氨基酸的离子交换柱色谱分离
氨基酸分析仪原理、分类及几种氨基酸分析仪的比较-科邦实验室
氨基酸分析仪原理、分类及几种氨基酸分析仪的比较概述氨基酸分析仪是一种分析仪器，采用经典的阳离子交换色谱分离、茚三酮柱后衍生法，对蛋白质水解液及各种游离氨基酸的组分含量进行分析。
工作原理通常细分为两种系统：蛋白水解分析系统（钠盐系统）和游离氨基酸分析系统（锂盐系统），利用不同浓度和pH值的柠檬酸钠或柠檬酸锂进行梯度洗脱。
其中钠盐系统一次最多分析约25种氨基酸，速度较快，基线平直度好；锂盐系统一次最多分析约50种氨基酸，速度较慢，基线一般不如钠盐系统好。
应用全自动氨基酸分析仪主要应用:各种物质中18种氨基酸的定性定量分析。
1.饲料上的应用：质量控制：各种饲料必需氨基酸的含量和它们之间的比例必须恰当，测定原料和产品中的氨基酸含量，以达到保证质量的目的。
真伪鉴别：鱼粉氨基酸组成特点是赖氨酸、蛋氨酸含量高，氨基酸分析结果很容易就可以区别它的真伪。
2.农业、食品、饮料及玉米、大豆、小麦等农作物的氨基酸含量进行检测；对果汁、饮料进行真伪的鉴别；检验测定茶氨酸来鉴别真伪茶叶；对酱油级别的认定。
分类氨基酸分析仪按其分离和检测方法的不同可分为两大类型。
第一类是基于阳离子交换柱分离、柱后茚三酮衍生光度法测定的经典方法（IEC）。
此类方法于1972年获诺贝尔奖，是当今国际标准和国家标准以及仲裁和涉外的方法。
第二类是所有基于反相色谱分离、柱前衍生、荧光或紫外检测的高效液相法（HPLC）以及阴离子交换分离直接安培法检测的离子色谱法（IC）。
选型指南1、原理。
基于阳离子交换柱分离、柱后茚三酮衍生、光度法测定的离子交换色谱法（IEC）。
此类方法由Stein和Moore两人1958年发明，并于1972年获诺贝尔奖，是当今国际标准和国家标准以及仲裁和涉外的方法。
2、重要指标。
满足分析需要的技术指标如分离度、重复性等要求，而其中的分离度又是更为重要的指标，因为，色谱理论一般以分离度达到1.2作为两峰基本分离的判定前提，只有峰分开了，才有意义去讨论定性和定量的重复性。
柱色谱是较经典的有机物分离技术
柱色谱是较经典的有机物分离技术，原理和薄层色谱相同，但装置有所不同，主要由一个均匀玻璃柱和填充填料组成，填料是决定柱效的主要因素，填料必须满足具有不溶于所使用流动相、不使欲分离的样品破坏或分解、惰性大、可逆性强和吸附容量大。
同时，填料颗粒直径要均匀。
最常见的柱色谱是硅胶色谱、氧化铝色谱、离子交换柱色谱、聚酰胺柱色谱和凝胶柱色谱。
分配柱色谱是利用混合物中各组分在两种不相混溶的液体之间的分配系数不同，而得到分离的方法，分为正相和反相分配色谱两种类型：正相分配色谱：以水或亲水性溶剂为固定（液）相，以水不相混溶的有机溶剂作移动相的分配色谱称为正相分配色谱。
一般而言，分离水溶性或极性较大的成分，如生物碱、苷类、糖类、有机酸等化合物，常用正相分配色谱。
反相分配色谱：以亲脂性有机溶剂作固定（液）相，以水或亲水性溶剂作移动相的分配色谱称为反相分配色谱。
当分离脂溶性或极性较小的成分，如高级脂肪酸、油脂、游离甾体等物质时，常用反相分配色谱。
实践中有70%以上的分配色谱都采用反相色谱。
分配柱色谱往往适用于分离水溶性或极性较大的组分，如生物碱、苷类、糖类、有机酸、酚类及氨基酸的衍生物；对某些非极性化合物，如油脂、甾体等物质，可采用反相分配柱色谱法。
应用实例：狄戈辛（异羟基洋地黄毒苷）的分离支持剂：国产层析硅胶80 100目，加2/3量的水（以乙酸乙酯饱和），调匀，再以乙酸乙酯（水饱和）浸泡，调成稀糊状，湿法装柱，柱直径与长度比1:2 以上。
实验方法：取样品与1 2倍量硅胶磨匀，加入柱顶，用水饱和的乙酸乙酯（含0.5%甲醇）洗脱，分部收集，各流分均作纸色谱及薄层色谱检查，比移值相同的流分合并，减压蒸干，以甲醇结晶，得到洋地黄毒苷、羟基洋地黄毒苷、异羟基洋地黄毒苷三种单体。
