球等鞭金藻Δ5去饱和酶基因IgD5在拟南芥中的功能鉴定

作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(5): 928−934
/zwxb/ ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9
E-mail: xbzw@
本研究由国家自然科学基金项目(30970222)和国家转基因生物新品种培育重大专项(2009ZX08005-024B)资助。

∗
通讯作者(Corresponding authors): 亓宝秀, E-mail: qbx126@, Tel: 0538-*******; 李新征, E-mail: lxz@, Tel:
0538-*******
第一作者联系方式: E-mail: liujiang2582006@ ∗∗同等贡献(Contributed equally to this work)
Received(收稿日期): 2012-09-07; Accepted(接受日期): 2013-01-15; Published online(网络出版日期): 2013-02-19. URL: /kcms/detail/11.1809.S.20130219.1020.005.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.00928
球等鞭金藻Δ5去饱和酶基因IgD5在拟南芥中的功能鉴定
刘 江** 孙全喜** 李新征* 亓宝秀*
作物生物学国家重点实验室 / 山东农业大学生命科学学院, 山东泰安 271018
摘 要: 从球等鞭金藻中克隆到一个Δ5去饱和酶基因, 命名为IgD5。

系统发育树分析表明, 该基因编码产物与来源于巴夫藻Pavlova salina 的Δ5去饱和酶亲缘关系最近。

此前通过酿酒酵母表达系统, 证明IgD5对ω6脂肪酸具有Δ5去饱和酶活性, 但并未鉴定IgD5对ω3脂肪酸的催化活性。

我们将IgD5转化能够内源合成二高-γ-亚麻酸(DGLA, 20:3Δ8,11,14)和二十碳四烯酸(ETA, 20:4Δ8,11,14,17)的已携带2个基因的拟南芥(简称TMA2), 通过PCR 及RT-PCR 筛选阳性植株, 提取转基因阳性植株叶片总脂肪酸, 用气相色谱分析法检测到花生四烯酸(AA, 20:4Δ5,8,11,14)和二十碳五烯酸(EPA, 20:5Δ5,8,11,14,17), 含量分别达7.44%和2.07%, 转化效率分别为68%和60%, 证明IgD5在转基因植物中具有Δ5去饱和酶的活性, 对ω3/ω6脂肪酸没有明显偏好性, 并且催化活性远高于其在酵母中的活性。

在转IgD5的TMA2中除了AA 和EPA, 没有检测到其他新脂肪酸, 表明IgD5底物专一性很强, 是一个可用于植物转基因替代生产鱼油的良好基因。

关键词: 球等鞭金藻; Δ5去饱和酶; 花生四烯酸; 二十碳五烯酸; ω3脂肪酸; 拟南芥
Functional Characterization of Isochrysis galbana Δ5 Desaturase Gene IgD5 in Arabidopsis thaliana
LIU Jiang **, SUN Quan-Xi **, LI Xin-Zheng *, and QI Bao-Xiu *
State Key Laboratory of Crop Biology, College of Life Sciences, Shandong Agricultural University, Tai’an 271018, China
Abstract: We have isolated a Δ5 desaturase gene from the alga Isochrysis galbana , namely IgD5. Phylogenetic analysis showed that it shared the highest homology with a functionally characterized Δ5 desaturase from Pavlova salina . Previously, we demon-strated that IgD5 has activity towards the omega-6 fatty acid substrate by heterologous expression of IgD5 in Saccharomyces cer-evisiae . However, whether IgD5 also has activity towards the potential omega-3 fatty acid substrate has not been verified. In this study, we transformed IgD5 into a double transgenic Arabidopsis thaliana (TMA2) that can already synthesize di-homo-γ-linolenic acid (DGLA, 20:3Δ8,11,14) and eicosatetraenoic acid (ETA, 20:4Δ8,11,14,17). Triple transgenic plants were iden-tified by PCR and RT-PCR. The total fatty acids composition of the transgenic lines was determined by gas chromatography. Novel fatty acids, arachidonic acid (AA, 20:4Δ5, 8,11,14) and eicosapentaenoic acid (EPA, 20:5Δ5,8,11,14,17) were detected and ac-counted for 7.44% and 2.07% of total fatty acids, with a conversion rate of 68% and 60%, respectively, which are much higher than those in yeast. In addition, IgD5 did not show a preference for either ω3 or ω6 substrate. Furthermore, IgD5 has strong sub-strate specificity as no fatty acid products were detected except for AA and EPA. These new findings further confirmed that IgD5 is an excellent gene for the production of fish oil in plants due to its high enzyme activity coupled with substrate specificity. Keywords: Isochrysis galbana ; Δ5 desaturase; Arachidonic acid; Eicosapentaenoic acid; ω3 fatty acids; Arabidopsis thaliana
超长链多不饱和脂肪酸(very long chain poly unsatu-rated fatty acids, VLCPUFAs)是指含3个或3个以上双键且碳链长度大于18个碳原子的直链脂肪酸[1]。

