离子交换色谱
离子交换色谱
Ion exchange chromatography,IEC
2018/6/8
内
容
一、离子交换色谱的基本原理
二、离子交换剂的基本性质
三、离子交换介质的选择原则
四、离子交换色谱的基本操作
一、基本原理
1、基本原理
以离子交换树脂等作为固定相，树脂上具有固定离子基 团及可交换的离子基团。当流动相带着组分电离生成的 离子通过固定相时，组分离子与树脂上可交换的离子基 团进行可逆变换。根据组分离子对树脂亲合力不同而得 到分离。
（2）阴离子交换剂
阴离子交换树脂是在基质骨架上引入伯胺[-NH2]、仲胺[-NHCH3]、 叔胺[-N(CH3)2]和季胺[-N+(CH3)3]基团后构成的。
2、亲水性离子交换剂
基质为与水亲和力较大的天然或人工的化合物
（1）纤维素离子交换剂
以微晶纤维素为基质，再引入电荷基团构成，最为广泛使用的是 二乙氨基乙基（DEAE-）纤维素和羧甲基（CM-）纤维素。
（2）交联葡聚糖离子交换剂
以交联葡聚糖G-25和G-50为基质，通过化学方法引入电荷而制成 的。
（3）琼脂糖离子交换剂
以交联琼脂糖CL-6B为基质，引入电荷基团而构成。
三、离子交换剂的选择原则
1、离子交换剂的选择
（1）如果被分离物质带正电荷，则选用阳离子交换剂；如果带负
电荷，应选用阴离子交换剂。 （2）强型离子交换剂适用的pH范围很广，用来分离一些在极端pH
2、缓冲液的选择
（1）对于两性蛋白质
+
等电点 蛋 白 质 净 电 荷 吸附阴离子交换剂 pH
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
来说，缓冲液的pH决定
第二章 离子交换色谱
分离柱长度
分离柱的长度影响理论塔板数（即柱效）。若两支 分离柱串联，得到分离效率的增加将导致相似保留特 性的离子之间较好的分离，同时保留时间也增加。
分离柱的长度也影响柱子的交换容量。当样品中被 测离子的浓度远小于其他离子的浓度时，推荐用长分 离柱以增加柱容量。
（2）固定相
固定相—分离的核心
• • • • 不同分离模式所采用的固定相不同； 最常用固定相是离子交换剂（树酯）； 载体（基质）与功能基团； 固定离子与可交换离子。
固定相组成
阴离子交换剂类型
强碱型：季胺基（-N+(CH3)3OH-）
弱碱型：伯、仲、叔胺基
（3）淋洗液
抑制型电导检测阴离子交换色谱常用淋洗液
淋洗剂 Na2B4O7 NaOH 抑制产物 H3BO3 H2O 淋洗强度 很弱 弱
NaHCO3
NaHCO3 + Na2CO3 H2NCH(R)COOH + NaOH
Column: Eluent: Eluent Source: Temperature: Flow Rate: Inj. Volume: Detection: IonPac CG16, CS16 (5 mm) 26 mM Methanesulfonic acid EG40 30 °C 1.5 mL/min 10 µL Suppressed Conductivity CSRS®-ULTRA AutoSuppression® recycle mode 1. 2. 3. 4. 5. 6. Lithium <0.2 mg/L (ppm) Sodium 200 Ammonium 0.03 Potassium 0.5 Magnesium 8.0 Calcium 20
第二章 离子交换色谱
离子交换色谱（ion
离⼦交换⾊谱（ion exchange chromatography）2、离⼦交换⾊谱（ion exchange chromatography）蛋⽩质、多肽均属于两性电解质，在缓冲液pH⼩于其等电点时，带净正电荷，⽽在缓冲液pH⼤于其等电点时，带净负电荷。