吸附柱色谱是将待分离混合物样品均匀地加在装有吸附剂的柱子中，再加适当的溶剂（洗脱剂）冲洗，由于吸附剂对各组分吸附能力不同，各组分在柱中向下移动的速度不同，吸附力最弱的组分随溶剂首先流出，通过分段定量收集洗脱液而使各组分得到分离。
柱色谱是较经典的无机物分离技巧[新版]
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柱色谱是较经典的有机物分离技术，原理和薄层色谱相同，但装置有所不同，主要由一个均匀玻璃柱和填充填料组成，填料是决定柱效的主要因素，填料必须满足具有不溶于所使用流动相、不使欲分离的样品破坏或分解、惰性大、可逆性强和吸附容量大。
同时，填料颗粒直径要均匀。
最常见的柱色谱是硅胶色谱、氧化铝色谱、离子交换柱色谱、聚酰胺柱色谱和凝胶柱色谱。
分配柱色谱是利用混合物中各组分在两种不相混溶的液体之间的分配系数不同，而得到分离的方法，分为正相和反相分配色谱两种类型：正相分配色谱：以水或亲水性溶剂为固定（液）相，以水不相混溶的有机溶剂作移动相的分配色谱称为正相分配色谱。
一般而言，分离水溶性或极性较大的成分，如生物碱、苷类、糖类、有机酸等化合物，常用正相分配色谱。
反相分配色谱：以亲脂性有机溶剂作固定（液）相，以水或亲水性溶剂作移动相的分配色谱称为反相分配色谱。
当分离脂溶性或极性较小的成分，如高级脂肪酸、油脂、游离甾体等物质时，常用反相分配色谱。
实践中有70%以上的分配色谱都采用反相色谱。
分配柱色谱往往适用于分离水溶性或极性较大的组分，如生物碱、苷类、糖类、有机酸、酚类及氨基酸的衍生物；对某些非极性化合物，如油脂、甾体等物质，可采用反相分配柱色谱法。
应用实例：狄戈辛（异羟基洋地黄毒苷）的分离支持剂：国产层析硅胶80 100目，加2/3量的水（以乙酸乙酯饱和），调匀，再以乙酸乙酯（水饱和）浸泡，调成稀糊状，湿法装柱，柱直径与长度比1:2 以上。
实验方法：取样品与1 2倍量硅胶磨匀，加入柱顶，用水饱和的乙酸乙酯（含0.5%甲醇）洗脱，分部收集，各流分均作纸色谱及薄层色谱检查，比移值相同的流分合并，减压蒸干，以甲醇结晶，得到洋地黄毒苷、羟基洋地黄毒苷、异羟基洋地黄毒苷三种单体。
吸附柱色谱是将待分离混合物样品均匀地加在装有吸附剂的柱子中，再加适当的溶剂（洗脱剂）冲洗，由于吸附剂对各组分吸附能力不同，各组分在柱中向下移动的速度不同，吸附力最弱的组分随溶剂首先流出，通过分段定量收集洗脱液而使各组分得到分离。
离子交换柱层析法分离氨基酸
5．加样:
平衡好后，停止加入缓冲溶液，待缓冲溶 液弯月面靠近树脂顶端时，关闭下端开口。 加入0.5mL左右混合氨基酸溶液，待样品弯 月面靠近树脂顶端时，立即用少量浓度为 （0.45mol/L）的柠檬酸缓冲溶液冲洗层析 管内壁数次，再加入缓冲液约3～4厘米左 右。加样时应避免冲破树脂表面，且避免 将样品全部加在某一局限部位。
离子交换柱层析法分离氨基酸
一、实验目的和要求
1.学习采用离子交换柱层析法分离氨基酸的原 理和方法。
2.掌握离子交换柱层析法的基本操作技术， 包括树脂的装柱加样、洗脱、检查等。
二、实验原理
离子交换树脂是具有酸性或碱性的合成聚 苯乙烯-苯乙二烯不溶性高分子化合物。
各种氨基酸分子的结构不同从而导致pI点 不同。各种氨基酸在同一pH时带有不同的电 荷，与离子交换树脂的亲和力有差异，因此 可依亲和力从小到大的顺序被洗脱液洗脱下 来，达到分离的效果。
面好
5．混合氨基酸溶液：将上述天冬氨酸、赖氨酸各溶液按1:3的比例混合。 应避免用手直接接触茚三酮。
高 平 的 8 的缓冲液中，在阳离子柱中氨基酸洗出的大体顺序为酸性、中性、碱性。
5mL水合茚三酮显色剂并混匀（加显色剂规则为：前10管都加，以后每隔一管加一次，但当出现显色时，周围几管都加。
整 层 注意：设置首管为1，若有50支管，建议末管号设置为51 ， 析 各种氨基酸在同一pH时带有不同的电荷，与离子交换树脂的亲和力有差异，因此可依亲和力从小到大的顺序被洗脱液洗脱下来，达到
层析管。
水浴锅内水面刚好没过试管架中层即可。
97;Lys(赖氨酸）是碱性氨基酸，pI=9.
