苹果砧木耐盐变异体的生理生化及分子生物学分析

苹果砧木耐盐变异体的生理生化及分子生物学分析
李振侠;徐继忠;邵建柱
【摘要】[目的]筛选苹果砧木耐盐变异体,并对其生理生化和分子生物学特征进行分析.[方法]用60Co-γ,对苹果砧木78-48进行辐射处理,以处理明显的叶片为外植体诱导出再生植株,以1.0%和1.2% NaCl作为选择压,对再生植株进行多代交替盐筛选,直到筛选出耐1.2% NaCl的变异体L和K,以耐盐变异体12和K2为试材,对其进行耐盐生理生化指标测定及RAPD分析.[结果]变异体不仅在生理生化指标上有明显的差异,而且在DNA水平上发生了突变.[结论]变异体L2和K2是78-48的耐盐新株系.%[ Objective] The research aimed to screen the salt- tolerant mutant of apple rootstock, and analyze their physiological- biochemistrical and molecular biological characteristics. [ Method] The original line 78-
48(CK) was irradiated by 60Co-γ, and the effect obvious leaves were chose to induce the regenerative plants, then the plants were alternating salt screened taking 1.0％ and 1.2％ NaC1 as selection press,until to screen the mutants to 1.2％ NaC1- tolerance. Finally, the physiological- biochemistrical indices of the salt- tolerant mutants, L2 and K2, were determined, and their molecular biological characteristics were studied by RAPD analysis. [ Result ] The result showed that compared with the original line, the mutants varied not only on the salt-tolerant indexes level, but also on the DNA level, which provided a strong evidence for the truth of the mutants. [ Conclusion] These mutants ( L2 and K2 ) were salt-tolerant new lines of apple rootstock.
【期刊名称】《安徽农业科学》
【年(卷),期】2011(039)017
【总页数】3页(P10227-10228,10243)
【关键词】苹果砧木;耐盐变异体;脯氨酸;质膜透性;RAPD
【作者】李振侠;徐继忠;邵建柱
【作者单位】河北农业大学园艺学院,河北,保定,071001;河北科技大学生命科学与
工程学院,河北,石家庄,050018;河北农业大学园艺学院,河北,保定,071001;河北农业大学园艺学院,河北,保定,071001
【正文语种】中文
【中图分类】S661
近年来，随着生物工程技术的发展，通过诱变来改良作物的性状已经成为育种的主要途径之一。

到目前为止，已经在多种作物上得到了抗逆性的变异体，如在结缕草、番茄、马铃薯、甘薯和苹果等作物上取得了较好的效果［1－5］。

苹果是重要的
果树树种之一，主要靠嫁接繁殖，其耐盐性主要取决于砧木。

利用组织培养与诱变技术相结合选育抗性突变体，可以提高耐盐砧木育种效率，获得优良的新种质。

RAPD标记覆盖整个基因组，是鉴别品种、品系的有力工具。

为此，笔者用
60Co-γ对苹果砧木78-48进行辐射处理，以处理明显的叶片为外植体诱导出再
生植株，以NaCl 1.0%和1.2% 作为选择压，对再生植株进行多代交替盐筛选，直到筛选出耐1.2%的变异体L和K，并对其耐盐生理生化指标进行测定及RAPD分析，以期为培育耐盐砧木奠定基础。

1 材料与方法
1.1 材料及辐射处理以苹果砧木78-48为试材。

78-48是1978年山东青岛市农业研究所以M9为亲本杂交选育的矮化砧木。

试管苗继代培养14 d后，用60Co-γ射线处理，辐射剂量率为30 R/min，总剂量为3.0 kR。

1.2 耐盐变异体筛选选取诱变效应明显的叶片接种在MS+BA
2.0 mg/L+NAA
0.1 mg/L 再生培养基中，对再生得到的植株继代培养，培养6代后，以1.0%和
1.2%NaCl为选择压对材料进行多代交替盐筛选，直到筛选出耐1.2%NaCl的耐盐变异体。

1.3 耐盐变异体生理生化分析将耐盐变异体转入不含盐的培养基上培养2代后，再转入含不同盐浓度(0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%)的 NaCl培养基上培养 10 d，测定其理化指标。

1.3.1 质膜透性和丙二醛(MDA)含量。

质膜透性采用电导法［6］测定。

将新鲜叶片和根系用无离子水冲洗3次，滤纸吸干表面浮水。

称取0.2 g样品放入50 ml 三角瓶中，加入20 ml无离子水，抽真空30 min，静置30 min，用DDS-11型电导仪测定电导度，然后沸水浴15 min，静置30 min，冷却至室温，再测定电导率。

