大鼠不同分离纯化方法对胰岛细胞丢失的影响

第29卷第3期2008年6月西安交通大学学报(医学版)
Jo ur nal of X i an Jiao to ng U niv ersity (M edical Scie nce s)V ol.29N o.3
Jun.2008
技术方法
大鼠不同分离纯化方法对胰岛细胞丢失的影响
宋焕瑾,薛武军,李 杨,田晓辉,丁小明,冯新顺,
田普训,丁晨光,靳占奎,宋 勇,牛晓丽
(西安交通大学医学院第一附属医院肾病中心肾移植科,陕西西安 710061)
摘要:目的 探讨提高大鼠胰岛细胞产量和纯度的最佳分离纯化方法。

方法 40只大鼠分为4组,每组10只。

A 组:H anks 液灌注+胶原酶V 消化+Fico ll400梯度纯化;B 组:组织剪碎研磨+筛网过滤;C 组:胶原酶V 灌注+Fico ll400梯度纯化;D 组:胶原酶V 灌注+筛网过滤。

对用四种不同方法分离纯化的结果进行比较。

结果 完全随机设计的方差分析显示,A 、B 、C 、D 组收获量及纯度比较均有显著性差异(P <0.05);组间多重比较显示,A 组收获量均高于B 、D 组(P <0.05),与C 组比较差异无统计学意义(P >0.05);A 组纯度与其他组比较均无显著性差异(P >0.05)。

结论 用胶原酶V 或H anks 液灌注,F icoll400梯度纯化法所收获胰岛细胞的产量和纯度较高,而且价格低廉,是一种较理想的胰岛细胞分离纯化方法。

关键词:胰岛细胞;分离;纯化;大鼠
中图分类号:R355.6 文献标识码:A 文章编号:1679 8259(2008)03 0346 03
Effects of different methods of isolating and
purifying rat islet cells on their loss
Song H uanjin,Xue Wujun,Li Yang,T ian Xiaohui,Ding Xiaom ing ,Feng Xinshun,
T ian Puxun,Ding Chenguang ,Jin Zhankui,Song Yo ng,Niu Xiao li (Departm ent of Kidney Tr ansplantation,the First Affiliated H ospital,M edical Scho ol o f Xi an Jiaotong Univ er sity,Xi an 710061,China)
ABSTRAC T:Objective T o ex plo re the best me thod o f iso lat ing a nd pur ifying r at isle t cells to impr ov e the
harv est a nd pur ity o f r at isle t cells.
Methods F or ty r ats w er e divided into f our gr oups,w ith ten r ats per gr o up.
Gr o up A :R at pancre ases wer e pe rf use d with Ha nks and digest ed by colla gens V ,islet cells wer e isolated and purified by gr adient F ico ll400.G r oup B:Pancr eases w er e c ut and gr o und,then f ilter ed w ith gr id.G r oup C:R at Pancre ases wer e per fused with co llag ens V ,islet cells wer e iso lated a nd pur if ied by g r adient Ficoll400.G ro up D :Ra t pa ncr eases w ere per f used w ith co llage ns V ,but f ilter ed by gr id.T he ha rv est and pur it y o f islet ce lls fr o m f our gr oups wer e co mpare d a nd ana lysed.
Resu lts T he dif fer ences in the har vest and purity of isle t cells isolated and
purified by the f o ur m ethods (A ,B,C and D g ro ups)w ere significant by co mplete ly r andom var ia nce analy sis.Inter cla ss multiple co mpar iso n manifested that the har ve st in A g ro up was hig her than tha t in Gr o up B a nd D ,but not o bviously dif fer ent f ro m that in G ro up C.T he pur ity in A gr o up w as no t sig nif icantly dif fer ent fr o m that in other gr oups.
Conclusion T he har vest and pur ity o f isle t ce lls iso lated thr o ug h Ha nks per fusion and/o r
colla genase V digestio n wer e higher tha n tho se of o ther me thods.T he cost o f this me thod is low er,so it sugg ests that it is a be tter m etho d f or islet ce ll iso lation.
KEY WORDS:isle t cell;iso la tio n;pur if ica tio n;r at 收稿日期:2007 11 23 修回日期:2007 12 24
基金项目:国家自然科学基金资助项目(No.30471640;30571799)通讯作者:薛武军,教授,博士生导师,主任医生.
E mail:XW 5886@
作者简介:宋焕瑾(1971 ),男(汉族),博士研究生,主要从事器官移植
临床及科研工作.E mail:sh jwn h@
1型糖尿病主要因为胰岛细胞迅速被破坏,机体胰岛素分泌不足所致。