阴离⼦交换凝胶本⾝带有正电荷基团，阳离⼦交换凝胶本⾝带负电荷基团。
由于静电相互作⽤⽽使样品结合到凝胶上，再采⽤盐浓度梯度或者更换缓冲液的pH值进⾏洗脱对于等电点⼩于5.0的酸性蛋⽩质，推荐使⽤阴离⼦交换，对于等电点⼤于7.0的碱性蛋⽩质，推荐使⽤阳离⼦交换。
两种模式：⼀种使⽬的蛋⽩结合凝胶，通过梯度洗脱；⼀种使⽬的蛋⽩不结合凝胶，⽽⼤部分杂质结合凝胶，则穿过液中含有⽬的蛋⽩。
column chromatography（柱⾊谱）batch chromatography（批⾊谱）c、疏⽔作⽤⾊谱利⽤蛋⽩质、多肽在⾼盐存在下，可以结合疏⽔凝胶，⽽在盐浓度降低时⼜可以解脱的原理实现分离。
d、亲和⾊谱利⽤蛋⽩质、多肽与某些配基的特异性相互作⽤⽽进⾏分离。
例如：酶-底物，酶-抑制剂，糖蛋⽩-凝集素，抗原-抗体等。
近来发展了⾦属螯合亲和⾊谱，⽤于纯化表⾯含⾊氨酸、酪氨酸、组氨酸等的蛋⽩质以及(His)6-tagged重组蛋⽩。
亲和⾊谱分为特异性亲和⾊谱和组别亲和⾊谱两类。
肝素、凝集素、染料、⾦属螯合亲和⾊谱均为组别亲和⾊谱（同⼀配基可以结合许多种蛋⽩质）。
e、反相⾊谱常⽤于蛋⽩质、多肽的HPLC分析，以及多肽的精细制备分离，分辨率极⾼，可以分离两种仅相差⼀个氨基酸的多肽。
如⾎管紧张素（angiotensin）的⼏个亚型通过反相⾊谱可以很好地分离。
同⼀个样品在同⼀Source 30 RPC柱上进⾏分离，由于⾊谱条件进⾏了改变，⾊谱图截然不同，说明反相⾊谱具有⾼度的选择性。
四、应⽤举例例⼀、⼀种抗HIV gp120单克隆抗体的Fab⽚断（E.coli中表达）分⼦量：50 kD等电点：11表达定位：周质（periplasmic）纯化策略：渗透压休克提取周质，阳离⼦交换去除⼤部分杂质，疏⽔作⽤⾊谱进⼀步去除杂质，最后⽤凝胶过滤分离。
化学分离技术中的离子交换色谱
化学分离技术中的离子交换色谱离子交换色谱是一种常用的化学分离技术，广泛应用于生化、药物、食品、环境等领域。
在化学实验室和工业生产中，离子交换色谱是一个必不可少的工具。
离子交换色谱的原理是利用离子交换树脂与样品中离子的相互作用，将不同离子分离开来。
离子交换树脂是一种高分子材料，具有很强的离子交换能力，可以选择性地吸附或释放离子。
当样品溶液通过离子交换柱时，离子与离子交换树脂表面上的离子发生竞争作用，最终被吸附在离子交换树脂上，从而实现分离。
离子交换色谱可以分为阳离子交换色谱和阴离子交换色谱两种类型。
在阳离子交换色谱中，树脂上的功能基团带有阴离子，可以选择性地吸附阳离子；在阴离子交换色谱中，树脂上的功能基团带有阳离子，可以选择性地吸附阴离子。
离子交换色谱在化学分离中的应用非常广泛。
例如，在食品分析中，离子交换色谱可以用于检测大豆制品中的异黄酮；在生化分析中，离子交换色谱可以用于检测DNA和蛋白质；在药物制剂中，离子交换色谱可以用于纯化生物碱和抗生素。
离子交换色谱不仅可以用于分离和检测化学物质，还可以用于污水处理和工业废弃物处理。
例如，农业废水中的氨氮可以通过阴离子交换色谱沉淀出来，从而减少对环境的污染。
然而，离子交换色谱在使用时也存在一些问题。
首先，离子交换树脂会受到样品中其他成分的影响而失活，从而影响分离的效果。
其次，离子交换色谱在使用过程中需要经常更换离子交换柱，增加使用成本。
此外，离子交换色谱需要进行缓冲液的调配和pH值的控制，操作较为繁琐。
总之，离子交换色谱是一种非常有用的化学分离技术，具有广泛的应用前景。
虽然存在一些问题，但随着科技的发展和技术的改进，离子交换色谱将会被更广泛地应用于各个领域，为化学分离技术做出更大的贡献。
离子色谱的分离方式
离子色谱的分离方式根据三种不同分离机理，离子色谱可分为高效离子交换色谱（简称HPIC），离子排斥色谱（简称HPIEC）和离子对色谱（简称MPIC）。