氨基酸分析的检测方法评述
文章编号:1004-7964(2004)03-0039-05收稿日期:2003-11-05基金项目:国家高技术研究发展计划(863计划)经费资助,课题编号:2001AA647020四川大学青年基金,课题编号:H2002[9-057]第一作者简介:戴红,女,1966年出生,副教授。
主要研究方向:分析检验。
氨基酸分析的检测方法评述戴红,张宗才,张新申(皮革化学与工程教育部重点实验室(四川大学),四川成都610065)摘 要:对氨基酸分析常用的化学方法、电化学方法、分光光度法(包括可见光分光光度法,紫外光分光光度法和荧光分光光度法)等检测方法进行综述,以期为提高氨基酸分析的灵敏度、准确性,为快速、高效的氨基酸分析方法的建立提供参考。
关键词:氨基酸;检测;分析中图分类号:Q517;Q503 文献标识码:ADetermination M ethods of Amino A cids A nalysisDA I Hong ,ZHA N G Zong 2cai ,ZHA N G Xi n 2shen (Key L aboratory of L eather Chemist ry and Engi neeri ng(S ichuan U niversity ),M i nist ry of Education ,Chengdu 610065,Chi na )Abstract :Determination methods for amino acids ,including chemistry determination ,elec 2tric 2chemistry determination ,spectrophotometer determination and conductivity detection method were reviewed for the sake of improving the analysis sensitivity and accuracy.The paper aimed at providing useful reference to building a fast and effective amino acids aualytic methods.K ey w ords :amino acid ;analysis ;determination 氨基酸是蛋白质的基本结构单位和生物代谢过程中的重要物质,氨基酸分析技术对蛋白质化学、生物化学和整个生命科学研究以及产品开发、质量控制和生产管理等具有重要意义,广泛地应用于化工、轻工、食品加工、医药卫生行业的医药、食品、保健品等的分析,并且用于皮革化学鞣革机理的研究中[1,2,3]。
实验二 氨基酸的离子交换柱色谱分离
实验二氨基酸的离子交换柱色谱分离【原理】本实验采用磺酸型阳子交换树脂（732型）分离酸性氨基酸（天冬氨酸Asp pI=2.97）和硷性氨基酸(赖氨酸Lys pI=9.74)的混合液。
在pH5.3条件下，因为低于Lys的pI值，Lys可解离成阳离子挂在树脂上；高于Asp的pI值，则Asp可解离为阴离子，不能被树脂吸附而直接流出色谱柱，在pH 12条件下，因高于Lys的pI值，Lys又解离为阴离子从树脂上被交换下来，这样通过改变洗脱液的pH值可使它们被分别洗脱而达到分离的目的。
【操作】1、树脂的处理关于市售新树脂的处理见注1，关于树脂浮洗的方法参照讲义所述，本实验采用处理好的树脂。
2、装柱：将色谱柱垂直装好，关闭柱底出口，在柱内注入约2cm高pH5.3的柠檬酸缓冲液。
将浮选后已转成钠型的树脂置于烧杯中，加进1～2倍体积的柠檬酸缓冲液，经抽气处理后，搅成悬浮状沿柱内壁细心地把柱灌满，倒时不要太快，以免产生泡沫。
待树脂在柱底部逐渐沉积2～3cm高时，用吸管吸去柱内上层所出现的清液，慢慢打开柱底出口，继续加注树脂悬液，直至柱体装到8cm高度为止。
在装柱时要避免使柱内液体流干而使装柱失败，另外树脂悬液的温度要相对恒定（特别是对于采用高温法）。
装好的柱体应该没有纹路，没有裂痕，没有气泡和柱顶表面平整而均匀，这样方可投入使用，否则要重装。
3、平衡：柱装好后接上预先调好的恒流泵，用柠檬酸缓冲液以24ml/hr的流速平衡，直到流出液的pH与洗脱液的pH相同为止（pH试纸检查），这大约需要2～3倍床体积。
4、加样与洗脱：移去柱上的液器塞，打开柱底出口，小心使柱内液体流至柱表面时即行关闭。
用加样吸管吸取0.5ml氨基酸混合样品溶液。
沿柱壁小心地加入柱中，加样时不要过快，以免冲坏树脂表面，加样后慢慢打开柱底阀，使液面再与树脂面相齐时关闭，然后再用吸管吸取适量洗脱液如此清洗柱内壁四周1～2次。
洗涤后，用缓冲液在柱内加到约2cm 高的液层，然后接上恒流泵，调流速0.5ml/分即开始洗脱。
离子交换色谱法和离子色谱法
阳离子交换树脂
RSO H
3
+
X
RSO3X
+
H
不可交换离子 可交换离子 待测离子
交换平衡常数或选择性系数
RSO X H RSO X 3 3 s m s Ks RSO3 H s X m RSO3 H s / X m K A KB / H m
强酸型阳离子交换树脂：含有磺酸基-SO3 H+的树脂
OH 2.阴离子交换树脂：在骨架上引入能电离出 的
碱性基团，如季铵基、氨基、仲胺基，叔胺基。 强碱型阴离子交换树脂：含有季铵基-N(CH3)+3 OH 的树脂。
交联度和交换容量
交联度：
表示离子交换树脂中交联剂的含量大小，即合成树脂 时二乙烯苯在原料中的重量百分含量。 强酸型--2～16%：强碱性--<10%。 交联度越高。网眼越小，选择性越高，大体积离子愈 难进入树脂基体。
影响Ks的因素
