离子交换色谱
离子交换色谱
离子交换色谱一、实验原理：离子交换层析 (Ion Exchange Chromatography 简称为 IEC) 是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。
离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。
带有正电荷的称之阴离子交换树脂 ; 而带有负电荷的称之阳离子树脂。
离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。
由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。
阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。
结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。
反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。
离子交换层析是用离子交换剂作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的层析方法。
即溶液中的离子同离子交换剂上功能基团交换反应的过程。
带电荷量少，亲和力小的先被洗脱下来，带电荷量多，亲和力大的后被洗脱下来。
二、实验设计离子交换剂；缓冲液；洗脱剂具体操作：1、离子交换介质的选择：考虑目的分子的大小，目的分子会影响其接近介质上的带电功能集团；功能集团的强弱，目的分子稳定，选择强交换介质。
对于大多数纯化步骤来说，建议开始的时候使用强离子交换柱，可在摸索方法的过程中有一个宽的pH范围。
对于一个已知等电点的蛋白质，可根据其等电点来选择。
如果选用阴离子交换剂，使用缓冲液的pH值应高于该蛋白质等电点，因为此时蛋白质在该缓冲液中携带净负电荷，可与阴离子交换剂结合。
如果选用阳离子交换剂，缓冲液的pH值应低于该蛋白质的等电点，因为此时蛋白质在该缓冲液中携带净正电荷，可与阳离子交换剂结合。
对于一个未知等电点的蛋白质，可以先选择一个阴离子交换剂，再选择一个中性的pH缓冲液，将蛋白质样品透析至pH7.0，然后过阳离子交换柱，根据过柱后的结果确定下一个使用的缓冲液的pHo 如果目的蛋白再穿过液中，说明目的蛋白在此 pH条件下带正电荷，可将缓冲液升高一个pH,将蛋白质样品透析纸8.0，然后再过阴离子交换柱，根据过柱后的结果确定下一个使用的缓冲液的 pH。
离子色谱简介
离子色谱简介离子色谱简介一、概述离子色谱（Ion Chromatography，简称IC）是一种基于离子交换原理的分离技术，其主要应用于分离，鉴别和定量离子样品中的主要组分和微量成分。
二、原理离子色谱是利用离子交换色谱柱、离子色谱系统和检测器联用的方法。
色谱柱通常由高度交联的阳离子交换树脂和阴离子交换树脂组成。
样品通过色谱柱时，被分离成不同的离子，其分离形式有树脂洗脱法和满载洗脱法等。
最终，通过检测器检测到分离的离子，并定量分析测定目标离子的含量。
三、应用领域离子色谱在环境、农业、食品、制药、生物医学、化工等领域的分析应用非常广泛。
例如，在环境领域，离子色谱可用于污水中阴离子的测定；在食品领域，可用于食品添加剂和污染物的检测。
在制药领域，离子色谱可用于药物成分的鉴定等。
四、设备构成离子色谱由注射器、色谱柱、检测器和计算机等部分构成。
其中色谱柱是整个离子色谱系统的核心部分，不同的离子需要使用不同的柱剂和不同的色谱柱进行分离。
检测器通常使用电导率检测器或荧光检测器。
五、优点和局限性离子色谱具有分离速度快、分离效率高、检测灵敏度高等优点。
但离子色谱在分离无机离子的情况下，对有机物的排除效果较差，同时离子色谱法在分离分子量大于500的有机物质分离效果也较差，局限性比较明显。
六、发展趋势在仪器设备技术不断更新改进的情况下，离子色谱仪器在后期的发展趋势会越发智能化、高速化、更加简单方便等方面取得更多的进步。
同时，总体而言，离子色谱仪器的应用领域还有很大的扩展空间，可以更广泛的应用于冶金、石油、化学工业中，有着极大的前景。
第二章 离子交换色谱
分离柱长度
分离柱的长度影响理论塔板数（即柱效）。若两支 分离柱串联，得到分离效率的增加将导致相似保留特 性的离子之间较好的分离，同时保留时间也增加。
分离柱的长度也影响柱子的交换容量。当样品中被 测离子的浓度远小于其他离子的浓度时，推荐用长分 离柱以增加柱容量。
（2）固定相
固定相—分离的核心
• • • • 不同分离模式所采用的固定相不同； 最常用固定相是离子交换剂（树酯）； 载体（基质）与功能基团； 固定离子与可交换离子。
固定相组成
阴离子交换剂类型
强碱型：季胺基（-N+(CH3)3OH-）
弱碱型：伯、仲、叔胺基
（3）淋洗液
抑制型电导检测阴离子交换色谱常用淋洗液
淋洗剂 Na2B4O7 NaOH 抑制产物 H3BO3 H2O 淋洗强度 很弱 弱