用于三种分离方式的柱填料的树脂骨架基本上都是苯乙烯- 二乙烯基苯的共聚物，但树脂的离子交换容量各不相同。
HPIC用低容量的离子交换树脂（0.01 - 0.50mmol/g），"?(@)用高容量的树脂（3-5mmol/g），MPLC用不含离子交换基团的多孔树脂。
三种分离方式各基于不同分离机理。
HPLC的分离机理主要是离子交换，HPLEC主要为离子排斥，而MPLC则主要基于吸附和离子对的形成。
1. 离子交换色谱（HPIC）方法基于流动相和连接到固定相上的离子交换基团之间发生的离子交换过程。
对高极化度的离子，分离机理中还包括非离子的吸附过程。
离子交换色谱主要用于有机和无机阴离子和阳离子的分离。
离子交换功能基为季铵基的树脂用作阴离子分离，为磺酸基和羧酸基的树脂用作阳离子分离。
2. 离子排斥色谱（HPIEC）离子排斥色谱的分离机理包括Donnan排斥，空间排阻和吸附过程。
固定相主要是高容量的总体磺化的聚苯乙烯. 二乙烯基苯阳离子交换树脂。
离子排斥色谱主要用于有机酸、无机弱酸和醇类的分离。
HPIEC的一个特别的优点是可用于弱的无机酸和有机酸与在高的酸性介质中完全离解的强酸的分离。
强酸不被保留，在死体积被洗脱。
3. 离子对色谱（MPIC）离子对色谱的主要分离机理是吸附，其固定相主要是弱极性和高表面积的中性多孔聚苯乙烯二乙烯基苯树脂和弱极性的辛烷或十八烷基键合的硅胶两类。
分离的选择性主要由流动相决定。
有机改进剂和离子对试剂的选择取决于待测离子的性质。
离子对色谱主要用于表面活性的阴离子和阳离子以及金属络合物的分离。
4. 其他分离方法除上述三种主要的分离方式之外，反相液相色谱（RPLC）用于极性和离子型化合物的分离也越来越普遍。
例如以离子抑制方式在化学键合的十八烷基固定相上分离长链脂肪酸；以磷酸缓冲溶液作淋洗液，在化学键合的氨丙基固定相（aminopropyl）上分离食品样品中NO3-和Br-。
离子交换色谱法应用场景总结
离子交换色谱法应用场景总结离子交换色谱法（Ion Exchange Chromatography，简称IEC）是一种常用的分离和纯化技术，基于材料表面带电的固体不溶物（固体阴离子交换剂或固体阳离子交换剂）与溶液中的离子之间的相互作用。
该技术广泛应用于以下领域：1. 生物制药离子交换色谱法在生物制药领域中经常被用于分离和纯化蛋白质。
通常情况下，离子交换色谱法可用于去除蛋白质溶液中的杂质，如小分子化合物、DNA和残留的细胞培养物等。
同时，也可以利用不同的离子交换剂筛选目标蛋白质的不同理化性质，如等电点和结构，从而实现蛋白质的纯化和分离。
2. 生化分析离子交换色谱法被广泛应用于生化分析领域，特别是在药物、食品和环境样品的分析中。
IEC 可以用于测定一种物质中特定离子的含量，如食品中的钠、钙、镁和钾等。
此外，离子交换色谱法还可用于检测有机酸、氨基酸、酚类化合物、硝酸盐和氯离子等。
3. 环境分析离子交换色谱法在环境分析中发挥着重要作用。
例如，该技术可用于环境水样的离子分析，如河流、湖泊和地下水中的阳离子（如铵离子、钠离子）、阴离子（如硝酸盐、氯离子）和微量金属离子（如镉、铅、汞等）分析。
此外，离子交换色谱法还可以用于监测大气颗粒物中的无机离子组成，如硫酸盐、硝酸盐和铵盐等。
4. 食品安全离子交换色谱法被广泛应用于食品安全领域，特别是对食品中残留农药、重金属和禁用添加剂等的分析。
例如，该技术可用于检测果蔬中的农药残留物，如有机磷和氨基甲酸酯等。
此外，离子交换色谱法还可以用于检测食品样品中的重金属离子，如铅、汞和镉等。
通过离子交换色谱法，可以快速、准确地对食品样品进行分析，保障食品安全。
5. 药物分析离子交换色谱法在药物分析中具有重要应用。
