骨吸收及促进骨的重建。

交感神经切除后可引起局部SP释放增加、破骨细胞数量增多及骨吸收表面积扩大。

Goto等进一步研究表明，NKl受体广泛分布于破骨细胞的胞膜及胞浆中，而在成骨细胞和其他骨细胞中较少，虽然尚没有直接证据表明SP具有刺激骨吸收的作用，但SP可能通过NKl来调节破骨细胞的骨吸收作用。

sP样神经纤维与正畸牙周组织的改建关系密切。

Davidovitch等观察了在猫上颌尖牙向远中倾斜移动过程中的P物质反应，发现加力后1hP物质免疫反应就开始增强，尤其在张力区，这种染色增加的现象一直持续到12h，但到24h，其染色密度下降到对照组水平，且一直持续到14天。

Norevall等观察了大鼠上颌第一磨牙向颊侧移动过程中的P物质反应，该实验不仅观察了加力阶段而且还包括撤力后牙周组织修复阶段。

发现加力后24h或3天，P物质免疫反应明显增强；撤力后14天P物质免疫反应仍然很强；撤力后28天P物质免疫染色强度开始下降，但仍明显高于对照组。

有学者推测在正畸牙齿移动过程中，机械刺激导致感觉神经末梢向牙周组织内释放神经介质SP、降钙素基因相关肽等，进一步激活牙周靶细胞(包括成骨细胞、破骨细胞、牙周膜成纤维细胞等)，从而影响这些细胞的生理功能，参与牙周组织的改建。

本研究发现：加力后1天，三组问牙周都未发现有破骨细胞；加力后3天，破骨细胞数量表现为P物质组>缓释纳米微球组>对照组；加力后7天，表现为缓释纳米微球组>P物质组>对照组；加力14天后，三组破骨细胞数量都有减少，但缓释纳米微球组数量最多，多于其他两组，P物质组和对照组则无统计学差别，但P物质组绝对值要高于对照组。

该结果证明了我们所制备的SP-PLGA NP能缓慢释放活性P物质，同时也表明P物质能促进正畸牙周局部破骨细胞形成。

结果也提示SP～PLGA NP可能在加速正畸骨改建中发挥作用，并需要进一步的研究证实。