VLCPUFAs 可分为两类, 其中一类为ω6脂肪酸, 如二高-γ-亚麻酸(DGLA, 20:3Δ8,11,14)和花生四烯酸(AA, 20:4Δ5, 8,11,14); 另
一类是ω3脂肪酸, 如二十碳五烯酸(EPA, 20:5Δ5,8,11,14,17)和二十二碳六烯酸(DHA, 22:6Δ4,7,10,13,16,19), 两者区别在于距离甲基端最近的第1个不饱和键的位置。

前者为6, 后者为3。

EPA 和DHA 是人及哺乳动物母乳的必要成分, 具有
第5期刘江等: 球等鞭金藻Δ5去饱和酶基因IgD5在拟南芥中的功能鉴定929
重要的生理功能。

研究表明, EPA对心血管的疏导清理有重要作用, 有效防止多种心血管疾病和炎症的发生, 增强人体免疫力[2-3]; 而DHA是大脑皮层形成、发育及发挥功能不可或缺的物质基础[4]。

高等植物中不能合成这类VLCPUFAs, 目前EPA和DHA补食的主要来源是海洋野生鱼油, 然而近几年来由于过度捕捞造成海洋野生鱼类资源日益枯竭, 使得鱼油产量已不能满足人们日益增长的需要, 而且海洋污染导致毒性化合物在鱼油中大量积累, 使得鱼油质量下降[5-6], 已不适合孕妇和幼儿补食。

所以寻找一条更为持续、稳定、安全的EPA和DHA替代生产来源成为当务之急[7-8]。

在过去20年中, 参与VLCPUFAs合成的主要基因已陆续从哺乳动物、真菌、低等植物和水生生物[9-12]中克隆到,这些基因主要分为两类, 一类编码的产物是“前端”去饱和酶, 存在于内质网中, 其N末端含有细胞色素b5结构域, 该结构域参与去饱和反应中的电子传递; 另一类编码的产物是链延长酶, 也存在于内质网中, 可以将脂肪酸链延长2个碳原子。

2004年, Qi等[13]从球等鞭金藻中克隆到第1个Δ9链延长酶, 并且将其与Δ8去饱和酶基因和Δ5去饱和酶基因一起转化模式植物拟南芥, 在转化的叶片中检测到AA和EPA, 首次验证了Δ6传统途径外Δ8替代途径的存在, 同时证明利用植物内源脂肪酸合成VLCPUFAS是可行的。

随后人们已陆续在亚麻、大豆和油菜中合成EPA和DHA, 到目前为止, 在大豆中EPA最高产量已达到19.6%, DHA达到2%[14]。

但是转基因植物中EPA和DHA产量低仍是限制其商业化生产的重要因素, 继续克隆活性更高的酶基因将是提高转基因鱼油产量的有效方法之一。

2012年, 我们从球等鞭金藻中克隆到Δ5去饱和酶基因, 命名为IgD5, 通过酵母表达鉴定, 表明IgD5能将ω6脂肪酸DGLA转化为AA, 其转化效率最高达到40.6%, 是迄今为止从海洋微藻中克隆到的活性最高的Δ5去饱和酶[15];但由于市场缺乏ω3脂肪酸ETA, 并没有测定IgD5催化ETA生成EPA的活性。

很多研究结果表明, 来源于不同物种的前端去饱和酶在酵母中进行异源表达时, 对ω3/ω6底物有偏好性[16-18]。

因此, 源于球等鞭金藻(Isochrysis galbana)的IgD5是否具有底物偏好性, 其在植物中的催化活性如何, 有必要进一步鉴定, 这都是转基因替代生产鱼油所关心的。

本研究在此基础上, 构建了IgD5植物表达载体, 转化本实验室已拥有的转Δ9链延长酶和Δ8去饱和酶双基因拟南芥TMA2[13]。

由于TMA2能内源产生DGLA和ETA, 因此我们鉴定了其对ω3脂肪酸底物的催化活性, 并对其酶活特性进行了鉴定评价, 丰富了在油料作物中转基因生产鱼油的可用基因资源。