该技术常用于测定药物中的阴离子和阳离子，如药物中的无机阴离子（如卤化物和硫氰酸盐）以及有机阴离子（如氯化苯乙酸和苯乙酸）、有机阳离子（如三氯乙胺和苄马先明）等。
离子交换色谱法的高选择性和灵敏性使其成为药物分析的常用技术之一。
5 离子交换色谱法
三、提高离子交换分离效果的途径
1）树脂的选择与填充技术 参照文献方法，结合被分离对象（阴离子？阳离子？）选择合适类型
交联度为8%的强酸性聚苯乙烯型树脂，约50um， 柱温50℃。
以150×0.9cm的交换柱，0.2M柠檬酸钠，pH 3.244.25为淋洗剂可以先分离出酸性氨基酸如谷氨酸，后分离 出中性氨基酸，如苯丙氨酸
以15 ×0.9cm的短交换柱，0.4M 0.2M柠檬酸钠， pH5.26为淋洗剂可以分离出碱性氨基酸，如精氨酸等。
带”——即色谱 Chromatography
该方法现在仍然广泛使用，如有机合成中的“过柱子”。常见的 是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。又称为柱层析/柱色谱，或经 典液相色谱法（相对于HPLC）。
一、离子交换色谱法的分类
1）淋洗色谱：通常先将少量样品通过交换柱，达到吸附 平衡，然后用亲和力比组分A、B、C都弱的离子作淋洗剂， 得到相互分离开的淋洗曲线。主要用于分析分离。
后进行测定。
置换色谱：
锂和钠的硫酸盐混合溶液通过一根氢型DOWE×50，300目树脂的交 换柱，用1.0mol/L(NH4)2SO4淋洗得到的淋洗曲线。
有时，在淋洗液中加入一定的络合剂，降低金属离子与树脂的亲和力， 从而使得NH4 +, Na+能对二、三价的金属离子起到置换作用。 Li+＜H+＜Na+＜NH4+＜K+＜Rb+＜Cs+＜Ag+＜Tl+
在用溶剂平衡时，先使材料沉淀， 用倾泻法除去悬浮的细颗粒，否则由 于细颗粒的堵塞，溶剂的流速将显著 降低。
离子交换色谱法和离子色谱法
阳离子交换树脂
RSO H
3
+
X
RSO3X
+
H
不可交换离子 可交换离子 待测离子
交换平衡常数或选择性系数
RSO X H RSO X 3 3 s m s Ks RSO3 H s X m RSO3 H s / X m K A KB / H m
强酸型阳离子交换树脂：含有磺酸基-SO3 H+的树脂
OH 2.阴离子交换树脂：在骨架上引入能电离出 的
碱性基团，如季铵基、氨基、仲胺基，叔胺基。 强碱型阴离子交换树脂：含有季铵基-N(CH3)+3 OH 的树脂。
交联度和交换容量
交联度：
表示离子交换树脂中交联剂的含量大小，即合成树脂 时二乙烯苯在原料中的重量百分含量。 强酸型--2～16%：强碱性--<10%。 交联度越高。网眼越小，选择性越高，大体积离子愈 难进入树脂基体。
影响Ks的因素
1）溶质的离子电荷数越大或水合离子半径越 小，则KS ↑。 2）交换能力强、选择性大的离子组成流动相 的洗脱力越大，则tR↓, KS↓ 3) pH降低时，弱电解质的离解被抑制（弱酸 ），tR↓, KS↓ 4）交联度↑，交换容量↑， tR ↑, KS ↑
流动相
离子交换色谱多以水溶液为流动相，因为水具有使组
分离子化的特性，也可在流动相中加入少量有机溶剂（甲
醇，四氢呋喃和乙腈）以增加某些组分的溶解度进而改变 分离选择性，这对分离可离解的有机化合物尤为有利。 以水为流动相的离子色谱中，组分的保留时间和分离 度主要通过控制流动相pH和离子强度调节。
离子交换色谱法分析化学
离子交换色谱法分析化学离子交换色谱法是一种常用的分离和分析方法，广泛应用于化学、生物、环境等领域。
该方法基于离子交换剂与样品中离子之间的相互作用，实现对目标化合物的分离和分析。
本文将介绍离子交换色谱法的基本原理、实验操作步骤以及在化学分析中的应用。