1）溶质的离子电荷数越大或水合离子半径越 小，则KS ↑。 2）交换能力强、选择性大的离子组成流动相 的洗脱力越大，则tR↓, KS↓ 3) pH降低时，弱电解质的离解被抑制（弱酸 ），tR↓, KS↓ 4）交联度↑，交换容量↑， tR ↑, KS ↑
流动相
离子交换色谱多以水溶液为流动相，因为水具有使组
分离子化的特性，也可在流动相中加入少量有机溶剂（甲
醇，四氢呋喃和乙腈）以增加某些组分的溶解度进而改变 分离选择性，这对分离可离解的有机化合物尤为有利。 以水为流动相的离子色谱中，组分的保留时间和分离 度主要通过控制流动相pH和离子强度调节。
测定氨基酸的方法以及试剂
一采用氨基酸自动分析仪测定氨基酸1.氨基酸测定原理：食物蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。
2.测定氨基酸所用仪器:真空泵;恒温干燥箱;水解管：耐压螺盖玻璃管或硬质玻璃管，体积20～30mL。
用去离子水冲洗干净并烘干;真空干燥器(温度可调节);氨基酸自动分析仪。
3.测定氨基酸所用试剂及其配制方法:3.1试剂：全部试剂除注明外均为分析纯，实验用水为去离子水。
浓盐酸(优级纯);苯酚(须重蒸馏); 混合氨基酸标准液(仪器制造公司出售)：0.00250mol/L; 不同pH值柠檬酸钠缓冲液；氢氧化锂(LiOH·H2O)；冰乙酸(优级纯)；二甲基亚砜(C2H6OS)；水合茚三酮(C9H4O3·H2O)；还原茚三酮(C18H10O6·2H2O);NaOH；高纯氮气（纯度99.99%）；冷冻剂：市售食盐与冰按1∶3混合。
3.2试剂配制方法：3.2.1. 6mol/L盐酸∶浓盐酸(3.1)与水1∶1混合而成。
3.2.2. pH2.2的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠(Na3C6H5O7·2H2O)和16.5mL浓盐酸加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至2.2。
pH3.3的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和12mL浓盐酸加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至3.3。
pH4.0的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和9mL浓盐酸加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至4.0。
pH6.4的柠檬酸钠缓冲液：称取19.6g柠檬酸钠和46.8g氯化钠(优级纯)加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至6.4。
3.2.3. 茚三酮溶液pH5.2的乙酸锂溶液：称取氢氧化锂(LiOH·H2O)168g，加入冰乙酸(优级纯)279mL，加水稀释到1000mL，用浓盐酸或50%的氢氧化钠溶液调节pH至5.2。
氨基酸组成分析
(1)茚三酮法 Spackman等人最早将茚三酮试剂运用到氨基酸组成分 析上。离子交换层析后，各种氨基酸与茚三酮反应形成紫色 化合物，最大光吸收在570nm，摩尔消光系数2X104，茚 三酮和二级胺(脯氨酸和羟脯氨酸)形成黄色产物，在 440nm检出，摩尔消光系数3X103。目前此法的灵敏度可 达100pmol，但茚三酮试剂易氧化，必须隔绝空气避光保 存，试剂本身黏性大，需要有个柱后混合器才能与氨基酸充 分反应，对仪器要求较高。
第三章
氨基酸组成分析
氨基酸是一种小分子的两性化合物，分子质量在75～ 200Da之间，其化学通式为R-CH(NH2)-COOH，在生物体 内出现的氨基酸都是L型，仅在少数微生物来源的多肽中出 现D型氨基酸。 氨基酸分析技术的发展始于1820年，由Braconnot最早 将甘氨酸从白明胶水解物中分离出来，但直到21世纪，用 化学方法或微生物方法测定氨基酸，仍是一项持续数周或数 月的繁琐的工作。 色谱技术的引入为氨基酸分析打开了一扇新的大门。 1941年，Martin等运用色层法分析氨基酸，主要采用乙酰 化氨基酸在硅胶柱上或滤纸上半定量；随后，Moore、 Stein应用离子交换柱直接分离游离的氨基酸，在1958年， Spackman、Stein、Moore制造了自动化的氨基酸分析 仪，使氨基酸定量分析进入了一个崭新的阶段，至今仍是 经典的方法。
3．碱 用氢氧化钠和氢氧化钡代替酸水解，可保护色氨酸不被破坏。 4．酶 蛋白酶水解法有时也有应用，其优点是条件温和，对天冬酰胺和谷氨 酰胺及色氨酸均无破坏作用，但酶水解法往往不完全，必须用酸水解法 校正。 5．光谱法 分光光度法和二阶微分光谱法可测定色氨酸，前者应用较早，在蛋白 质分子中，如不含半胱氨酸和其他有干扰的发色基团的氨基酸，根据其 在6mol/L盐酸胍的中性溶液中的紫外吸收，测定色氨酸和酪氨酸的含 量，此经验公式只适用于色氨酸对酪氨酸的比值为0.2～1时的情况。酪 氨酸常被用来确定蛋白质中芳香族氨基酸的含量，计算公式复杂。 Hewlett Packard公司推出的DAD检测器配合其化学工作站软件， 能较方便地在线检测并定量肽段中的色氨酸。 虽然蛋白质和多肽的氨基酸分析法对大多数氨基酸是快速、准确和灵 敏的，但在半胱氨酸定量时仍遇到很大困难，解决这个问题的途径有两 种，一种是还原烷化法，另一种是氧化法。
氨基酸分析指导原则
附件：氨基酸分析指导原则草案公示稿氨基酸分析指导原则氨基酸分析系指采用适宜的方法测定蛋白质、多肽或其他药物制剂中氨基酸组成和/或含量。