1材料与方法
1.1试验材料及试剂
大肠杆菌XL10 (Stratagene)、植物表达载体pCambia 1300EC (CAMBIA)、农杆菌菌株GV3101、带有IgD5基因的酵母表达载体pYES2-IgD5、转Δ9链延长酶基因和Δ8去饱和酶基因的拟南芥TMA2 (生态型Col4)为本实验室保存[13]; 克隆载体pMD18-T simple、Taq酶、限制性内切酶、T4连接酶等均购自TaKaRa公司。

1.2拟南芥表达载体的构建以及农杆菌介导的遗传转化
用限制性内切酶Kpn I消化植物表达载体pCam-bia1300EC (改良的pCambia1300, 其T-DNA上带有烟草花叶病毒CaMV35S启动子及胭脂碱合成酶的nos终止子), 并用去磷酸化酶CIAP去磷酸化; 同时用Kpn I酶切酵母表达载体pYES2-IgD5上球等鞭金藻Δ5去饱和酶基因IgD5片段; 将酶切产物用琼脂糖凝胶电泳纯化回收。

将线性化载体pCambia1300EC与IgD5片段按摩尔比1∶3~1∶9用T4连接酶连接, 然后转化大肠杆菌XL10, 筛选正向连接的阳性克隆, 提取质粒, 经酶切及测序验证后, 转化农杆菌GV3101, 然后利用花序侵染法转化拟南芥[19]。

1.3转基因拟南芥的筛选与鉴定
收集农杆菌侵染后的拟南芥T0代种子, 无菌条件下用70%酒精处理1 min, 2.6%的次氯酸钠处理10 min, 再用无菌水冲洗4~5次, 播种于含潮霉素10 μg mL–1的GM 培养基上。

4℃黑暗放置1~2 d后, 转至光周期16 h/8 h (光照/黑暗)条件下培养, 待T1代潮霉素抗性的拟南芥幼苗长出2片子叶后, 移栽于基质中。

分别用SDS法和TRIzol 法提取其基因组DNA和RNA, 利用IgD5基因特异引物5'-ATGGTGGCAGGCAAATCAGG-3'和5'-CTAGTGCGT GTGCTCGTGGT-3'进行PCR检测, 5'-GCGTACAACAA CTTTCACGT-3'和5'-ACTGCCAGCCGAAAGAGACG-3'进行RT-PCR检测。

1.4 脂肪酸提取及气相色谱分析
取转化的拟南芥叶片0.5 g, 烘干并加液氮研磨后, 置3 mL的玻璃瓶中, 添加1 mL甲基化溶液(含甲醇85%, 2,2-二甲氧丙烷5%, 盐酸10%), 85℃甲基化反应1 h; 冷却后, 添加1%氯化钠1 mL, 正己烷0.5 mL, 漩涡振荡, 然后室温放置10 min或更长时间; 离心取上清液, 用日本岛津2010气相色谱仪进行气相色谱分析。

2结果与分析
2.1 IgD5的克隆与系统进化树分析
经生物信息学分析, 发现其具备“Front-end”去饱和酶的4个保守区HPGG、HxxxH、HxxHH以及LNx-QIEHHLFP[15]。

利用MEGA5.05软件对IgD5和其他14个已知功能的Δ5去饱和酶进行系统进化树分析(图1), 发现IgD5与Pavlova salina和Thraustochytrium sp.中的Δ5去饱和酶亲缘关系最近, 而Pavlova salina中的Δ5去饱和酶可以将ω3脂肪酸ETA转化为EPA, 转化率为11.3%; 因此推测IgD5也可能具有将ETA转化为EPA的活性。

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作 物 学 报 第39卷
图1 IgD5与其他14个Δ5去饱和酶的邻接法系统进化树分析
Fig. 1 Neighbor-joining phylogenetic tree of IgD5 and 14 functionally characterized delta-5 fatty acid desaturases from other species GenBank 编号分别是: CAD53323.1 (Δ5, Phytophthora megasperma ), AAL13311.1 (Δ5, Pythium irregulare ), BAA37090.1 (Δ5, Dictyostelium dis-coideum ), AAC72755.1 (Δ5, Mortierella alpina ), CAQ30478(Δ5, Mantoniella squamata ), CAL57370.1 (Δ5, Ostreococcus tauri ), AAT85663.1 (Δ5, Marchantia polymorpha ), CS020055.1 (Δ5, Physcomitrella patens ), AAL92562.1 (Δ5, Phaeodactylum tricornutum ), DQ995517.1 (Δ5, Pavlova salina ), AAM09687.1 (Δ5, Thraustochytrium sp.), AAD13294.1 (Δ5, Caenorhabditis elegans ), AAF70457.1 (Δ5, Homo sapiens ), AAH26831.1 (Δ5, Mus
musculus ).
2.2 植物表达载体pCambia1300-IgD5的构建
选择拟南芥TMA2作为材料, 通过转基因技术, 在TMA2中表达鉴定IgD5对ω3脂肪酸底物的催化活性。