一、离子交换色谱法的基本原理离子交换色谱法利用离子交换剂作为固定相，通过与样品中离子之间的相互作用，实现分离目标化合物。
离子交换剂是一种具有交换基团的功能性材料，通过基团与样品中离子进行交换，从而实现对目标化合物的分离。
根据不同的交换基团和固定相材料，离子交换色谱法可应用于不同类型化合物的分离和分析。
二、实验操作步骤1、准备实验仪器和试剂，包括色谱柱、流动相、样品溶液等。
2、将离子交换剂填充至色谱柱中，制成固定相。
3、将样品溶液注入进样器中。
4、开启泵，使流动相通过色谱柱，将样品中的离子与固定相中的交换基团进行交换。
5、通过检测器对分离后的离子进行分析和检测。
6、根据峰高、峰面积等参数计算目标化合物的含量。
三、离子交换色谱法在化学分析中的应用1、有机酸和碱的分离和分析：离子交换色谱法可用于分离和测定有机酸和碱的含量，如乳酸、柠檬酸、苯胺等。
通过选择合适的离子交换剂和流动相，可实现高分辨率分离和准确测定。
2、金属离子的分离和分析：离子交换色谱法可用于分离和测定金属离子，如钠、钾、钙、镁等。
通过选择含有适当功能基团的固定相，可实现对不同金属离子的分离和分析。
3、环境样品的分离和分析：离子交换色谱法可用于分离和测定环境样品中的阴、阳离子，如水样、土壤样品的分离和分析。
通过优化实验条件，可实现高分辨率分离和准确测定。
4、生物样品的分离和分析：离子交换色谱法可用于分离和测定生物样品中的离子，如氨基酸、多肽等。
通过选择合适的固定相和流动相，可实现高分辨率分离和准确测定。
5、其他领域的应用：离子交换色谱法还可应用于化学合成、药物分析、食品分析等领域。
通过选择合适的固定相和流动相，可实现对不同类型化合物的分离和分析。
cex色谱法原理
CEX色谱法（Cation Exchange Chromatography）是一种常用的离子交换色谱技术，广泛应用于生物制药、蛋白质纯化和分析等领域。
本文将对CEX色谱法的原理进行详细介绍。
一、CEX色谱法概述CEX色谱法是基于离子交换作用的一种分离技术。
它利用固定相上的离子交换基团与待分离物之间的相互作用，实现不同带电物质在流动相中的分离。
二、固定相材料1. 基质：CEX色谱柱的固定相通常由聚合物或硅胶等材料构成。
聚合物基质具有较高的表面积和较好的机械强度，可适应高流速和高压下的操作。
2. 功能基团：固定相材料上的功能基团决定了其对待分离物的选择性。
常见的功能基团包括磺酸基、羧酸基和胺基等。
三、分离原理1. 离子交换机制：在CEX色谱柱固定相的功能基团上存在离子交换位点，可以吸附带电物质。
待分离物中的阳离子或阴离子与功能基团上的离子交换位点发生相互作用，使其被固定相吸附。
2. 选择性：固定相材料的功能基团类型和流动相条件可以调节CEX色谱的选择性。
对于阳离子交换柱，功能基团通常为磺酸基，选择性较强；而阴离子交换柱的功能基团通常为胺基或羧酸基，选择性较弱。
3. 离子强度调节：离子强度是影响CEX色谱分离效果的重要因素之一。
增加流动相中的离子浓度可以提高离子交换柱的选择性；而降低离子浓度则有利于样品的洗脱。
4. pH调节：改变流动相pH值可以调节待分离物的带电状态，从而影响其在CEX色谱柱上的吸附行为。
当待分离物与功能基团之间的电荷相同时，相互作用较强，分离效果较好。
四、操作步骤1. 样品处理：将待分离的样品进行预处理，如去除杂质、调节pH值等。
2. 色谱柱平衡：将色谱柱与流动相进行平衡，以确保固定相处于最佳状态。
3. 样品加载：将样品溶液加载到色谱柱上，待分离物与固定相发生离子交换作用。
4. 洗脱条件优化：通过调节流动相的离子强度、pH值等参数，实现待分离物的洗脱。
5. 分析和收集：根据需求，对洗脱后的样品进行分析或收集。
离子交换色谱
