格列齐特联用羟苯磺酸钙对糖尿病视网膜病变大鼠PKC、VEGF、HIF-1α表达的影响

格列齐特联用羟苯磺酸钙对糖尿病视网膜病变大鼠PKC、
VEGF、HIF-1α表达的影响
王闪闪;程贤琨;潘文强;丁伯平;黄帧桧
【摘要】目的观察格列齐特联用羟苯磺酸钙对糖尿病视网膜病变(DR)大鼠蛋白激酶C(PKC)、低氧诱导因子1α(HIF-1α)、血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响.方法雄性SD大鼠55只,随机抽取9只作为正常对照组,其余给予高糖高脂饮食+腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病模型.将造模成功的大鼠随机分为糖尿病模型组、格列齐特组、羟苯磺酸钙组和格列齐特联合羟苯磺酸钙组.每两周测得各组大鼠的体重,各组按设计剂量灌胃给药,给药前和给药后测大鼠的空腹血糖,West-ern Blot法检测视网膜组织中PKC、HIF-1α、VEGF相关蛋白表达.结果经8周灌胃给药后的各项检测指标结果显示:与正常组相比,糖尿病模型组大鼠体重出现明显下降
(P<0.01),羟苯磺酸钙给药组大鼠体重也表现出明显降低(P<0.01);与模型组相比,格列齐特给药组大鼠体重下降减弱(P<0.01),且格列齐特给药组大鼠空腹血糖显著降低(P<0.01);与模型组相比,格列齐特给药组大鼠视网膜病理性损伤得到明显改善,且格列齐特羟苯磺酸钙联合用药组改善作用更为明显;与模型组相比,格列齐特给药组中PKC(P<0.05)、HIF-1α(P<0.01)和VEGF(P<0.05)蛋白表达明显下调,联合用药组的VEGF蛋白表达下调较单个给药组更为明显.结论格列齐特联用羟苯磺酸钙对糖尿病模型大鼠视网膜病变有明显改善作用,其机制可能与降低视网膜中VEGF的蛋白表达有关.
【期刊名称】《牡丹江医学院学报》
【年(卷),期】2019(040)003
【总页数】4页(P11-14)
【关键词】格列齐特;羟苯磺酸钙;视网膜病变;PKC;VEGF;HIF-1α
【作者】王闪闪;程贤琨;潘文强;丁伯平;黄帧桧
【作者单位】皖南医学院药理学教研室;中药药理国家三级实验室,安徽芜湖241002;;;
【正文语种】中文
【中图分类】R587.2;R774.1
全球糖尿病患者人口逐年增加，近几年增速明显，国际糖尿病联合会(IDF)预计，到2035年糖尿病患者将要达到5.92亿[1]。

糖尿病视网膜病变是糖尿病最严重和常见的微血管并发症之一，也是导致人类失明的常见原因之一。

二脂酰甘油-蛋白激酶C信号通路是导致DR重要的信号途径，VEGF是其重要的下游分子，大量研究表明持续的高血糖,缺氧可以激活PKC、HIF-1α、诱导新生血管的生成。

格列齐特是第二代磺酰脲类的降糖药物，主要是刺激胰岛细胞分泌胰岛素来降低血糖，对糖尿病的血管功能具有保护作用[2]。

羟苯磺酸钙是一种血管保护剂，改善微循环的药物，最早被用于治疗糖尿病视网膜病变，它可以降低毛细血管的通透性阻止血管内膜的损伤增强抗氧化能力，本实验旨在观察格列齐特联用羟苯磺酸钙对糖尿病模型大鼠视网膜病变是否具有改善作用，并初步探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法
1.1 实验的药品与试剂格列齐特：分子式C15H21N3O3S，分子量323.4，
80mg/片(石家庄以岭药业股份有限公司，批号：A1602001)；羟苯磺酸钙：分子式C12H10CaO10S2H2O，分子量436.42，0.25g/片(海南林恒制药股份有限公
司，批号：170318)；链脲佐菌素(合肥碧信生物科技有限公司，编号：S8050)；BCA蛋白检测试剂盒(江苏碧云天生物技术研究所，编号P0012S)；PKC抗体(武
汉博士德生物科技有限公司，编号：BM0401)；VEGF 抗体(江苏碧云天生物技术研究所，产品编号：AV202)；HIF-1α抗体(江苏碧云天生物技术研究所，产品编号：AH339)；兔抗小鼠IgG(武汉博士德生物科技有限公司，编号:BA10560)；山羊抗兔IgG(江苏碧云天生物技术研究所，产品编号：A0279)；β-actin 抗体(武汉博士德生物科技有限公司，编号：BM0627)；三诺安稳血糖仪及同批号血糖试纸。

1.2 实验动物 8周龄雄性SD大鼠55只体重(200±20)g，购于南京市江宁区青龙
山动物繁殖场[动物许可证号:SCXK(浙)2014-0001]。

试验期间，大鼠饲养于温度22～25℃，相对湿度60%～70%的环境下，自然光照，定时进食和饮水。

1.3 大鼠的造模及分组普通饲料适应期喂养1w，随机抽取9只大鼠作为正常对照组(A组，生理盐水，5mL/kg·d，n=9)，剩下的大鼠采用高糖高脂饲料喂养4w腹腔注射STZ 45mg/kg。