用限制性内切酶Kpn I 消化pYES2-IgD5载体上IgD5 cDNA 片段, 重组到植物表达载体pCambia1300EC 多克隆位点中的Kpn I 位点上(图2)。

菌落PCR 筛选与CaMV35S 正向连接的克隆, 获得带有IgD5去饱和酶基因的植物表达载体pCambia1300-IgD5。

用限制性内切酶Kpn I 进一步酶切检测, 发现能够切下1.3 kb 的IgD5条带(图3), 表明pCambia1300-IgD5质粒上带有IgD5基因。

2.3 IgD5的转化及转基因植株的筛选与鉴定
利用花序侵染法, 将
IgD5
转化到拟南芥TMA2中, 收获的部分种子经过潮霉素筛选得到5株T 1代转基因株
图2 拟南芥pCambia1300-IgD5载体的构建 Fig. 2 Construction of the vector pCambia1300-IgD5
系, SDS 法提取转基因株系叶片基因组DNA, 以TMA2叶片基因组DNA 作对照, 利用IgD5基因特异引物进行PCR 检测, 在转基因株系中均可扩增到1.3 kb 的条带, 而TMA2中没有(图4), 因此初步确定上述5个转基因株系为阳性株系。

为了进一步验证IgD5是否在拟南芥中表达, 用Trizol 法分别提取野生型与转基因T 1代拟南芥叶片
RNA, RT-PCR 检测结果表明IgD5在转基因拟南芥中已经成功表达(图5)。

图3 pCambia1300-IgD5的Kpn I 酶切电泳图
Fig 3 Kpn I restriction digestion electrophoregram of the
recombinant plasmid pCambia 1300-IgD5
1: Kpn I 酶切的Pcambia 1300-IgD5载体; M: DNA 分子量。

1: Kpn I Digestion of pCambia 1300-IgD5 vector; M: DNA marker.
第5期
刘 江等: 球等鞭金藻Δ5去饱和酶基因IgD5在拟南芥中的功能鉴定 931
图4 转基因拟南芥(T 1)的PCR 检测
Fig. 4 Detection of transgenic lines (T 1) by PCR
以T 1代转基因植株和TMA2植株的叶片基因组为模板进行基因组
PCR 检测。

1~5: 不同的转基因株系;
WT: TMA2拟南芥为阴性对照; M: DNA 分子量。

Genomic DNA as templates for PCR analysis was extracted from leaves
of T 1 transgenic lines and TMA2 plants. 1–5: transgenic lines;
WT: TMA2 plants as negative control; M: DNA marker.
图5 转基因拟南芥(T 1)的RT-PCR 检测
Fig. 5 Detection of transgenic lines (T 1) by RT-PCR
转基因拟南芥的RT-PCR 分析, 分别从T 1代转基因植株及TMA2植
株中提取总RNA 反转录作为PCR 分析的模板。

1~5: 不同的转基因株系; WT: TMA2拟南芥为阴性对照。

RT-PCR analysis of IgD5 expression in transgenic plants. Total RNA
was isolated from T 1 transgenic and TMA2 plants.
1–5: transgenic lines; WT: TMA2 plants as negative control.
2.4 转基因拟南芥叶片脂肪酸成分分析
分别选取TMA2和转基因拟南芥T 1代叶片, 提取总脂肪酸, 用气相色谱分析检测。

在5株转基因拟南芥T 1代叶片中检测到AA 和EPA, 平均含量占到总脂肪酸的7.44%和2.07% (表1)。

IgD5转化DGLA 和ETA 生成AA
和EPA 的转化率分别为68%和60% (转化率=产物/(产物+底物)×100), 转化率都很高且相近, 表明IgD5对ω3/ω6脂肪酸底物没有偏好性。