患者必须长期依赖外源性胰
岛素治疗,同时常伴有各种并发症。

胰岛移植作为治
疗1型糖尿病的方法之一,具有简捷、安全及有效等优点,其临床应用前景可观。

然而,胰岛移植手术的效果并不是很理想,一个重要的原因就是可供移植的有功能的胰岛细胞数量不足及胰腺来源困难[1 3]。

近几年来,尽管胰岛分离技术在传统的胆管胶原酶方法的基础上不断改进[4],但所获得胰岛细胞的数量、活
3期宋焕瑾,薛武军,李 杨,等.大鼠不同分离纯化方法对胰岛细胞丢失的影响
性和纯度仍有较大差异。

随着胰岛移植技术的开展,对胰岛分离技术的要求越来越高。

本研究拟用不同的方法对大鼠胰岛细胞进行分离和纯化,以寻求一种简便、快捷、廉价、高效的胰岛分离和纯化的方法。

1 材料与方法
1.1 实验动物和主要试剂 40只SD大鼠均由西安交通大学医学院实验动物中心提供。

小牛血清购自杭州四季青生物制品公司;Ficoll 400购自Pham acia 公司;胶原酶V、双硫腙DTZ购自Sig ma公司。

1.2 动物分组及胰岛细胞的分离和纯化方法 将40只SD大鼠随机分为A、B、C、D组,每组10只。

0.27g/L盐酸氯胺酮(100mg/kg)腹腔内注射麻醉,酒精浸浴消毒,取腹壁正中切口打开腹腔,显露胰腺和胆总管[5]。

A组:结扎胆总管进入十二指肠处,用4号半静脉穿刺针从胆总管注入H anks液10mL,当胰腺膨胀时迅速摘取胰腺,在解剖显微镜下仔细清除脂肪组织、血管和淋巴结,H anks液漂洗后用眼科剪剪成1-2mm3小块;把1g/L胶原酶(V型)加入剪碎的胰腺组织中,于7 恒温水浴箱中边振荡边消化20-25min,直至成小颗粒状时加入4 H anks(含10mmo l/L H epes的)洗液+10m L小牛血清,用80目不锈钢丝网过滤,将滤液离心(4 ,3000r/m in, 4min),除去上清液,再以4 H anks液洗涤两次;而尚未消化的组织再转移至0.5g/L胶原酶V中继续消化20-25min,直到组织呈沙粒状,再终止消化并离心。

取15m L刻度离心管,将上述分离的胰岛沉淀物加入3m L的250g/L Fico ll400,充分混匀,随后不连续地缓慢依次加入230g/L(3m L)、200g/L (2mL)、110g/L(2m L)的Fico ll400,2000r/m in离心10min,吸取110-200g/L及200-230g/L界面上的细胞,H anks洗液洗涤3遍。

B组:胰腺剪取后清除脂肪组织,置于80目筛网直接研磨,4 Hanks 液冲洗筛网滤液经100目筛网过滤,滤过大的血管和淋巴结等成分,滤过后再经过400目筛网过筛,收集400目筛网上的细胞。

C组:从胆总管插管注入0.5g/L胶原酶V2-3mL,胰腺完全肿胀时迅速剪下胰腺。

37 恒温水浴箱中边振荡边消化20-25m in,加入4 H anks(含10mmo l/L H epes的)洗液+10m L 小牛血清,将沉淀物加入3mL的250g/L Ficoll400,依次加入230g/L(3mL),200g/L(2mL),110g/L (2mL)的Ficoll400,2000r/min离心10min,吸取110-200g/L及200-230g/L界面上的细胞, H anks洗液洗涤3遍,收集胰岛细胞。