药品中氨基酸分析通常采用基于高效液相色谱法分离的衍生化法，涉及样品的水解、衍生化反应、分离检测和数据处理等操作。
本指导原则概述了药品中氨基酸分析的基本要求、蛋白质和多肽样品的水解、常用测定方法及其数据分析，为药品中氨基酸的分析提供指导。
1 基本要求1.1仪器氨基酸分析使用的仪器通常是高效液相色谱仪或氨基酸分析仪。
高效液相色谱仪适用于柱前衍生化产物的分离检测；对于柱后衍生化法，由于离子交换分离过程的复杂性和对柱后衍生化反应装置的特殊要求等，一般使用商品化的氨基酸分析仪。
1.2内标物氨基酸分析常采用内标法，内标物应是非天然存在的一级氨基酸，易于获取且价格便宜，在水解过程保持稳定，其色谱响应应与浓度成线性关系，具有独特的保留时间且与待测氨基酸能有效分离。
常用的内标物包括正亮氨酸、α-氨基丁酸、正缬氨酸、肌氨酸和硝基酪氨酸等。
内标物应在水解前或衍生化反应前添加到氨基酸混合物中，以消除由于水解、衍生化、取样、进样、溶液稳定性和色谱条件变化所导致的差异。
1. 3方法验证用于品种项下的氨基酸分析方法，包括样品水解，应参照分析方法验证指导原则（通则9101）进行方法学验证。
1.4水解管的清洗与要求为避免如手套粉末和指纹残留物等对分析结果的影响，水解管应清洗干净。
或使用一次性的水解管。
清洗方法：将水解管用1mol/L盐酸溶液中煮沸1小时，或将其浸泡在浓硝酸或浓盐酸-浓硝酸（1：1）混合液中1小时，再依次用高纯水、HPLC级甲醇冲洗，烘干并密封保存，以免再次污染。
2 蛋白质和多肽样品的水解蛋白质或多肽样品中的氨基酸是以结合形式存在，必须经过水解处理，形成游离氨基酸后才能进行氨基酸分析。
水解方法主要有酸水解，同时辅以碱水解。
酸水解中使用最广泛的是盐酸水解，所得氨基酸不消旋，但该方法引起一些氨基酸的破坏或部分破坏，如色氨酸被破坏，丝氨酸、苏氨酸和半胱氨酸被部分破坏，门冬酰胺和谷氨酰胺脱酰胺分别转化为门冬氨酸和谷氨酸。
211216232_氨基酸分析仪检出限以及分离度不确定的评定
2023年第2期品牌与标准化氨基酸分析仪是一款广泛应用于食品科学、农业环境、生物化学、医疗卫生及化工领域的分析仪器[1-2]。
氨基酸分析仪的基本原理为：试样经过前处理去蛋白之后，样液经离子交换柱层析分离，被分离出的氨基酸通过柱后衍生与茚三酮溶液反应显色，用紫外检测器检测，外标法定量[3-4]。
检出限是评价分析方法的重要指标，一般分为仪器检出限、分析方法检出限。
仪器检出限是指分析仪器能区分噪声的最低检出浓度的能力，而方法检出限不但与仪器噪声有关，还与方法全部流程的各个环节相关。
目前，研究方法检出限的较多，但较少有针对仪器检出限不确定度进行评定的方法。
为正确评估仪器检出限，本文将针对氨基酸分析仪进行仪器检出限不确定度的评定，为检出限不确定度评定提供解决方案。
分离度是氨基酸分析仪判断待测物质在色谱柱中分离情况的另一个重要指标。
氨基酸分析仪的分离度是指峰高分离度。
本文通过结合分离度和仪器检出限的不确定度分析，对氨基酸分析仪的性能水平作出准确评价。
1材料与方法1.1材料与仪器17种氨基酸混合标准溶液：浓度约为1mmol/L ，扩展不确定度为0.02~0.04mmol/L （k =2），中国计量科学研究院生产；电子天平：Ⅰ级，感量为0.1mg ，METTLER TOLEDO 公司；L-8900型氨基酸分析仪：日立公司；游标卡尺：测量范围为0~150mm ，最小分度0.02mm ，检定的不确定度为0.04mm ，k =2，桂林广陆数字测控股份有限公司；容量瓶：100mL/250mL/1000mL ，A 级。
Evaluation of Uncertainty ofDetection Lmit and Resolution of Amino Acid AnalyzerTONG Junting（Liaoning Institute of Measurement ，Shenyang 110004，China ）Abstract ：In this paper ，the mixed standard substance of amino acid is used to evaluate the uncertainty of detection limit and resolution of amino acid analyzer.The results show that the expanded relative uncertainty of the detection limit is 9.6%.Through uncertainty analysis ，the fluctuation of baseline noise has the greatest impact on the detection limit of the instrument.Reducing baseline noise can effectively improve the detection limit of the instrument.The expanded relative uncertainty of degree of separation is 6.1%.Through uncertainty analysis ，the uncertainty of reference materials and concentration of the analytes has the greatest impact on the degree of separation.Appropriately increasing the concentration of the analytes within the linear range of the instrument can effectively improve the degree of separation of the instrument.Key words ：amino acid analyzer ；evaluation of uncertainty ；detection limit ；degree of separation氨基酸分析仪检出限以及分离度不确定的评定佟俊婷（辽宁省计量科学研究院，辽宁沈阳110004）【摘要】本文使用氨基酸混合标准物质，对氨基酸分析仪检出限以及分离度进行不确定度评定。