NaHCO3
NaHCO3 + Na2CO3 H2NCH(R)COOH + NaOH
Column: Eluent: Eluent Source: Temperature: Flow Rate: Inj. Volume: Detection: IonPac CG16, CS16 (5 mm) 26 mM Methanesulfonic acid EG40 30 °C 1.5 mL/min 10 µL Suppressed Conductivity CSRS®-ULTRA AutoSuppression® recycle mode 1. 2. 3. 4. 5. 6. Lithium <0.2 mg/L (ppm) Sodium 200 Ammonium 0.03 Potassium 0.5 Magnesium 8.0 Calcium 20
第二章 离子交换色谱
离子交换色谱（ion
离⼦交换⾊谱（ion exchange chromatography）2、离⼦交换⾊谱（ion exchange chromatography）蛋⽩质、多肽均属于两性电解质，在缓冲液pH⼩于其等电点时，带净正电荷，⽽在缓冲液pH⼤于其等电点时，带净负电荷。
阴离⼦交换凝胶本⾝带有正电荷基团，阳离⼦交换凝胶本⾝带负电荷基团。
由于静电相互作⽤⽽使样品结合到凝胶上，再采⽤盐浓度梯度或者更换缓冲液的pH值进⾏洗脱对于等电点⼩于5.0的酸性蛋⽩质，推荐使⽤阴离⼦交换，对于等电点⼤于7.0的碱性蛋⽩质，推荐使⽤阳离⼦交换。
两种模式：⼀种使⽬的蛋⽩结合凝胶，通过梯度洗脱；⼀种使⽬的蛋⽩不结合凝胶，⽽⼤部分杂质结合凝胶，则穿过液中含有⽬的蛋⽩。
column chromatography（柱⾊谱）batch chromatography（批⾊谱）c、疏⽔作⽤⾊谱利⽤蛋⽩质、多肽在⾼盐存在下，可以结合疏⽔凝胶，⽽在盐浓度降低时⼜可以解脱的原理实现分离。
d、亲和⾊谱利⽤蛋⽩质、多肽与某些配基的特异性相互作⽤⽽进⾏分离。
例如：酶-底物，酶-抑制剂，糖蛋⽩-凝集素，抗原-抗体等。
近来发展了⾦属螯合亲和⾊谱，⽤于纯化表⾯含⾊氨酸、酪氨酸、组氨酸等的蛋⽩质以及(His)6-tagged重组蛋⽩。
亲和⾊谱分为特异性亲和⾊谱和组别亲和⾊谱两类。
肝素、凝集素、染料、⾦属螯合亲和⾊谱均为组别亲和⾊谱（同⼀配基可以结合许多种蛋⽩质）。
e、反相⾊谱常⽤于蛋⽩质、多肽的HPLC分析，以及多肽的精细制备分离，分辨率极⾼，可以分离两种仅相差⼀个氨基酸的多肽。
如⾎管紧张素（angiotensin）的⼏个亚型通过反相⾊谱可以很好地分离。
同⼀个样品在同⼀Source 30 RPC柱上进⾏分离，由于⾊谱条件进⾏了改变，⾊谱图截然不同，说明反相⾊谱具有⾼度的选择性。
四、应⽤举例例⼀、⼀种抗HIV gp120单克隆抗体的Fab⽚断（E.coli中表达）分⼦量：50 kD等电点：11表达定位：周质（periplasmic）纯化策略：渗透压休克提取周质，阳离⼦交换去除⼤部分杂质，疏⽔作⽤⾊谱进⼀步去除杂质，最后⽤凝胶过滤分离。
离子交换色谱
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（2）在离子交换剂的交换容量固定的情况下，起始缓 冲液的浓度应尽可能的低 （3）缓冲液离子不影响被分离蛋白或干扰其活性，同 时不应影响目标蛋白的溶解度。
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四、离子交换色谱的基本操作
图3 IEC装置示意图
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（一）交换剂的预处理、再生 （1）用水浸透使干树脂吸水溶胀，再用酸、碱 处理除去水中的不溶性杂质。 （2）再生是指将用过的离子交换剂恢复原状的 处理过程。
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2、平衡常数
离子交换反应和其他化学反应一样，完全服从质量作用定律，且 离子交换剂与溶液中的离子或离子化合物所进行的离子交换反应 是可逆的。 阳离子交换剂RA，在溶液中解离出阳离子A+与溶液中的阳离子B+ 发生可逆交换反应：RA+B+ ⇋RB+A+
离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力，离子交换剂的 选择性可用平衡常数K表示：
（二）交换剂装柱 （1）离子交换色谱柱的选用 （2）装柱
垂直装柱，严防气泡和断层。
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当所用的交换剂与待分离物质各组分之间亲和力差 不多而需要交换剂体积较大时，以增加柱长为宜， 使待分离组分被洗脱后再结合于交换剂上的概率增 加。柱的直径与高度比以1:20左右为宜。