离子交换色谱一、实验原理：离子交换层析Ion Exchange Chromatography简称为IEC是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法;离子交换层析中,基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成;带有正电荷的称之阴离子交换树脂;而带有负电荷的称之阳离子树脂;离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化;由于蛋白质也有等电点,当蛋白质处于不同的pH条件下,其带电状况也不同;阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质,所以这类蛋白质被留在柱子上,然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施,将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来;结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来;反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质,结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来;离子交换层析是用离子交换剂作固定相,利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的层析方法;即溶液中的离子同离子交换剂上功能基团交换反应的过程;带电荷量少,亲和力小的先被洗脱下来,带电荷量多,亲和力大的后被洗脱下来;二、实验设计离子交换剂；缓冲液；洗脱剂具体操作：1、离子交换介质的选择：考虑目的分子的大小,目的分子会影响其接近介质上的带电功能集团；功能集团的强弱,目的分子稳定,选择强交换介质;对于大多数纯化步骤来说,建议开始的时候使用强离子交换柱,可在摸索方法的过程中有一个宽的pH范围;对于一个已知等电点的蛋白质,可根据其等电点来选择;如果选用阴离子交换剂,使用缓冲液的pH值应高于该蛋白质等电点,因为此时蛋白质在该缓冲液中携带净负电荷,可与阴离子交换剂结合;如果选用阳离子交换剂,缓冲液的pH值应低于该蛋白质的等电点,因为此时蛋白质在该缓冲液中携带净正电荷,可与阳离子交换剂结合;对于一个未知等电点的蛋白质,可以先选择一个阴离子交换剂,再选择一个中性的pH缓冲液,将蛋白质样品透析至,然后过阳离子交换柱,根据过柱后的结果确定下一个使用的缓冲液的pH;如果目的蛋白再穿过液中,说明目的蛋白在此pH条件下带正电荷,可将缓冲液升高一个pH,将蛋白质样品透析纸,然后再过阴离子交换柱,根据过柱后的结果确定下一个使用的缓冲液的pH;以此类推,直至目的蛋白能够结合在阴离子交换柱上为止,也可用阳离子交换剂作类似的选择,不过要注意,pH的改变应向减小的方向进行;功能集团的强弱一般情况下,在分离等电点pH为6-9的目的分子,尤其是当目的分子不稳定时,需要较温和的色谱条件才会选用弱交换介质;流动相缓冲液的选择：离子交换色谱的流动相必须是有一定离子强度的并且对pH有一定缓冲作用的溶液；阳离子交换剂应选择阴离子缓冲液,可用柠檬酸盐、醋酸盐、磷酸盐等；阴离子交换剂应选用阳离子缓冲液,可用乙二胺、Tris等；起始缓冲液浓度应尽可能低,这样可使色谱柱上吸附更多的分离物质;2、色谱柱的选择通常选择粗短柱,即高径比小的色谱柱;离子交换分离蛋白质是依靠吸附强弱不同,发生吸附时蛋白质会优先结合在色谱柱的上部,如果柱子过长,增加了从吸附位置到收集位置的流程距离,容易增加样品扩散,导致峰值增