此外, 在转基因拟南芥T 1代中, 除AA 和EPA 外, 没有检测到其他新脂肪酸, 并且表型没有改变。

2.5 IgD5与其他Δ5去饱和酶的活性比较
通过生物信息学分析比较IgD5与其他14个已知功能的Δ5去饱和酶的活性, 发现IgD5的活性仅次于线虫Caenorhabditis elegans 的Δ5去饱和酶(表2), 但不同来源的去饱和酶作用底物有所不同, 动物中的去饱和酶以酰基-CoA 中的脂肪酸为底物, 植物和微生物中的去饱和酶以磷脂特别是磷脂酰胆碱(PC)中的脂肪酸为底物[21], 而球等鞭金藻属于藻类植物, 因此IgD5更适用于VLCPUFAs 在植物
中的生产。

以前的研究结果表明, 很多已经验证功能的Δ5去饱和酶除了能够将DGLA 和ETA 分别转化为AA 和EPA, 还可以将EDA 和ETrA 分别转化二十碳三烯酸(20:3Δ5,11,14)和二十碳四烯酸(20:4Δ5,11,14,17), 并且少数Δ5去饱和酶也能以18:1Δ11为底物进行转化(表2), 而在转有IgD5的拟南芥中, 并没有检测到上述副产物, 表明IgD5专一性更强, 具有更高的应用价值。

表1 转基因拟南芥叶片脂肪酸组成分析
Table 1 Total fatty acid composition of leaves from transgenic A. thaliana
植物源 Plant source 植物源 Plant source 脂肪酸
Fatty acid (mol % of total)
TMA2
TMA2+IgD5
脂肪酸
Fatty acid (mol % of total)
TMA2
TMA2+IgD5
16:0 19.91 25.00±3.30 20:2(n-6) 2.54 4.29±0.60
16:1 1.41 1.94±0.30 20:3(n-3) 3.90 4.61±0.60
16:3 7.37 5.32±0.80 20:3(n-6) 10.40 3.49±0.50
18:0 1.82 2.62±0.30 20:4(n-3) 3.65 1.40±0.30
18:1 4.53 5.61±0.60 20:4(n-6)AA — 7.44±1.00 18:2(n-6) 9.97 12.14±1.40 20:5(n-3)EPA — 2.07±0.40 18:3(n-3) 34.48 23.87±3.20
TMA2是转球等鞭金藻Δ9链延长酶和眼虫Δ8去饱和酶2基因的拟南芥; TMA2+IgD5是转球等鞭金藻IgD5基因的TMA2拟南芥, 对5株拟南芥莲座叶检测, 每个值表示平均值±方差。

The TMA2 plants contain a Δ9-elongase gene from Isochrysis galbana and a Δ8-desaturase gene from Euglena gracilis , while the TMA2+IgD5 plants were produced by transforming the TMA2 plants with the Δ5-desaturase gene IgD5 from Isochrysis galbana. Leaves from rosette stage plants was analyzed, and each value represents the mean ± standard error from five transgenic plants.
3 讨论
海洋微藻球等鞭金藻富含DHA, 其含量可以达到12%, 推测其长链多不饱和脂肪酸合成途径中的相关去饱和酶和链延长酶活性应较高, 是一个克隆此类酶基因的理想材料。

2002年Qi 等[22]从球等鞭金藻克隆到Δ9链延长酶基因, 在酵母中的催化活性达到45%; 2004年
Suzette 等[23]从中克隆到Δ4去饱和酶基因, 在酵母中的催化活性为28%; 2012年我们从球等鞭金藻中克隆到一个Δ5去饱和酶基因, 命名为IgD5, 酵母表达鉴定表明IgD5具有将ω6脂肪酸DGLA 转化为AA 的Δ5去饱和酶活性, 催化活性最高达到40.3%。