氨 基 酸 自 动 分 析 仪 简 介
氨基酸自动分析仪氨基酸是蛋白质的组成成分，是蛋白质化学研究的主要内容之一。
蛋白质是一切生命物质的基础，因此，探讨和揭示生命现象的发生、生长、新陈代谢、遗传变异过程，都与氨基酸的研究有关。
随着近代物理学、化学和电子学的飞速发展，氨基酸的分析技术亦在不断更新。
氨基酸分析仪是本世纪50年代研制的，仅40多年，已发展到现在的进样、分离、检测和数据处理全部自动化的程度。
检出量由微克分子到毫微克分子，分析时间由原来的24小时到现在的半个小时，分析技术的提高促进了其他科学领域的发展。
一、氨基酸自动分析仪的进展用于氨基酸分析的方法很多，有纸色谱法、柱色谱法、薄层色谱法、电泳法及气相色谱法等。
一般认为离子交换柱色谱法是较为精确的检测方法，氨基酸分析仪就是在此基础上研制成功的。
1951年Moor和Stein采用离子交换树脂色谱，用茚三酮试剂显色和分光光度计检测而设计，后来在Spaekman的协助下，使分析操作自动化。
迄今氨基酸分析仪的条件和自动程度有了很大的改观，其特点主要表现以下几个方面。
⒈树脂粒径减小近年来制成的小颗粒球状树脂，使氨基酸分析仪得到很大改进。
由于树脂粒径减小就对应地增加等量树脂的总面积，使现在少量树脂达到过去大量树脂的分离效果，从而减小了树脂柱的内径和体积，节省了试剂用量，缩短了分析时间。
树脂的粒径从200→20→10→5µm。
⒉色谱柱内径缩小树脂粒径减小使填充树脂床的色谱柱内径减小，由过去的粗长柱变为微柱。
色谱柱内径的变化为18→6→2.8→1.75mm。
⒊输压泵压力增高一般氨基酸分析仪采用低压泵，其施加于输液的压力只有几9.80665×104Pa，以后增加至几十9.80665×104Pa，现在发展到2068×104Pa。
⒋分析时间缩短由于树脂粒径的改善，色谱柱内径缩小和泵压增高，使分析时间大大缩短。
蛋白质水解液的分析时间从过去的24小时缩短到现在的半个小时左右。
氨基酸分析方法
HPLC: Auto-Tag/OPA ❀ 开发出第一个完整的用在HPLC上的氨基
酸分析试剂包
✎ Waters Pico-Tag方法(1984)
❀ 目前性能最好的氨基酸分析方法
✎ Waters AccQ-Tag方法(1993)
N
O
衍生后的氨基酸
+
HO
O
N
O
N-羟基琥珀酰亚胺
AccQ·Tag氨基酸分析
❀简便的样品衍生程序
✎过滤1.0 ml 水解液 ✎取10 微升放入6x50mm 衍生管中(干燥) ✎加入 AccQ-Tag 缓冲液,涡旋混和并加入AQC衍生剂 ✎于 55 ℃烘箱中加热10 分钟. (tyrosine) ✎即可进样
AccQ-Tag)
柱后衍生方法的特点
❀ 优点
✎ 样品制备的工作量较少 ✎ 离子交换分离对本底的耐受性最好 ✎ 丰富的文献背景
❀ 缺点
✎ 硬件配置复杂，用途专一，灵活性差 ✎ 购买及维护成本高 ✎ 一般来说，分析时间很长 ✎ 破坏氨基酸的固有结构
柱后衍生技术的比较
技术
检测
检测限 （典型）
反应条件
限制
柱前衍生技术的比较
技术 检测模式 典型检测限 反应条件
限制
Dansyl Chloride
PTH NBD Chloride
OPA
UV 254 荧光 UV 269 荧光
荧光
FMOC
荧光
PITC
UV 254
AQC
UV 248 荧光
OPA/FMOC 荧光
低至中 pmole 困难
分离衍生困难
柱色谱分离的原理
柱色谱分离的原理
柱色谱分离的原理是基于样品在固定相（填充在柱子中的吸附剂）和流动相（通过柱子的移动相）之间的差异分离。
在柱色谱中，固定相通常是极细的颗粒或涂层，可以吸附或排斥不同成分，而流动相则是溶剂或气体。
样品在流动相中被输送到柱子的顶部，然后经过固定相与流动相的相互作用分离，并最终从柱子底部收集。
柱色谱分离的原理可以通过以下几种方式实现：
1. 吸附色谱：基于样品成分在固定相上的吸附度不同而进行分离。
样品中的成分在固定相上有不同的吸附力，因此会以不同速度通过柱子。
2. 分配色谱：基于样品成分在流动相和固定相之间的分配度不同而进行分离。
样品中的成分会在固定相和流动相之间进行分配，因此会分别停留在柱子上或被推进柱子中。
3. 离子交换色谱：基于样品中离子成分在固定相的交换位点上的亲和力不同而进行分离。
柱子上的固定相通常具有带电基团，能与样品中的离子成分进行交换，从而实现分离。
4. 凝胶过滤色谱：基于样品成分在凝胶孔隙中的渗透性不同而进行分离。
较大的样品成分会较难渗透到凝胶孔隙中，因此会以较慢的速度通过柱子，而较小的样品成分则会较快通过。
通过选择合适的固定相和流动相，调整流动相的流速和组成，
以及优化样品的注入方式和分离条件，可以实现对复杂混合物的有效分离和纯化。
柱色谱广泛应用于化学、生物、制药等领域，以提供纯净和纯化的化合物。
氨基酸检测方法
氨基酸
阳离子交换柱
柱温箱
反应器加热器
130 ℃
UV/VIS 检测器
POWER038.PPT
茚三酮试剂
.