如采用离子强度较大的洗脱液梯度洗脱时，以选用 粗而短的柱子为宜，因为当柱上洗脱液的离子强度 高到足以完全取代被吸附离子时，这些被置换的离 子则以同洗脱液等速率向下移动，如果柱细长，就 增加了脱附离子扩散的机会。
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2、缓冲液的选择
（1）对于两性蛋白质 来说，缓冲液的pH决定 蛋白质在该缓冲体系下 所带的电荷， 以一个pI为5的蛋白为 例：
+
等电点
蛋
白
吸附阴离子交换剂
5 离子交换色谱法
三、提高离子交换分离效果的途径
1）树脂的选择与填充技术 参照文献方法，结合被分离对象（阴离子？阳离子？）选择合适类型
交联度为8%的强酸性聚苯乙烯型树脂，约50um， 柱温50℃。
以150×0.9cm的交换柱，0.2M柠檬酸钠，pH 3.244.25为淋洗剂可以先分离出酸性氨基酸如谷氨酸，后分离 出中性氨基酸，如苯丙氨酸
以15 ×0.9cm的短交换柱，0.4M 0.2M柠檬酸钠， pH5.26为淋洗剂可以分离出碱性氨基酸，如精氨酸等。
带”——即色谱 Chromatography
该方法现在仍然广泛使用，如有机合成中的“过柱子”。常见的 是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。又称为柱层析/柱色谱，或经 典液相色谱法（相对于HPLC）。
一、离子交换色谱法的分类
1）淋洗色谱：通常先将少量样品通过交换柱，达到吸附 平衡，然后用亲和力比组分A、B、C都弱的离子作淋洗剂， 得到相互分离开的淋洗曲线。主要用于分析分离。
后进行测定。
置换色谱：
锂和钠的硫酸盐混合溶液通过一根氢型DOWE×50，300目树脂的交 换柱，用1.0mol/L(NH4)2SO4淋洗得到的淋洗曲线。
有时，在淋洗液中加入一定的络合剂，降低金属离子与树脂的亲和力， 从而使得NH4 +, Na+能对二、三价的金属离子起到置换作用。 Li+＜H+＜Na+＜NH4+＜K+＜Rb+＜Cs+＜Ag+＜Tl+
在用溶剂平衡时，先使材料沉淀， 用倾泻法除去悬浮的细颗粒，否则由 于细颗粒的堵塞，溶剂的流速将显著 降低。
离子交换色谱法和离子色谱法
阳离子交换树脂
RSO H
3
+
X
RSO3X
+
H
不可交换离子 可交换离子 待测离子
交换平衡常数或选择性系数
RSO X H RSO X 3 3 s m s Ks RSO3 H s X m RSO3 H s / X m K A KB / H m
强酸型阳离子交换树脂：含有磺酸基-SO3 H+的树脂
OH 2.阴离子交换树脂：在骨架上引入能电离出 的
碱性基团，如季铵基、氨基、仲胺基，叔胺基。 强碱型阴离子交换树脂：含有季铵基-N(CH3)+3 OH 的树脂。
交联度和交换容量
交联度：
表示离子交换树脂中交联剂的含量大小，即合成树脂 时二乙烯苯在原料中的重量百分含量。 强酸型--2～16%：强碱性--<10%。 交联度越高。网眼越小，选择性越高，大体积离子愈 难进入树脂基体。
影响Ks的因素
1）溶质的离子电荷数越大或水合离子半径越 小，则KS ↑。 2）交换能力强、选择性大的离子组成流动相 的洗脱力越大，则tR↓, KS↓ 3) pH降低时，弱电解质的离解被抑制（弱酸 ），tR↓, KS↓ 4）交联度↑，交换容量↑， tR ↑, KS ↑
流动相
离子交换色谱多以水溶液为流动相，因为水具有使组
分离子化的特性，也可在流动相中加入少量有机溶剂（甲
醇，四氢呋喃和乙腈）以增加某些组分的溶解度进而改变 分离选择性，这对分离可离解的有机化合物尤为有利。 以水为流动相的离子色谱中，组分的保留时间和分离 度主要通过控制流动相pH和离子强度调节。
离子交换色谱ppt课件
垂直装柱，严防气泡和断层。
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当所用的交换剂与待分离物质各组分之间亲和力差 不多而需要交换剂体积较大时，以增加柱长为宜， 使待分离组分被洗脱后再结合于交换剂上的概率增 加。柱的直径与高度比以1:20左右为宜。
如采用离子强度较大的洗脱液梯度洗脱时，以选用 粗而短的柱子为宜，因为当柱上洗脱液的离子强度 高到足以完全取代被吸附离子时，这些被置换的离 子则以同洗脱液等速率向下移动，如果柱细长，就 增加了脱附离子扩散的机会。
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2、平衡常数
离子交换反应和其他化学反应一样，完全服从质量作用定律，且 离子交换剂与溶液中的离子或离子化合物所进行的离子交换反应 是可逆的。 阳离子交换剂RA，在溶液中解离出阳离子A+与溶液中的阳离子B+ 发生可逆交换反应：RA+B+ ⇋RB+A+
离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力，离子交换剂的 选择性可用平衡常数K表示：