72h之后大鼠尾静脉取血，测量造模大鼠空腹血糖
≥16.7mmol/L视为造模成功，将造模成功的37只大鼠随机分为4组：糖尿病模
型组(B组，生理盐水,5mL/kg·d,n=9)、格列齐特组(C组，25mg/kg·d，n=9)、
羟苯磺酸钙组(D组，150mg/kg·d，n=10)、格列齐特联合羟苯磺酸钙组(E组，12.5mg/kg·d+75mg/kg·d，n=9)，按照上述剂量每天8点至10点大鼠灌胃给药，正常对照组和模型组给予相同剂量的生理盐水。

1.4 大鼠的一般情况观察大鼠的饮食情况，体重，毛发，精神状态。

在给药之前
以及给药之后第2周、4周、6周、8周测各组大鼠的体重，给药之前和给药之后测各组大鼠的空腹血糖。

1.5 常规HE染色灌胃给药8w之后各组大鼠禁食12h，腹腔注射麻醉剂25%的
乌拉坦(4mL/kg)。

取大鼠右眼，使用生理盐水反复冲洗，去除眼前节，玻璃体，
将含有视网膜组织的眼杯放置在4%多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋，切片并进行
常规HE染色，采用中性树胶封片，在400倍光镜下观察各组大鼠视网膜病理组
织学的变化。

1.6 Western Blot法检测蛋白低温提取组织蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度。

每孔上样60 μg蛋白，10%SDS-PAGE分离样品之后转膜，5%牛奶封闭，分别滴加β-actin(1:400)、一抗PKC(1:200)、VEGF(1:1000)、HIF-1α(1：500)4℃过夜，
洗膜，二抗(1:2000)室温孵育2h。

洗膜后将ECL化学发光剂滴到PVDF膜的正面，采用凝胶成像系统进行拍照，选取合适的条带用AIC(AIphaView)软件进行蛋白条带分析。

1.7 统计学方法采用DAS 3.0软件进行统计学数据分析，用“均数±标准差”表示，多组间均数比较采用方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 各组大鼠一般情况正常对照组大鼠生活状态活跃，毛发干净整齐有光泽，大
便为颗粒状，尿液为淡黄色，体重逐渐增加。

糖尿病模型组大鼠出现精神状态不佳，萎靡不振、多食、多饮、体型瘦小、毛发疏松无光泽、掉毛严重，反应比较迟钝、容易发怒。

各用药组相比较糖尿病模型组，上述情况均有不同程度的改善。

2.2 各组大鼠的体重的变化情况与正常组相比，糖尿病模型组大鼠的体重显著下
降(P<0.01)；与糖尿病模型组相比，在给予药物治疗8w之后，格列齐特组大鼠的体重有所升高(P<0.01)，联合用药组大鼠的体重也有明显升高(P<0.01)而羟苯磺
酸钙组有改变，但差异无统计学意义。

表1。

表1 造模后不同阶段各组大鼠体重的变化情况组别 n 0w2w4w6w8wA组
9345.50±10.84369.87±8.94385.97±11.57402.00±14.02435.39±17.37B组9318.59±12.57∗∗308.80±15.58∗∗296.49±17.66∗∗275.48±10.86∗∗254.84±14.50∗∗C组
9320.05±12.86∗∗332.61±10.67∗∗##340.48±8.35∗∗##343.49±11.67∗∗##35
1.39±9.34∗∗##D组
10316.51±13.03∗∗312.86±10.19∗∗302.72±13.00∗∗281.06±9.61∗∗260.98±17.53∗∗E组
9322.92±9.95∗314.80±16.86∗∗319.00±18.45∗∗#325.55±14.00∗∗##332.31±14.91∗∗##
注：与A组相比，*P<0.05,**P<0.01;与B组相比，#P <0.05,##P<0.01
2.3 各组大鼠的空腹血糖情况与正常组相比，糖尿病模型组大鼠的空腹血糖含量明显升高(P<0.01)，在药物治疗8w之后，与糖尿病模型组相比，格列齐特组和联合用药组的空腹血糖显著下降(P<0.01)，羟苯磺酸钙组没有明显影响。

与格列齐特组相比，联用组的降糖效果不及格列齐特单用药组(表2)。

表2 各组大鼠的空腹血糖情况组别给药前FBG(mmol/L)给药后FBG(mmol/L)A 组5.97±0.406.24±0.54B组19.99±2.04∗∗22.10±2.09∗∗C组
20.03±1.96∗∗10.62±1.81∗∗##D组21.10±2.25∗∗19.80±2.00∗∗E组
19.95±2.33∗∗14.92 ±1.95∗∗##
注：与A组相比，*P<0.05,**P<0.01;与B组相比，#P <0.05,##P<0.01
2.4 各组大鼠视网膜组织的病理学观察显微镜下观察，空白对照组大鼠视网膜组织的各个结构层次清晰分明，组织结构形态完整，细胞形态完好，细胞有序排列。