D组:不同于C 组的是,不用Ficoll密度梯度离心收集胰岛细胞,只用400目筛网过滤,加入4 Hanks(含10mmol/L Hepes 的)洗液稀释,收集筛网上的胰岛细胞并制成悬浊液,然后将悬浊液转移到10m L冰浴离心管内,低速离心4m in。

弃沉淀,上清重悬后再高速离心5m in,收集沉淀。

1.3 胰岛的收获量和纯度的测定 双硫腙(Diphe nylthiocarbazne,DT Z)配制方法:将100m g DT Z溶于10mL二甲亚砜(DM SO)溶液中,过滤分装,贮存在-20 。

取0.1mL细胞悬浊液,加入H anks液0.4 mL,DTZ工作液0.5mL,充分混匀,37 孵育10min,注入血球记数板的记数池中,记数各方格中的阳性细胞数。

显微镜下对阳性细胞团进行计数,每份样取3次,求其均数,再将均数转换成整份液体内的胰岛细胞数。

通过镜检胰岛悬液中胰岛数量与外分泌组织量之比来估计纯度。

每份样本取0.1m L液体涂片后再倒置显微镜下记数,每份样本取5个低倍视野,求其平均值。

故胰岛细胞的纯度=(DTZ阳性细胞数/所有细胞数) 100%。

1.4 统计学处理 采用SPSS10.0软件,对4组进行完全随机设计的方差分析(ANOVA)及多样本均数间的两两比较(LSD),以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果
2.1 胰岛形态学观察 分离后胰岛呈圆形或椭圆形,大小不等,形态完整,呈淡黄色,表面包被有包膜; DTZ染色后,胰岛细胞呈猩红色,外分泌组织不着色。

纯化后,外分泌组织明显减少(图1)。

图1 分离后胰岛细胞的DT Z染色
F ig.1DT Z dy eing o f isolated islet cells( 400)
2.2 胰岛细胞收获量和纯度 完全随机设计的方差分析显示,A、B、C、D组收获量及纯度比较均有显著性差异(P<0.05);组间多重比较显示,A组收获量均高于B、D组(P<0.05),与C组比较差异无统计学意义(P>0.05);A组纯度与其他组比较均无显著性差异(P>0.05,表1)。

347
西安交通大学学报(医学版)第29卷
表1 分离和纯化后单个胰岛细胞的收获量及胰岛细胞纯度
T able1 Ex tr action quant ity and purity of the islet cells after separat ion and pur ification( x s,n=10)
G ro up Ex tr action quantity(cells)P urity(%)
A544 4586.78 3.5
B408 51 84.30 3.1
C535 6888.39 4.4
D487 55 86.74 3.4
A:H an ks+collagens V+Ficoll400;B:cut+filtere;C:collagens V+Ficoll400;D:collagen s V+filtere. P<0.05v s.A group
3 讨 论
胰岛移植的最大障碍是胰岛细胞的来源不足,分离出高活性和高数量的胰岛细胞是成人胰岛移植成功的关键[6 7]。

由于胰岛分离纯化过程操作复杂,方法不一,人为影响因素较多,导致不同的研究中心分离结果相差较大[8]。

尽管有研究表明胰腺导管上皮细胞和胚胎干细胞在一定的条件下可以分化为分泌胰岛素的胰岛细胞[9],但从胰腺直接分离的胰岛细胞仍然是胰岛移植的主要来源,而胰岛移植成功的首要条件是获取足够有活性的胰岛。

因此,研究胰岛细胞的分离和纯化的方法具有非常大的意义。

胰腺导管灌注消化法是较常用的一种方法。

但是,大鼠的胆总管相对细小,在灌注时操作难度较大。

A组采用H anks液经胰管灌注,通过机械扩张破坏外分泌腺泡,灌注H anks液可以防止胰腺灌注后酶溶液的外漏,有利于摘取完整的胰腺,是一种价廉有效的分离方法。

B组机械研磨法操作方法简单,但是胰岛细胞获取率低,胰岛细胞的损伤大,虽然在胰岛纯度方面与A组无显著性差异,但收获量低于A组,因此直接剪取胰腺剪碎消化法不可取。

C组用胶原酶直接灌注消化,在机械扩张破坏外分泌腺泡的同时,也对外分泌腺起到初步消化的作用,明显提高了产量,节省时间,胶原酶用量少,收获量纯度与A组没有显著性差异,但是价格较昂贵,临床推广有一定的难度,可能原因与胶原酶灌注所需要的时间、温度和掌握经验有关。