1、离子交换剂应具备高度的不溶性，保证在各种溶剂 中不会发生溶解； 2、具备稳定的理化性质，不能因物理化学变化而发生 分解； 3、具有较大的表面积或疏松的孔状结构，确保交换离 子自由地发生扩散和交换。
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离子交换剂
1、疏水性离子交换剂
与水亲和力较小的人工合成树脂 （1）阳离子交换剂 阳离子交换树脂具有酸性基团，电荷基团带负电，反离子带正电， 可与溶液中的阳离子或带正电荷的化合物进行交换反应。 （2）阴离子交换剂 阴离子交换树脂是在基质骨架上引入伯胺[-NH2]、仲胺[-NHCH3]、 叔胺[-N(CH3)2]和季胺[-N+(CH3)3]基团后构成的。
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（三）样品上柱、洗脱和收集 （1）上柱 （2）洗脱 IEC中的洗脱是至关重要的一步，从交换剂上把被吸附 的物质洗脱下来，有两种方法：一种是增加离子强度， 置换出被吸附的离子；另一种是改变pH，使被吸附的 离子解离度降低，减弱其对交换剂的亲和力而被脱附。 （3）收集 用部分收集器分部收集，收集体积一般为柱体积的 1%~2%。
离子交换色谱法分析化学
离子交换色谱法分析化学离子交换色谱法是一种常用的分离和分析方法，广泛应用于化学、生物、环境等领域。
该方法基于离子交换剂与样品中离子之间的相互作用，实现对目标化合物的分离和分析。
本文将介绍离子交换色谱法的基本原理、实验操作步骤以及在化学分析中的应用。
一、离子交换色谱法的基本原理离子交换色谱法利用离子交换剂作为固定相，通过与样品中离子之间的相互作用，实现分离目标化合物。
离子交换剂是一种具有交换基团的功能性材料，通过基团与样品中离子进行交换，从而实现对目标化合物的分离。
根据不同的交换基团和固定相材料，离子交换色谱法可应用于不同类型化合物的分离和分析。
二、实验操作步骤1、准备实验仪器和试剂，包括色谱柱、流动相、样品溶液等。
2、将离子交换剂填充至色谱柱中，制成固定相。
3、将样品溶液注入进样器中。
4、开启泵，使流动相通过色谱柱，将样品中的离子与固定相中的交换基团进行交换。
5、通过检测器对分离后的离子进行分析和检测。
6、根据峰高、峰面积等参数计算目标化合物的含量。
三、离子交换色谱法在化学分析中的应用1、有机酸和碱的分离和分析：离子交换色谱法可用于分离和测定有机酸和碱的含量，如乳酸、柠檬酸、苯胺等。
通过选择合适的离子交换剂和流动相，可实现高分辨率分离和准确测定。
2、金属离子的分离和分析：离子交换色谱法可用于分离和测定金属离子，如钠、钾、钙、镁等。
通过选择含有适当功能基团的固定相，可实现对不同金属离子的分离和分析。
3、环境样品的分离和分析：离子交换色谱法可用于分离和测定环境样品中的阴、阳离子，如水样、土壤样品的分离和分析。
通过优化实验条件，可实现高分辨率分离和准确测定。
4、生物样品的分离和分析：离子交换色谱法可用于分离和测定生物样品中的离子，如氨基酸、多肽等。
通过选择合适的固定相和流动相，可实现高分辨率分离和准确测定。
5、其他领域的应用：离子交换色谱法还可应用于化学合成、药物分析、食品分析等领域。
通过选择合适的固定相和流动相，可实现对不同类型化合物的分离和分析。
离子交换色谱
离子交换色谱一、实验原理：离子交换层析Ion Exchange Chromatography简称为IEC是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法;离子交换层析中,基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成;带有正电荷的称之阴离子交换树脂;而带有负电荷的称之阳离子树脂;离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化;由于蛋白质也有等电点,当蛋白质处于不同的pH条件下,其带电状况也不同;阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质,所以这类蛋白质被留在柱子上,然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施,将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来;结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来;反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质,结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来;离子交换层析是用离子交换剂作固定相,利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的层析方法;即溶液中的离子同离子交换剂上功能基团交换反应的过程;带电荷量少,亲