与空白组比较，模型组视网膜组织细胞排列紊乱没有规则，有明显水肿，各层结构有疏松的情况；与模型组相比，各用药上述情况都有不同程度的改善；与单用药组相比，联用组视网膜组织病理改善最为明显(图1)。

图1 各组大鼠视网膜组织HE染色的结果(×400)
2.5 视网膜组织中PKC,VEGF 和 HIF-1a 的表达与正常组相比，糖尿病模型组PKC(P<0.01)、HIF-1α(P<0.01)、VEGF(P<0.01)蛋白表达显著升高；与模型组相比，格列齐特给药组中PKC(P<0.05)、HIF-1α(P<0.01)和VEGF(P<0.05)蛋白表
达明显下调；与单用药组相比，联合用药组PKC和HIF-1α蛋白表达虽有下降趋势，但无统计学意义；与格列齐特组相比，联合用药组VEGF蛋白表达下降明显(P<0.05)和羟苯磺酸钙组相比无统计学意义(图2)。

图2 各组大鼠视网膜组织PKC、VEGF和HIF-1α蛋白的表达注:与A组相比，
*P<0.05,**P<0.01;与B组相比，#P<0.05,##P<0.01；与C组相比，&P<0.05，&&P<0.01;与D相比，△P<0.05，△△P<0.01
3 讨论
糖尿病是胰岛素分泌绝对或者相对不足产生血糖、血脂代谢紊乱为特征的慢性疾病，会引起血液循环障碍，导致视网膜组织缺血和缺氧、组织水肿，广泛的新生血管生成，最终引发视网膜病变[3]。

糖尿病视网膜病变是最常见的微血管并发症，严重
时可导致DM患者失明。

近几年，糖尿病患者人数及致盲率都在增加,视网膜病变
的发病机制很复杂，目前仍不完全明确。

糖尿病视网膜病变发生和发展的关键的因素是高血糖[4]。

有研究表明PKC的激活在糖尿病视网膜病变过程中占有至关重要的作用[5]。

PKC是由多种同工酶组成丝
氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，广泛的存在于视网膜，肾脏，心脏等组织中。

长期的
高血糖可以增加第二信使甘油二酯(diacylglycerol，DAG)的含量，生成的DAG
可以激活PKC，形成了DAG-PKC信号通路。

糖尿病的心血管并发症的相关组织如：视网膜组织、肾脏、动脉、心脏等组织中DAG的含量都有不同程度的升高。

PKC激活的情况下可以引起ET -1表达增加，ET -1可以使血管强烈的收缩、阻碍动脉血管的血流使血液流动的速率减慢，影响血管的内皮功能，引起视网膜的损伤[6]。

同时PKC还可以激活血管内皮因子释放，VEGF在新生血管的形成中占有重
要角色,是新生毛细血管的调控因子[7]。

在糖尿病患者体内血管的内皮细胞损伤，
血管渗透性增高，新生血管产生可导致的微循环障碍从而引起局部组织缺氧[8-10]。

在局部组织缺氧高血糖情况下，激活缺氧诱导因子-1，促使VEGF的表达水平提
高[11]。

VEGF因子可通过诱导毛细血管腔的形成，细胞迁移以及细胞增殖促进毛细血管的发生和成长，血管通透性增加，引起糖尿病的视网膜病变。

本试验目的是考察格列齐特联用羟苯磺酸钙对糖尿病视网膜病变的治疗效果，故试验设计中各单用药组以相关文献中的剂量作为本试验剂量，联合用药组两种药物剂量分别减半以考察联合用药的效果。

实验结果显示，通过HE染色观察发现，糖尿病模型组大鼠视网膜组织形态出现改变，细胞排列紊乱没有规则，水肿明显，各层结构有疏松的情况且细胞数量减少，说明长期的高血糖可引起大鼠视网膜产生病理性损伤。

当各用药组连续治疗8w后，视网膜组织细胞排列紊乱的程度减弱，细胞数量部分恢复，损伤程度得到明显改善，表明各治疗组具有缓解糖尿病大鼠视网膜损伤的作用，联合用药组对糖尿病视网膜病变的改善作用更加明显。

格列齐特对糖尿病大鼠的血糖体重影响较大，羟苯磺酸钙是微血管保护剂，对血糖和体重影响较小。

糖尿病模型组大鼠视网膜组织中相关蛋白PKC、HIF-lα和VEGF出现明显的增加，格列齐特组和羟苯磺酸钙组治疗之后，PKC、HIF-lα和VEGF的表达均有不同程度的降低，说明格列齐特对糖尿病视网膜病变有影响。

与单用药组相比，联用组VEGF蛋白表达的下调最为显著，预示联合用药在视网膜病变中的作用更为重要。

综上所述，各用药组均可下调糖尿病大鼠PKC、HIF-lα和VEGF蛋白的表达，改善视网膜组织病变；其中格列齐特联用羟苯磺酸钙组的改善效果最为显著，下调VEGF蛋白的表达最为明显，提示PKC、HIF-lα和VEGF三者当中，VEGF在视网膜病变中发挥主要作用。

但确切的机制有待今后进一步的研究。

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