这些基因的克隆, 表明球等鞭金藻确实是克隆该类高活性相关酶基因的良好材料。

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作 物 学 报
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表2 IgD5与其他Δ5去饱和酶在酵母中的活性比较
Table 2 Comparison of activities between IgD5 and other Δ5 desaturase genes in yeast
底物转化率 Substrate conversion rate (%)
基因 Gene 物种 Species
20:2Δ
[11,14]
20:3Δ
[11,14,17]
20:3Δ
[8,11,14]
20:4Δ
[8,11,14,15]
18:1Δ
[11]
专一性 Specificity 参考文献 Reference CED5 C.E.(a) — — 15.0 — — 未测 No test Zheng et al. [26] FAT-4 C.E.(b) 27.0
26.0
55.0
—
5.0
低 Low Watts et al. [35] Ms Δ5 M.S. 1.0 1.0 9.5 8.2 — 低 Low Hoffmann et al. [30] MpDES5 M.P. — — 6.3 23.1 — 未测 No test Kajikawa et al. [31] M.A5 M.A. — — 21.3 — — 未测 No test Michaelson et al. [12] PiDes5 P.I. — 10.0 16.4 17.1 — 低 Low Iskandarov et al. [32] PtD5 P.T. 11.8 10.8 24.7 — 2.0 低 Low Dormergue et al. [28] PsD5Des P.S. — — — 11.3 — 未测 No test Zhou et al. [20] PPDES5 P.P. 13.5 14.5 14.7 — — 低 Low Kaewsuwan et al. [11] PmFAD5 P.M. nd nd 15.0 21.0 — 高 High Hornung et al. [33] PiD5 P.IR. 19.5 15.6 32.0
— 12.1
低 Low Hong et al. [34] TpdesO T.P. 4.7 8.4 16.0 19.0 — 低 Low Tonon et al. [24] IgD5
I.G. nd nd 40.6 — —
高 High Sun et al. [15]
C.E.: Caenorhabditis elegans ; M.S.: Mantoniella squamata ; M.P.: M archantia polymorpha ; M.A.: Mortierella alpine ; P.I.: Parietochloris incise ;
P.T.: Phaeodactylum tricornutum ; P.S.: Pavlova salina ; P.P.: Physcomitrella patens ; P.M.: Phytophthora megasperma ; P.IR.: Pythium irregular ; T.P.: Thalassiosira pseudonana ; I.G.: Isochrysis galbana ; nd: not detected.
系统进化树分析结果表明IgD5与Pavlova salina 中的Δ5去饱和酶同源性最高。

很多研究结果表明, 来源于不同物种的这类前端去饱和酶在酵母中异源表达时, 对ω3/ω6脂肪酸底物有偏好性, 例如近些年陆续从Mantoniella squamata 、Micromonas pusilla 、Ostreococcus lucimarinus 、Thalassiosira pseudonana 和Primula 中克隆到的Δ6去饱和酶都被证明对外源ω3脂肪酸ALA 有偏好性[16-18,24-25], 从鱼中克隆的所有Δ6去饱和酶也被证明对ω3脂肪酸ALA 有偏好性[26]; 然而来源于Leishmania major 和Thalassiosira pseudonana 的Δ5去饱和酶却并没有对ω3/ω6底物表现出偏好性[27,24], 因此IgD5对ω3/ω6脂肪酸底物的催化活性有无偏好性有必要验证。

本研究表明, IgD5对ω6脂肪酸DGLA 和ω3脂肪酸ETA 的转化效率相近, 没有表现出对ω6与ω3不同脂肪酸底物明显的偏好性。

由于很多去饱和酶对ω6脂肪酸有偏好性, 从而导致AA 的产量很高, 需要转入Δ17去饱和酶来降低AA 的含量提高EPA 产量, 因此对ω6没有偏好性的IgD5更有利于转基因植物鱼油中EPA 含量的提高。

迄今为止, 所有克隆鉴定的Δ5去饱和酶活性比较分析表明, IgD5的活性仅次于Caenorhabditis elegans 的Δ5去饱和酶[12-14,28-35], 达到40.3%(表2), 并且在转基因拟南芥中, IgD5的活性高于其在酵母中的活性。

研究表明, 许多已知的Δ5去饱和酶对脂肪酸底物的专一性不强, 会产生20:3Δ5,11,14和20:4Δ5,11,14,17等非特异性脂肪酸, 这些脂肪酸在天然鱼油中是不含有的, 而本研究中, 在转IgD5基因的拟南芥TMA2中除了检测到AA 和EPA 外, 并没有检测到像上面所描述的一些非特异性脂肪酸, 也没有检测到其他新的脂肪酸, 这与在酵母中的表达结果一致[15],
表明IgD5具有很强的底物专一性(表2)。

由于Δ5去饱和酶催化的是EPA Δ6和Δ8两条合成途径中都必经的最后一步反应, 因此选择高催化活性、强底物专一性并且对ω3/ω6脂肪酸底物没有催化偏好性的IgD5, 对无论采用哪条途径在转基因植物中合成EPA 都具有很高的应用价值。