和力小的先被洗脱下来,带电荷量多,亲和力大的后被洗脱下来;二、实验设计离子交换剂；缓冲液；洗脱剂具体操作：1、离子交换介质的选择：考虑目的分子的大小,目的分子会影响其接近介质上的带电功能集团；功能集团的强弱,目的分子稳定,选择强交换介质;对于大多数纯化步骤来说,建议开始的时候使用强离子交换柱,可在摸索方法的过程中有一个宽的pH范围;对于一个已知等电点的蛋白质,可根据其等电点来选择;如果选用阴离子交换剂,使用缓冲液的pH值应高于该蛋白质等电点,因为此时蛋白质在该缓冲液中携带净负电荷,可与阴离子交换剂结合;如果选用阳离子交换剂,缓冲液的pH值应低于该蛋白质的等电点,因为此时蛋白质在该缓冲液中携带净正电荷,可与阳离子交换剂结合;对于一个未知等电点的蛋白质,可以先选择一个阴离子交换剂,再选择一个中性的pH缓冲液,将蛋白质样品透析至,然后过阳离子交换柱,根据过柱后的结果确定下一个使用的缓冲液的pH;如果目的蛋白再穿过液中,说明目的蛋白在此pH条件下带正电荷,可将缓冲液升高一个pH,将蛋白质样品透析纸,然后再过阴离子交换柱,根据过柱后的结果确定下一个使用的缓冲液的pH;以此类推,直至目的蛋白能够结合在阴离子交换柱上为止,也可用阳离子交换剂作类似的选择,不过要注意,pH的改变应向减小的方向进行;功能集团的强弱一般情况下,在分离等电点pH为6-9的目的分子,尤其是当目的分子不稳定时,需要较温和的色谱条件才会选用弱交换介质;流动相缓冲液的选择：离子交换色谱的流动相必须是有一定离子强度的并且对pH有一定缓冲作用的溶液；阳离子交换剂应选择阴离子缓冲液,可用柠檬酸盐、醋酸盐、磷酸盐等；阴离子交换剂应选用阳离子缓冲液,可用乙二胺、Tris等；起始缓冲液浓度应尽可能低,这样可使色谱柱上吸附更多的分离物质;2、色谱柱的选择通常选择粗短柱,即高径比小的色谱柱;离子交换分离蛋白质是依靠吸附强弱不同,发生吸附时蛋白质会优先结合在色谱柱的上部,如果柱子过长,增加了从吸附位置到收集位置的流程距离,容易增加样品扩散,导致峰值增加3、折叠预处理和装柱对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒,以保证有较好的均匀度,对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤;溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理,使之成为带H+或OH-的交换剂型;阴离子交换剂常用"碱-酸-碱"处理,使最终转为-OH-型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用"酸-碱-酸"处理,使最终转为-H-型交换剂;洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的pH和离子强度;已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡;为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层,要适当加压装柱,同时使柱床压紧,减少死体积,有利于分辨率的提高;柱子装好后再用起始缓冲液淋洗,直至达到充分平衡方可使用;5、折叠加样与洗脱及洗脱组分的收集和分析加样：层析所用的样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度,所选定的pH值应落在交换剂与被结合物有相反电荷的范围,同时要注意离子强度应低,可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的;样品中的不溶物应在透析后或凝胶过滤前,以离心法除去;为了达到满意的分离效果,上样量要适当,不要超过柱的负荷能力;柱的负荷能力可用交换容量来推算,通常上样量为交换剂交换总量的1%-5%;折叠洗脱：已结合样品的离子交换前,可通过改变溶液的pH或改变离子强度的方法将结合物洗脱,也可同时改变pH与离子强度;为了使复杂的组份分离完全,往往需要逐步改变pH或离子强度,其中最简单的方法是阶段洗脱法,即分次将不同pH与离子强度的溶液加入,使不同成分逐步洗脱;由于这种洗脱pH与离子强度的变化大,使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱,纯度较差,不适宜精细的分离;最好的洗脱方法是连续梯度洗脱,两个容器放于同一水平上,第一个容器盛有一定pH的缓冲液,第二个容器含有高盐浓度或不同pH的缓冲液,两容器连通,第一个容器与柱相连,当溶液由第一容器流入柱时,第二容器中的溶液就会自动来补充,经搅拌与第一容器的溶液相混合,这样流入柱中的缓冲液的洗脱能力即成梯度变化;第一容器中任何时间的浓度都可用下式进行计算:C=C2-C2-C11-VA2/A1式中A1、A2分别代表两容器的截面积:C1、C2分别表示容器中溶液的浓度;V为流出体积对总体积之比;当A1=