OPA 方 法
( 邻 苯 二 甲 醛)
伯氨基酸 检 测：荧光检测器 (Ex=350nm, Em=460nm) 反应温度： 室 温 反应速度： 快 速 试剂稳定性 : 较 差 衍生化产物稳定性： 较 差
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DANS-Cl 方法
(1-dimethylaminonaphthalene-5-sufonyl chloride)
与伯氨基酸和仲氨 基酸反应效率低
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PITC PTC
POWER038.PPT
PITC 方法
(phenylisothiocyanate)
柱前衍生
衍生化后的氨基酸 色谱柱
检测器
色 谱 柱 : 反相柱 (ODS) 试 剂 : OPA ( 荧光检测)
FMOC (荧光检测) 荧 光 胺(荧光检测) DANS-Cl (荧光检测) PITC (UV)
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柱前衍生分离柱
反相色谱柱 (ODS)
使用反相柱，色谱峰分离良好。
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蛋白质水解 (2)
碱水解方法
❖ 4N NaOH 110C (N2 氛围) 16 - 24 hours
这一方法用于色氨酸
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蛋白质水解 (3)
过甲酸氧化方法
❖ A/B=5/95 110C (N2 氛围) A:30% 过氧化氢 B:90% 甲酸
22 - 72 h
汉密尔顿 季铵盐阴离子交换色谱柱
汉密尔顿季铵盐阴离子交换色谱柱1. 概述汉密尔顿季铵盐阴离子交换色谱柱是一种用于分离带有阴离子功能团的化合物的色谱柱。
它采用了季铵盐作为固定相，用于与分子中的阴离子交换，从而实现化合物的分离。
该色谱柱具有高效、快速、准确的特点，广泛应用于化学、生物、医药等领域。
2. 技术优势汉密尔顿季铵盐阴离子交换色谱柱具有以下几项技术优势：- 高效分离：色谱柱具有优异的分离效果，能够分离出不同阴离子功能团的化合物。
- 宽泛适用性：适用于多种化合物的分离，包括但不限于有机酸、无机阴离子、生物分子等。
- 良好的稳定性：色谱柱具有稳定的性能，能够长时间保持分离效果和分辨率。
- 高灵敏度：能够对微量样品进行分离，具有高灵敏度和准确性。
3. 应用领域汉密尔顿季铵盐阴离子交换色谱柱在多个领域得到了广泛的应用：- 生物医药领域：用于分离和分析生物样品中的阴离子化合物，如有机酸、氨基酸、糖类等，对于药物分析、生物标志物的研究具有重要意义。
- 环境监测领域：可用于水质、土壤等环境样品中有机阴离子的分析和监测，有助于环境保护和资源管理。
- 食品安全领域：可用于分析食品中的阴离子残留物，保障食品安全。
4. 使用注意事项在使用汉密尔顿季铵盐阴离子交换色谱柱时，需注意以下几点：- 样品制备：样品制备需要仔细、准确，避免混杂物对分离效果的干扰。
- 流动相选择：选择合适的流动相，通常采用含有盐类的缓冲溶液，以促进阴离子的交换。
- 柱温控制：控制色谱柱的温度，通常在室温下进行分离，可提高分离效率。
- 梯度洗脱：根据样品的特性和目标化合物的极性选择合适的梯度洗脱方法，以实现更好的分离效果。
5. 结语汉密尔顿季铵盐阴离子交换色谱柱作为一种高效、灵敏的色谱分离工具，在化学、生物、医药等领域具有重要的应用价值。
通过合理选择使用条件和良好的样品制备，能够进一步提高色谱分离的效果，为相关研究和应用提供有力支持。
汉密尔顿季铵盐阴离子交换色谱柱是色谱分析领域中一项重要的技术手段，其在分离化合物、分析样品中阴离子成分等方面有着广泛的应用。
离子交换柱色谱法原理
离子交换柱色谱法原理
离子交换柱色谱法是一种常见的高效液相色谱法，广泛用于离子化合物的分离和定量分析。
离子交换柱色谱法原理主要有以下几点：
1. 离子交换
样品溶液通过固定在柱子内部的离子交换树脂床层时，离子交换柱中的离子交换树脂会与样品中的离子发生相互作用，如Na+和Cl-。
这种离子交换的能力由树脂的化学性质决定，如树脂中存在的阳离子或阴离子。
2. 离子洗脱
交换树脂中的样品离子会一定程度上吸附在固定相上，洗脱液的选择和浓度可以影响离子的保留时间和分离度。
通常使用富含离子的缓冲溶液进行洗脱，以减缓离子与离子交换树脂之间的相互作用，使离子充分地与树脂分离开来。
3. 色谱分离
样品中的离子会按照它们在离子交换树脂上吸附的程度，以及使用的洗脱液类型和浓度的差异，而呈现出不同时间的洗脱峰。
每个洗脱峰表示一个具体的化学物质或离子，可以通过检测峰的高度或面积来确定含量或浓度。