所以IgD5是转基因植物鱼油生产过程中一个可供选择的理想基因资源。

References
[1] Napier J A, Sayanova O. The production of very-long-chain
PUFA biosynthesis in transgenic plants: towards a sustainable source of fish oils. Proc Nutr Soc , 2005, 64: 87–93
[2] Funk C D. Prostaglandins and leukotrienes: advances in eico-sanoid biology. Science , 2001, 294: 1871–1875
[3] Simopoulos A P. Omega-3 fatty acids in inflammation and auto-immune diseases. J Am Coll Nutr , 2002, 21: 495–505
[4] Uauy R, Hoffman D R, Peirano P, Birch D G, Birch E E. Essen-tial fatty acids in visual and brain development. Lipids , 2001, 36: 885–895
[5] Heinz E. First breakthroughs in sustainable production of “oce-anic fatty acids.” Eur J Lipid Sci Technol , 2006, 108: 1–3 [6] Y okoo E M, V alente J G , Grattan L, Schmidt S L, Platt I, Silbergeld E K.
Low level methylmercury exposure affects neuropsychological function in adults. Environ Health: A Global Access Sci Sour , 2003, 2: 8
[7] Domergue F, Abbadi A, Heinz E. Relief for fish stocks: oceanic
fatty acids in transgenic oilseeds. Trends Plant Sci , 2005, 10: 112–116
第5期刘江等: 球等鞭金藻Δ5去饱和酶基因IgD5在拟南芥中的功能鉴定933
[8]Kinney A J. Metabolic engineering in plants for human health
and nutrition. Curr Opin Plant Biol, 2006, 17: 130–38
[9]Hamada F, Otani M, Kim S H, Uchida H, Kajikawa M. Accumu-
lation of γ-linolenic acid by overexpression of a liverwort Δ6 de-
saturase gene in transgenic rice. Plant Cell Physiol, 2006, 47(suppl-l): 195
[10]Michaelson L V, Napier J A, Lewis M, Griffiths G, Lazarus C M,
Stobart A K. Functional identification of a fatty acid Δ5 desatu-
rase gene from Caenorhabditis elegans. FEBS Lett, 1998, 439: 215–218
[11]Kaewsuwan S, Cahoon E B, Perroud P F, Wiwat C, Panvisavas N,
Quatrano R S. Identification and functional characterization of the moss Physcomitrella patens delta5-desaturase gene involved in arachidonic and eicosapentaenoic acid biosynthesis. J Biol Chem, 2006, 281: 21988–21997
[12]Michaelson L V, Lazarus C M, Griffiths G, Napier J A, Stobart A
K. Isolation of a Δ5-fatty acid desaturase gene from Mortierella alpina. J Biol Chem, 1998, 273: 19055–19059
[13]Qi B X, Fraser T, Mugford S, Dobson G, Sayanova O, Butler J,
Napier J A, Stobart A K, Lazarus M C. Production of very long chain polyunsaturated omega-3 and omega-6 fatty acids in plants.
Nat Biotechnol, 2004, 22: 739–745
[14]Kinney A J, Cahoon E B, Damude H G, Hitz W D, Kolar C W,
Liu Z B. Production of very long chain polyunsaturated fatty ac-
ids in oilseed plants. WO 2004/071467 A2, 2004
[15]Sun Q-X(孙全喜), Li X-Y(李雪滢), Zheng D-S(郑德松), Liu
J(刘江), Li X-Z(李新征), Qi B-X(亓宝秀). Isolation and func-
tional analysis of a Δ5 desaturase from Isochrysis galbana. Acta Hyd Sin (水生生物学报), 2012, 36(3): 412–419 (in Chinese with English abstract)
[16]Hoffmann M, Wagner M, Abbadi A, Fulda M, Feussner I. Meta-
bolic engineering of ω3-very long chain polyunsaturated fatty acid production by an exclusively acyl-CoA-dependent pathway.
J Biol Chem , 2008, 283: 22352–22362
[17]Petrie J R, Shrestha P, Mansour M P, Nichols P D, Liu Q, Singh S
P. Metabolic engineering of omega-3 long-chain polyunsaturated fatty acids in plants using an acyl-CoA Δ6-desaturase with ω3-preference from the marine microalga Micromonas pusilla.
Met Eng, 2010, 12: 233–240
[18]Petrie J R, Liu Q, Mackenzie A M, Shrestha P, Mansour M P,
Robert S S, Frampton D F, Blackburn S I, Nichols P D, Singh S P.
Isolation and characterisation of a high-efficiency desaturase and elongases from microalgae for transgenic LC-PUFA production.
Mar Biotechnol, 2010 12: 233–240
[19]Clough S J, Bent A F. Floral dip: a simplified method for Agro-
bacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana.
Plant J, 1998, 16: 735–743
[20]Zhou X R, Robert S S, Petrie J R, Frampton D M F, Mansour M P,