A2时为线性梯度,当A1>A2时为凹形梯度,A1>A2时为凸形梯度;洗脱时应满足以下要求:①洗脱液体积应足够大,一般要几十倍于床体积,从而使分离的各峰不至于太拥挤;②梯度的上限要足够高,使紧密吸附的物质能被洗脱下来;③梯度不要上升太快,要恰好使移动的区带在快到柱末端时达到解吸状态;目的物的过早解吸,会引起区带扩散;而目的物的过晚解吸会使峰形过宽;洗脱馏份的分析按一定体积5-10ml/管收集的洗脱液可逐管进行测定,得到层析图谱;依实验目的的不同,可采用适宜的检测方法生物活性测定、免疫学测定等确定图谱中目的物的位置,并回收目的物;洗脱组分的收集和分析：通常色谱柱下端连接一个紫外检测器,用于检测蛋白质组分的洗脱过程,而后又连接着部分收集器,用于收集洗脱液;6、离子交换剂的再生与保存离子交换剂可在柱上再生;如离子交换纤维素可用2mol/:NaCl淋洗柱,若有强吸附物则可用LNaOH洗柱；若有脂溶性物质则可用非离子型去污剂洗柱后再生,也可用乙醇洗涤,其顺序为：LNaOH-水-乙醇-水-20%NaOH-水;保存离子交换剂时要加防腐剂;对阴离子交换剂宜用%氯已定洗必泰,阳离子交换剂可用乙基硫柳汞%;有些产品建议用%叠氮钠;三、举例：离子交换层析法分离氨基酸原理：所用样品为天冬氨酸和组氨酸的混合液,分别属酸性氨基酸、碱性氨基酸,用强酸型阳离子交换树脂Dowex50,在一定洗脱条件下洗脱,将它们分离;组氨酸pH>10,天冬氨酸.器材：层析柱,沸水浴等试剂：Dowex50；LNaOH；柠檬酸缓冲液；氨基酸混合液；茚三酮混合液目数：离子交换树脂的颗粒直径大小Dowex50为20-50目Dowex20 840µmDowex50 297µmDowex100 149µm代表二乙烯苯的百分含量操作：1、层析：将Dowex50装柱后,用LNaOH清洗树脂5分钟,再用柠檬酸缓冲液平衡10分钟;方法同凝胶层析法加样5-6滴;当样品进入树脂后,加入柠檬酸缓冲液洗脱加样后立即收集,每管收集3ml控制流速15滴/分钟;当第一峰一出现,换用LNaOH作洗脱液,直至第二峰收集完毕;用柠檬酸缓冲液再平衡10分钟,再生;2、检测：从第二管起每收集管中加入茚三酮显色液,充分混合,沸水浴15分钟,自来水冷却,观察氨基酸与茚三酮的显色反应,若生成紫色混合物,则说明收集到氨基酸;四、离子交换色谱的优缺点：优点：1、具有开放性支持骨架,大分子可以自由进入和迅速扩散,故吸附容量大；2、有亲水性,对大分子的吸附不太牢固,用温和条件即可洗脱,不致引起蛋白质变性和酶的失活；3、多孔性、表面积大、交换容量大、回收率高,可用于分离和制备;缺点：由交换层析介质决定,不同蛋白质相互分离效果也不确定,这种分离也易造成各蛋白峰的重叠,造成分离纯度的下降;四、离子交换色谱的优缺点：优点：1、具有开放性支持骨架,大分子可以自由进入和迅速扩散,故吸附容量大；2、有亲水性,对大分子的吸附不太牢固,用温和条件即可洗脱,不致引起蛋白质变性和酶的失活；3、多孔性、表面积大、交换容量大、回收率高,可用于分离和制备;缺点：由交换层析介质决定,不同蛋白质相互分离效果也不确定,这种分离也易造成各蛋白峰的重叠,造成分离纯度的下降;。
离子交换柱色谱
（二）装柱 · 加水搅拌——沉降——去微粒——反复操作至上层液透明 · 柱底放1-2cm玻璃丝——倒入上述树脂——盖一层玻璃丝 （三）洗脱 · 大多数在水溶液中进行 · 可加入少量有机溶剂，如甲醇、乙醇、乙腈等 · 可用弱酸弱碱缓冲溶液
四、特点及应用 · 特点：设备简单，操作方便，树脂可再生 · 应用：除去干扰离子、测定盐类含量、微量元素的富集、 有机物或生化溶液脱盐、药物生产、抗生素及中草药提取 和水的纯化
二、影响选择系数的因素及分离方式 库仑力 （一）主观因素 电荷、离子裸半径
离子水合程度 · Ks与电荷成正比，与水合离子半径成反比，与离子裸半径成 正比
· 主、客观因素及规律：书P260 ①常温、稀溶液：阳离子电荷越高，亲和力越大（优先考虑电 荷） ②常温、稀溶液：等价阳离子半径越大，亲和力越大 ③阴离子亲和力顺序 · 强碱性：柠檬酸根>硫酸根>硝酸根 · 弱碱性：OH⁻最大 ④常温、浓溶液：交换亲和力差异变小或顺序颠倒
离子交换柱色谱法
离子交换柱色谱法
一、分配原理
离子交换剂对各组分亲和力不同——选择系数不同——分离
（一）选择系数：KS=[R⁻X⁺]/[X⁺]
离子交换平衡：
R⁻A⁺+B⁺⇌+R⁻B⁺+A⁺ KA/B =[R⁻B⁺][A⁺]/[R⁻A⁺][B⁺]
KA/B >1：亲和力：B>A KA/B <1：亲和力：B<A
⑤高温、非水溶液：同价离子对树脂亲和力相似 ⑥H⁺对弱酸性树脂、OH⁻对弱碱性树脂具有最大亲和力
⑦高分子量的有机离子和金属配离子对树脂有较大亲和力
⑧能与树脂的交换基团生成配合物或难溶化合物的离子都对 树脂有较大亲和力 （二）分离方式 1、利用样品组分选择性系数不同来分离 2、利用各组分离解度的差别来分离 3、形成配离子后进行离子交换分离
色谱分离技术—离子交换色谱分离技术
离子交换剂