在实验中为了得到大量的胰岛细胞,在各个方法的分离消化过程中,我们严格控制温度及pH值,以达到合适的消化浓度。

由于胶原酶浓度没有统一的标准,到底多少为满意的胶原酶浓度,现在没有统一的标准。

我们采用1.0g/L浓度进行消化,下一步还将对胶原酶的浓度进行进一步的研究,找到合适的胶原酶浓度进行消化。

据张桦等[10]报道,必须严格控制消化时间、温度及pH值,消化过度的胰岛容易破碎,增加分离胰腺的困难;而消化不足易形成大量片段胶原纤维,捕获游离的胰岛,减少胰岛的收获量。

张雷等[11]的经验是,为减少胶状物的形成,以获取更多的胰岛,严格控制消化温度和时间,维持pH值,消化液与胰腺的体积比大于5 1,终止消化时H anks量必须足够。

另外,本文结果表明,用滤网和Fico ll400梯度纯化比较没有统计学差异,可能原因与在获取与纯化的过程中胰岛细胞因为缺氧直接坏死和凋亡的,不可避免地造成部分胰岛丧失有关,也可能与操作技术、实验室的条件等有很大的关系。

总之,我们认为用胶原酶V或H anks液灌注, Fico ll400梯度纯化法所收获胰岛细胞的产量和纯度较高,而且价格低廉,是一种较理想的胰岛细胞分离方法。

参考文献:
[1]Ryan EA,Lakey J RT,Rajotte RV,et al.C linical outcom es
and in s ulin secretion after islet transplan tation w ith th e Edm on ton protocol[J].Diab etes,2001,50(3):710 719.
[2]L indh out DA,Th iess en A,Schieve D,et al.H igh yield expres
sion of isotopically labeled pep tides for use in NM R stud ies[J].
Protein Sci,2003,12:1786 1791.
[3]W ard CJ,Yuan D,M asyuk TV,et al.Cellular and subcellular
localiz ation of th e ARPKD protein;fibrocystin is expressed on pr imary cilia[J].Hum an M olecular Genetics,2003,12(20): 2703 2710.
[4]Venturin i M,An geli E,M affi P,et al.Tech nique,co mplica
tions,an d therapeutic efficacy of p er cutaneous transplantation of hum an p an creatic islet cells in typ e1d iabetes:th e role of US1[J].Radiology,2005,234:617 624.
[5]惠晓丽,王惠芳,刘惊涛,等.游离脂肪酸对大鼠胰岛细胞体外分
泌功能的影响[J].西安交通大学学报(医学版),2006,28(4): 173 188.
[6]Narang AS,M ahato RI.Biological and biomaterial appr oach es
for impr oved islet transplantation[J].Ph armacol Rev,2006, 58:194 243.
[7]Street C N,Lakey JRT,J am es Sh apiro AM,et al.Islet gr aft as
sess m en t in th e ed mon ton pr otocol im plications for predicting lon g term clinical outcom e[J].Diabetes,2004,53:3107 3114.
[8]常宝成,张宏,郑凝,等.大鼠胰岛分离技术的建立及胰岛活性的
影响因素[J].基础医学与临床,2006,26(9):1004 1007.
[9]Soria B,B edoya FJ,M ar tin F.Gastrointestin al stem cells I:
pancreatic stem cells[J].Am Phys iol Gas trointes t Liver Phys iol, 2005,289:G177 G180.
[10]张桦,蔡德鸿,徐春生,等.一种简易高效的大鼠胰岛分离纯化方
法[J].第一军医大学学报,2001,21(2):129 131.
[11]张雷,吴德全,孙岩,等.大鼠胰岛分离的影响因素[J].中华内
分泌代谢杂志,2002,18(6):491 492.
(编辑 卓选鹏)
348。