Blackburn S I, Nichols P D, Green A G, Singh S P. Isolation and characterization of genes from the marine microalga Pavlova sa-lina encoding three front-end desaturases involved in docosa-hexaenoic acid biosynthesis. Phytochemistry, 2007, 68: 785–96 [21]Venegas-Calerón M, Sayanova O, Napier J A. An alternative to
fish oils: metabolic engineering of oil-seed crops to produce omega-3 long chain polyunsaturated fatty acids. Prog Lipid Res, 2010, 49: 108–119
[22]Qi B, Beaudoin F, FraseR T, Stobart A K, Napier J A, Lazarus C
M. Identification of a cDNA encoding a novel C18-delta(9) polyunsaturated fatty acid-specific elongating activity from the docosahexaenoic acid (DHA)-producing microalga, Isochrysis galbana. FEBS Lett, 2002, 510: 159–165
[23]Pereira S L, Leonard A E, Huang Y S, Chuang L T, Mukerji P.
Identification of two novel microalgal enzymes involved in the conversion of the omega3-fatty acid, eicosapentaenoic acid, into docosahexaenoic acid. Biochem J, 2004, 384(Pt 2): 357–366 [24]Tonon T, Sayanova O, Michaelson L V, Qing R, Harvey D, Lar-
son T R, Li Y, Napier J A, Graham I A. Fatty acid desaturases from the microalga Thalassiosira pseudonana. FEBS J, 2005, 272: 3401–3412
[25]Sayanova O, Beaudoin F, Michaelson V L, Shewry R P, Napier J
A. Identification of Primula fatty acid Δ6-desaturases with n-3
substrate preference. FEBS Lett, 2003, 542: 100–104
[26]Zheng X Z, Ding Z K, Xu Y Q, Monroig O, Morais S, Tocher D
R. Physiological roles of fatty acyl desaturases and elongases in marine fish: Characterisation of cDNA of fatty acyl Δ6 desaturase and elovl5 elongase of cobia (Rachycentron canadum). Aquacul-ture, 2009, 290: 122–131
[27]Tripodi K E J, Buttigliero L V, Altabe S G, Uttaro A D. Func-
tional characterization of front-end desaturases from trypanoso-
matids depicts the first polyunsaturated fatty acid biosynthetic pathway from a parasitic protozoan. FEBS J, 2006, 273: 271–280 [28]Dormergue F, Lercgl J, Zahringer U, Heinz E. Cloning and func-
tional characterization of Phaeodactylum tricornutum front-end desaturases involved in eicosapentaenoic acid biosynthesis. Eur J Biochem, 2002, 269, 4105–4113
[29]Cho H P, Nakamura M, Clarke S D. Cloning, expression, and
fatty acid regulation of the human Δ5 desaturase. J Biol Chem, 1999, 274: 37335–37339
[30]Hoffmann M, Wagner M, Abbadi A, Fulda M, Feussner I. Meta-
bolic engineering of ω3-very long chain polyunsaturated fatty
934作物学报第39卷
acid production by an exclusively acyl-CoA-dependent pathway.
J Biol Chem, 2008, 283: 22352–22362
[31]Kajikawa M, Yamato K T, Kohzu Y, Nojiri M, Sakuradani E,
Shimizu S, Sakai Y, Fukuzawa H, Ohyama K. Isolation and characterization of Δ6-desaturase, an ELO-like enzyme and Δ5-desaturase from the liverwort Marchantia polymorpha and production of arachidonic and eicosapentaenoic acids in the me-
thylotrophic yeast Pichia pastoris. Plant Mol Biol, 2004, 54: 335–352
[32]Iskandarov U, Goldberg J L, Cohen Z. Identification and Char-
acterization of Δ12, Δ6, and Δ5 Desaturases from the Green Mi-
croalga Parietochloris incisa. Lipids, 2010, 45: 519–530 [33]Hornung E, Korfei M, Pernstich C, Struss A, Kindl H, Fulda M,
Feussner I. Specific formation of arachidonic acid and ei-
cosapentaenoic acid by a front-end Δ5-desaturase from Phy-
tophthora megasperm a. Biochim Biophys Acta, 2005, 1686: 181–189
[34]Hong H, Datla N, MacKenzie S L, Qiu X. Isolation and charac-
terization of a delta5 FA desaturase from Pythium irregulare by heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae and oilseed crops. Lipids, 2002, 37: 863–868
[35]Watts J L, Browse J. Isolation and characterization of a delta
5-fatty acid desaturase from Caenorhabditis elegans. Arch Bio-
chem Biophys, 1999, 362: 175–182。