离子交换树脂的性能评价——滴定曲线 滴定曲线也是检验和测定离子交换剂性能的重要数据，如下图是几种离子交
换剂的滴定曲线。
几种典型离子交换剂的滴定曲线
n为单位质量离子交换剂所加入的NaOH或HCl的毫摩尔数 1,2,3,4分别为强酸型、弱酸型、强碱型、弱碱型离子交换剂滴定曲线
影响离子交换的因素
温度的影响 温度的改变对稀溶液的离子交换性能影响不大，但在0.1mol/L以上浓度时，
温度升高对水合倾向大的离子容易交换吸附。同时离子的活性系数增大，对弱 酸、弱碱交换剂来说其交换率有较大的影响。一般温度增高，离子交换速度加 快，在洗脱时亦可提高洗脱能力。但对不耐热的交换剂应注意提高温度的条件， 避免引起交换剂的破坏。
离子交换树脂的命名 离子交换树脂的型号由三位阿拉伯数字组成：第一位数
字代表产品的分类；第二位数字代表骨架；第三位数字为顺 序号，用以区别基团。
离子交换色谱分离技术
离子交换剂
离子交换树脂的性能评价——交换容量
不同的树脂其交换能力大小不同，表征树脂交换能力大 小的主要参数是交换容量，即指每克干燥离子交换树脂或每 毫升完全溶胀的离子交换树脂所能吸收的一价离子的毫摩尔 数。交换容量的大小，取决于网状结构中活性基团的数目， 含有活性基团越多，交换容量也越大。但交换容量太大，活 性基团太多，树脂不稳定。
影响离子交换的因素
溶剂的影响 通常在水中进行交换，亦可采用含水溶剂，但在极性小的溶剂中难以进行
或不进行交换，同时还导致离子交换的选择性的降低或消失。
离子交换色谱分离技术的应用
可溶性的有机或无机离子化合物均可进行离子交换色谱操作。 化合价越高，被结合的生物物质越强，相同化合价和条件下，结合的亲和力
离子交换色谱
离子交换色谱
离子交换色谱（Ion exchange chromatography，简称IEX）是一种在离子交换树脂上进行的分离技术。
该技术基于样品中离子与固相固定离子之间的相互作用，实现样品中化合物的分离和纯化。
离子交换色谱的原理是利用带电的离子交换树脂作为固定相，当样品溶液经过固定相时，离子交换树脂上的固定离子会与样品中的带电离子发生相互作用。
在交换树脂上，样品中的带电离子可以与固定离子发生相互作用，形成离子交换。
通过调节溶液的离子强度或改变pH值，可以控制离子交换的强弱，从而实现对样品中的离子的分离。
离子交换色谱技术广泛应用于生物化学、生命科学、制药和环境科学等领域，常用于分离和纯化蛋白质、多肽、核酸、多糖等生物分子。
同时，离子交换色谱也可以用于分析和测定样品中特定离子的浓度。
离子交换色谱可以分为阳离子交换色谱（Cation Exchange Chromatography，简称CEX）和阴离子交换色谱（Anion Exchange Chromatography，简称AEX）
两种类型。
阳离子交换色谱适用于带正电荷的物质的分离，而阴离子交换色谱则适用于带负电荷的物质的分离。
第5章离子交换与色谱
第二节 色谱分离原理与设备
色谱技术是利用混合物中各种组分的物理化学性 质（分子的形状和大小、分子的极性、吸附力、 分子亲和力、分配系数等）不同，使各组分以不 同程度分布在两相（流动相、固定相）中，当流 动相流过固定相时，各组分以不同的速度移动， 而达到分离的目的。
色谱分离也称为层析分离或色层。
(一) 基本原理
凝胶过滤层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直 径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种物质可以完全或者部 分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而不能排阻某些小 分子化合物，但可让其在筛孔中自由地扩散、渗透。
图10-31 凝胶过滤层析原理示意图
多孔介质颗粒;
大小不同的分子;
液流
凝胶色谱原理
色谱（层析）分离分类
按流动相的状态不同可分: 液相色谱（liquid chromatography）； 气相色谱（gas chromatography）；
固定相的使用形式不同可分：
柱层析； 纸层析； 薄层层析；
按分离机制不同可分为：
离子交换色谱； 吸附色谱； 分配色谱； 疏水作用色谱； 凝胶层析（色谱）； 亲和层析（色谱）等。
色谱分离设备的组成
组成： 输液泵、进样器
（阀）、色谱柱、 检测器、收集器等 组成。
色谱设备的组成
各部件主要作用
泵：推动溶液，它是层析系统的心脏。 阀系统：控制溶液的流向，提供自动控制层析过程的可能 性。 层析柱：填装不同的层析介质，使混合物在通过它时，因 不同蛋白分子与层析介质作用强度不同，因而迁移速度不 同，从而分开混合物。 检测器：确定混合物中各物质的位置和浓度，以及缓冲液 的各种参数。 收集器：用来收集样品。
封头的圆筒形设备，树脂层高度约占
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Ion exchange chromatography,IEC