以相对电导率表示原生质膜透性大小。

MDA含量参照张宪政的方法［7］进行测定。

1.3.2 脯氨酸含量。

采用酸性茚三酮法［8］测定。

1.3.3 耐盐变异体的RAPD分析及相关基因克隆。

20 μl RAPD反应体系包括:Tag DNA聚合酶1.25 U，dNTPs 0.20 mmol/L，引物0.25 μmol/L，Mg2+3.0 mmol/L，模板 DNA 40 ng，1 ×Buffer 2 μl，45 个 PCR 循环。

对PCR扩增中得到的特异性条带进行克隆测序分析，测序所得结果进行Blast比较。

克隆所用试剂盒由宝生物(大连)技术有限公司提供，DNA测序由宝生物(大连)技术有限公司协助完成。

2 结果与分析
2.1 不同NaCl浓度下苹果砧木耐盐变异体相对生长量的变化从表1可以看出，随着盐浓度的增加，耐盐变异体与对照的相对生长量降低，但在处理期间，耐盐变异体的相对生长量始终高于对照。

表1 不同NaCl浓度下苹果砧木耐盐变异体相对生长量的变化Table [0-9]+ Changes of relative growth of salt-tolerant mutant under different NaCl concentrations %对照(Control)2.32 1.61 0.51 0.08 0.01 0耐盐变异体(L) 2.88 2.26 1.72 0.61 0.11 0 Salt-tolerant mutant耐盐变异体(K) 2.99 2.43 2.17 0.80 0.54 0.09 Salt-tolerant mutant
2.2 不同NaCl浓度下苹果砧木耐盐变异体脯氨酸含量的变化从图1可以看出，在盐胁迫过程中，苹果砧木耐盐突变株系脯氨酸含量变化趋势相同。

随着盐浓度的增加，脯氨酸含量呈先升高后降低的趋势，并且在相同的盐浓度条件下，耐盐突变株系的脯氨酸含量显著高于对照。

耐盐突变株系K2和L2积累脯氨酸的能力最强，增幅最大。

盐处理浓度不同，脯氨酸含量最高值也不相同。

由78-48获得的株系L2在盐浓度为1.0%时脯氨酸含量最高，比对照增加235.80%，差异显著;突变株系K2在盐浓度为1.2%时脯氨酸含量最高，比对照增加157.76%，差异显著。

2.3 不同NaCl浓度下苹果砧木耐盐突变体MDA含量和质膜透性的变化从图2、3可以看出，盐胁迫下，耐盐突变株系MDA含量和细胞膜透性随着盐浓度的增加迅速上升，并且低于对照。

L2在盐浓度为1.2%时MDA含量最高，比对照降低59.25%;而K2在盐浓度为1.0%时MDA含量最高，比对照降低62.76%。

L2和K2分别在盐浓度为1.2%和1.4%时细胞膜透性最高，比对照分别降低24.54%和47.77%。

图1 不同NaCl浓度对苹果砧木耐盐突变体脯氨酸含量的影响Fig.1 Effect of different NaCl concentrations on Pro content of the apple rootstocks salt-
tolerant mutant
图2 不同NaCl浓度对苹果砧木耐盐变异体MDA含量的影响Fig.2 Effect of different NaCl concentrations on MDA content of apple rootstocks salt-tolerant mutant
图3 不同NaCl浓度对苹果砧木耐盐变异体细胞膜透性的影响Fig.3 Effect of different NaCl concentrations on cell membrane permeability of apple rootstocks salt-tolerant mutant
2.4 不同NaCl浓度下苹果砧木耐盐突变体RAPD分析及相关基因克隆分析用36
个引物对耐盐株系及其亲本进行RAPD分析，有21个引物存在多态性，占
58.33%。

其中有17个引物扩增出78-48与L2之间的多态性，占53.12%;有19
个引物扩增出78-48与K2之间的多态性，占59.37%。

78-48与其变异体L2的
相似系数为0.973，与K2的相似系数为0.940。

对得到的多态性片段进行克隆测
序分析，所得结果与NCBI进行Blast比较，结果发现，随机引物S174扩增片段
长度为589 bp，核苷酸序列与Escherichia coli K-12 MG1655有99%的同源性，氨基酸序列与环境胁迫有关的氧化还原酶、磷酯代谢蛋白等的功能相关。

S373扩增出的片断长度为1 800 bp，核苷酸序列与Malus×domestica transposon gene有99%的同源性，与Malus baccata putative TIR-NBS type R protein
4(R4)gene有92%的同源性，与Malus×domestica endo-1，4-beta-glucanase mRNA有94%的同源性，与Malus sieversii OPB18 SCAR marker sequence band的核苷酸序列有98%的同源性。

而这些基因序列与苹果属转座基因、CC-NBS-LRR抗性蛋白及1，4-β-葡聚糖酶有关。

注:M.DNA Marker DL2000;1.650 bp;2.650 bp;3.1 600 bp;4.950 bp;5.1 200 bp;6.1 500 bp。