离子交换柱色谱法的优点包括能够高效地分离亚稳态和同分异构体，操作方便，对溶剂要求低；而缺点是在样品中存在大量杂质时，需要
使用更高效的萃取、预处理或清洁方法。
总的来说，离子交换柱色谱法主要是通过固定相与移动相之间的离子交换的方式去分离化合物，从而达到测定的目的。
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氨基酸的离子交换柱色谱分离
【原理】
本实验采用磺酸型阳子交换树脂（732型）分离酸性氨基酸（天冬氨酸Asp pI=2.97）和硷性氨基酸(赖氨酸Lys pI=9.74)的混合液。
在pH5.3条件下，因为低于Lys的pI值，Lys可解离成阳离子挂在树脂上；高于Asp的pI值，则Asp可解离为阴离子，不能被树脂吸附而直接流出色谱柱，在pH 12条件下，因高于Lys的pI值，Lys又解离为阴离子从树脂上被交换下来，这样通过改变洗脱液的pH值可使它们被分别洗脱而达到分离的目的。
【操作】
1、树脂的处理
关于市售新树脂的处理见注1，关于树脂浮洗的方法参照讲义所述，本实验采用处理好的树脂。
2、装柱：将色谱柱垂直装好，关闭柱底出口，在柱内注入约2cm高pH5.3的柠檬酸缓冲液。
将浮选后已转成钠型的树脂置于烧杯中，加进1～2倍体积的柠檬酸缓冲液，经抽气处理后，搅成悬浮状沿柱内壁细心地把柱灌满，倒时不要太快，以免产生泡沫。
待树脂在柱底部逐渐沉积2～3cm高时，用吸管吸去柱内上层所出现的清液，慢慢打开柱底出口，继续加注树脂悬液，直至柱体装到8cm高度为止。
在装柱时要避免使柱内液体流干而使装柱失败，另外树脂悬液的温度要相对恒定（特别是对于采用高温法）。
装好的柱体应该没有纹路，没有裂痕，没有气泡和柱顶表面平整而均匀，这样方可投入使用，否则要重装。
3、平衡：柱装好后接上预先调好的恒流泵，用柠檬酸缓冲液以24ml/hr的流速平衡，直到流出液的pH与洗脱液的pH相同为止（pH试纸检查），这大约需要2～3倍床体积。
4、加样与洗脱：移去柱上的液器塞，打开柱底出口，小心使柱内液体流至柱表面时即行关闭。
用加样吸管吸取0.5ml氨基酸混合样品溶液。
沿柱壁小心地加入柱中，加样时不要过快，以免冲坏树脂表面，加样后慢慢打开柱底阀，使液面再与树脂面相齐时关闭，然后再用吸管吸取适量洗脱液如此清洗柱内壁四周1～2次。
洗涤后，用缓冲液在柱内加到约2cm高的液层，然后接上恒流泵，调流速0.5ml/分即开始洗脱。
注意在调节流速时要排除流泵与柱之间连接管内的所有气泡，并且在调节时不要过猛，以免影响色谱行为。
5、收集：柱流出液可用自动分离收集器或以刻度试管人工收集按每管3ml先收集4管。
6、改换高pH洗脱收集：关闭恒流泵及柱底阀，将恒流泵管内的柠檬洗脱液更换成pH12 NaOH洗脱液，然后按上面同样方法继续收集到第5管到10管。
7、测定：（注2）将收集的各管编号后，分别取0.5ml收集液于一洁净的干试管中，加入1ml pH5.3柠檬酸洗脱缓冲液，0.5ml茚三酮试剂，混合后在100℃水浴上加热25分钟。
然后水冷却5～10分钟，加3m160％乙醇衡稀释，摇匀后用721型分光光度计在570nm处比色。
测定后，以光密度为纵坐标，收集的管数或毫升数为横坐标绘制洗脱曲线。
8、再生，对于装好的柱使用几次后需要0.2mol/L NaOH溶液洗脱，再用蒸馏水洗至中性后重复使用。
注：1、对于市售的干树脂其处理方法为：先经水充分溶胀后，倾去上面的泥状细粒，反复洗几次直到水澄清为止，然后经浮选得到颗粒大小合适的树脂，浮选后用4倍量的2mol/LHCl和2mol/L NaOH依次浸洗，每次半小时，换酸或碱时用水先将树脂洗至中性，最后树脂应处理至溶液无黄色。
这时再用1mol/L NaOH使树脂转成钠型（对于其它的转型要视实验和树脂的情况而定），在蒸馏水洗至中性备用。
2、氨基酸的测定一般要求在pH5左右，这样在本实验中，改变pH后和洗脱液就不能直接进行测定。
所以在第7步测定时要加入1ml pH5.3的柠檬酸缓冲液。
【器材】
①玻璃色谱柱：长19cm，内径1.2cm，3＃砂芯。
②恒流泵（微量输液器）。
③Bs-160型部分收集器或以收度试管手工操作。
④721型分光光度计。
⑤刻度吸管、试管。
⑥水浴锅。
【试剂】
①树脂：磺酸型阳离子交换树脂（732型）
②洗脱液：0.45mol/L、pH5.3柠檬酸缓冲液，取285克柠檬酸（C6O7H8·H2O）；186克97％NaOH；105ml 浓盐酸溶于水稀释至10升。
0.01mol/L pH12NaOH缓冲液，取4克NaOH溶于10升蒸馏水。
③样品液：0.005mol/L Asp和Lys的0.02mol/L HCl混合溶液。
④显色剂
三氯化钛——茚三酮溶液：
醋酸缓冲液：水150ml，无水醋酸钠82克，无水醋酸25ml，加水定容250ml pH5.5。
乙二醇甲醚750ml，加入茚三酮20克，三氯化钛（TiCl315%）1.7ml，用醋酸缓冲液定容到1升。