2018/6/8
内
容
一、离子交换色谱的基本原理
二、离子交换剂的基本性质
三、离子交换介质的选择原则
四、离子交换色谱的基本操作
一、基本原理
1、基本原理
以离子交换树脂等作为固定相，树脂上具有固定离子基 团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生成的 离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基 团进行可逆变换。根据组分离子对树脂亲合力不同而得 到分离。
（2）阴离子交换剂
阴离子交换树脂是在基质骨架上引入伯胺[-NH2]、仲胺[-NHCH3]、 叔胺[-N(CH3)2]和季胺[-N+(CH3)3]基团后构成的。
2、亲水性离子交换剂
基质为与水亲和力较大的天然或人工的化合物
（1）纤维素离子交换剂
以微晶纤维素为基质，再引入电荷基团构成，最为广泛使用的是 二乙氨基乙基（DEAE-）纤维素和羧甲基（CM-）纤维素。
（2）交联葡聚糖离子交换剂
以交联葡聚糖G-25和G-50为基质，通过化学方法引入电荷而制成 的。
（3）琼脂糖离子交换剂
以交联琼脂糖CL-6B为基质，引入电荷基团而构成。
三、离子交换剂的选择原则
1、离子交换剂的选择
（1）如果被分离物质带正电荷，则选用阳离子交换剂；如果带负
电荷，应选用阴离子交换剂。 （2）强型离子交换剂适用的pH范围很广，用来分离一些在极端pH
2、缓冲液的选择
（1）对于两性蛋白质
+
等电点 蛋 白 质 净 电 荷 吸附阴离子交换剂 pH
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
来说，缓冲液的pH决定
蛋白质在该缓冲体系下 所带的电荷， 以一个pI为5的蛋白为 例：
吸附阳离子交换剂
-
图2 蛋白质静电荷与pH的关系
pH < pI（+） pH = pI（0） pH > pI（-）
2、平衡常数
离子交换反应和其他化学反应一样，完全服从质量作用定律，且 离子交换剂与溶液中的离子或离子化合物所进行的离子交换反应 是可逆的。 阳离子交换剂RA，在溶液中解离出阳离子A+与溶液中的阳离子B+ 发生可逆交换反应：RA+B+ ⇋RB+A+
离子交换剂对溶液中不同离子具有不同的结合力，离子交换剂的 选择性可用平衡常数K表示：
（三）样品上柱、洗脱和收集
（1）上柱
（2）洗脱
IEC中的洗脱是至关重要的一步，从交换剂上把被吸附 的物质洗脱下来，有两种方法：一种是增加离子强度， 置换出被吸附的离子；另一种是改变pH，使被吸附的 离子解离度降低，减弱其对交换剂的亲和力而被脱附。
（3）收集
用部分收集器分部收集，收集体积一般为柱体积的 1%~2%。
处理过程。
（二）交换剂装柱
（1）离子交换色谱柱的选用
（2）装柱 垂直装柱，严防气泡和断层。
当所用的交换剂与待分离物质各组分之间亲和力差 不多而需要交换剂体积较大时，以增加柱长为宜，
使待分离组分被洗脱后再结合于交换剂上的概率增
加。柱的直径与高度比以1:20左右为宜。 如采用离子强度较大的洗脱液梯度洗脱时，以选用 粗而短的柱子为宜，因为当柱上洗脱液的离子强度 高到足以完全取代被吸附离子时，这些被置换的离 子则以同洗脱液等速率向下移动，如果柱细长，就 增加了脱附离子扩散的机会。
Thank you ！
（2）在离子交换剂的交换容量固定的情况下，起始缓 冲液的浓度应尽可能的低
（3）缓冲液离子不影响被分离蛋白或干扰其活性，同 时不应影响目标蛋白的溶解度。
四、离子交换色谱的基本操作
图3 IEC装置示意图
（一）交换剂的预处理、再生 （1）用水浸透使干树脂吸水溶胀，再用酸、碱 处理除去水中的不溶性杂质。 （2）再生是指将用过的离子交换剂恢复原状的
[ RB][ A] K [ RA][B ]
1
2
3
4
5
反离子
样品溶液 图1 IEC原理示意图
梯度溶液
1-平衡阶段：离子交换剂与反离子结合 2-吸附阶段：样品与反离子进行交换
3,4-梯度缓冲液洗脱，先洗下弱吸附物质，再洗下强吸附物质
5-再生阶段：原始平衡缓冲液进行充分洗脱，即可重复使用
二、离子交换剂的基本性质
中解离且较稳定的物质；弱型则适宜用来分离生物大分子，活性不
易丧失。 （3）在分离生物大分子物质时，由于亲水性基质对被分离物质的
吸附和洗脱都比较温和，生物活性ห้องสมุดไป่ตู้易破坏而常被选用。
（4）交换容量：通常选用离子交换剂与溶液中离子或离子化合物 进行交换能力较大的介质。
（5）交换速度：一般选用交换速度快的介质。
1、离子交换剂应具备高度的不溶性，保证在各种溶剂
中不会发生溶解；
2、具备稳定的理化性质，不能因物理化学变化而发生 分解； 3、具有较大的表面积或疏松的孔状结构，确保交换离 子自由地发生扩散和交换。
离子交换剂
1、疏水性离子交换剂
与水亲和力较小的人工合成树脂 （1）阳离子交换剂 阳离子交换树脂具有酸性基团，电荷基团带负电，反离子带正电， 可与溶液中的阳离子或带正电荷的化合物进行交换反应。