Note:M.DNA Marker DL2000;1.650 bp;2.650 bp;3.1 600 bp;4.950 bp;5.1 200 bp;6.1 500 bp.
图5 连接产物电泳结果Fig.5 The electrophoresis results of connection products注:M.DNA Marker DL2000。

Note:M.DNA Marker DL2000.
3 结论与讨论
通过诱变来改良作物的性状已经成为育种的主要途径之一，植物诱变效应的检测，大多依照形态和生理生化性状来确定，而脯氨酸、MDA含量［9］和质膜透性可
以作为衡量植物耐盐能力高低的指标。

该试验研究表明，在盐胁迫条件下，突变体L2、K2脯氨酸含量明显高于对照，而MDA含量和质膜透性明显低于对照，说明
所筛选到的突变体耐盐能力高于对照。

但是由于植物的生理生化性状易受环境的影响，所以不易准确地鉴定诱变性状的变异。

随着分子生物学的飞速发展，从DNA 水平上检测变异的技术也越来越完善。

陈受宜等对水稻耐盐突变体、管泽强对1
个CMS水稻育性回复突变体进行了分子水平的鉴定，确定在分子水平上发生了突变［10－11］。

因此分子标记在植物的诱变研究中，一方面可以区分真假突变体，另一方面可以研究诱变剂对DNA的作用和诱变位点，以分子标记作为靶序列标记，进而对基因组的某些区域加以分析。

已有研究报道通过人工选育和诱变育种所得到的苹果［12］、小麦［13－14］和棉花［15－16］等一些作物的多种农艺性状的变异体，利用RAPD分子标记技术进行鉴定，并获得了与突变性状有关的RAPD
标记。

该研究对78-48及其耐盐突变株系进行了RAPD分析，发现了特异性带并
对其进行克隆、测序和Blast比较，发现引物S174和S373扩增的片段与已知基
因具有较高的同源性，其功能与氧化还原酶、葡聚糖酶、与甲基-半乳糖转运有关
的蛋白和抗性蛋白等有相关性，证实了所筛选到的突变体L2和K2在分子水平上
确实发生了突变，并且该突变与耐盐相关。

参考文献
［1］梁小红，韩烈保，齐春晖.结缕草耐盐变异体的筛选［J］.四川草原，
2005(8):18 －20.
［2］张建华，陈火英，庄天明.番茄耐盐体细胞变异体的离体筛选［J］.西北植物学报，2002，22(2):257 －262.
［3］杨宇，李东，张乾.60Co-γ辐射对马铃薯耐盐愈伤组织诱导的影响［J］.安徽农业科学，2010，38(12):6140 －6141.
［4］李爱贤，刘庆昌，王玉萍，等.甘薯耐旱、耐盐突变体的离体筛选［J］.农业生物技术学报，2002，10(1):15 －19.
［5］李增裕.苹果砧木耐盐变异细胞系筛选和鉴定指标的研究［D］.保定:河北农业大学，2003.
［6］西北农业大学植物生理教研室.植物生理学实验指导［M］.西安:陕西科学技术出版社，1987:1－4.
［7］张宪政.作物生理研究法［M］.北京:农业出版社，1992:207－215.
［8］张殿忠，汪沛洪，赵会贤.测定小麦叶片游离脯氨酸含量的方法［J］.植物生理学通讯，1990(4):62 －65，32.
［9］LIANG Y C，CHEN Q，LIU Q，et al.Exogenous silicon(Si)increases antioxidant enzyme activity and reduces lipid peroxidation in roots of saltstressed barley(Hordeum vulgare L.)［J］.J Plant Physiol，2003，160:1157－1164.
［10］陈受宜.水稻抗盐突变体的RFLP分析［J］.植物学报，1991，33(8):569 －573.
［11］管泽强.一个CMS水稻育性回复突变体的RAPD分析［J］.遗传学报，1997，24(6):501 －506.
［12］张今今，王跃进，李荣旗.苹果短枝型性状的RAPD研究［J］.农业生物技术学报，2000，8(3):285 －288.
［13］索广力，沈银柱，黄占景，等.小麦耐盐突变体的RAPD分析［J］.西北植
物学报，1999，19(3):376 －380.
［14］索广力，黄占景，何聪芬，等.利用RAPD-BSA技术筛选小麦耐盐突变位点的分子标记［J］.植物学报，2001，43(6):598 －602.
［15］沈法富，于元杰，尹承佾.棉花和子期化学诱变获得的早熟品系及其RAPD 分析［J］.遗传学报，1999，269(2):174 －178.
［16］陈翠霞，于元杰，王洪刚，等.棉花变异体的RAPD分析及抗盐生理研究［J］.作物学报，1999，25(5):643 －646.。