加3、折叠预处理和装柱对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒,以保证有较好的均匀度,对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤;溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理,使之成为带H+或OH-的交换剂型;阴离子交换剂常用"碱-酸-碱"处理,使最终转为-OH-型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用"酸-碱-酸"处理,使最终转为-H-型交换剂;洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的pH和离子强度;已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡;为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层,要适当加压装柱,同时使柱床压紧,减少死体积,有利于分辨率的提高;柱子装好后再用起始缓冲液淋洗,直至达到充分平衡方可使用;5、折叠加样与洗脱及洗脱组分的收集和分析加样：层析所用的样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度,所选定的pH值应落在交换剂与被结合物有相反电荷的范围,同时要注意离子强度应低,可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的;样品中的不溶物应在透析后或凝胶过滤前,以离心法除去;为了达到满意的分离效果,上样量要适当,不要超过柱的负荷能力;柱的负荷能力可用交换容量来推算,通常上样量为交换剂交换总量的1%-5%;折叠洗脱：已结合样品的离子交换前,可通过改变溶液的pH或改变离子强度的方法将结合物洗脱,也可同时改变pH与离子强度;为了使复杂的组份分离完全,往往需要逐步改变pH或离子强度,其中最简单的方法是阶段洗脱法,即分次将不同pH与离子强度的溶液加入,使不同成分逐步洗脱;由于这种洗脱pH与离子强度的变化大,使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱,纯度较差,不适宜精细的分离;最好的洗脱方法是连续梯度洗脱,两个容器放于同一水平上,第一个容器盛有一定pH的缓冲液,第二个容器含有高盐浓度或不同pH的缓冲液,两容器连通,第一个容器与柱相连,当溶液由第一容器流入柱时,第二容器中的溶液就会自动来补充,经搅拌与第一容器的溶液相混合,这样流入柱中的缓冲液的洗脱能力即成梯度变化;第一容器中任何时间的浓度都可用下式进行计算:C=C2-C2-C11-VA2/A1式中A1、A2分别代表两容器的截面积:C1、C2分别表示容器中溶液的浓度;V为流出体积对总体积之比;当A1=A2时为线性梯度,当A1>A2时为凹形梯度,A1>A2时为凸形梯度;洗脱时应满足以下要求:①洗脱液体积应足够大,一般要几十倍于床体积,从而使分离的各峰不至于太拥挤;②梯度的上限要足够高,使紧密吸附的物质能被洗脱下来;③梯度不要上升太快,要恰好使移动的区带在快到柱末端时达到解吸状态;目的物的过早解吸,会引起区带扩散;而目的物的过晚解吸会使峰形过宽;洗脱馏份的分析按一定体积5-10ml/管收集的洗脱液可逐管进行测定,得到层析图谱;依实验目的的不同,可采用适宜的检测方法生物活性测定、免疫学测定等确定图谱中目的物的位置,并回收目的物;洗脱组分的收集和分析：通常色谱柱下端连接一个紫外检测器,用于检测蛋白质组分的洗脱过程,而后又连接着部分收集器,用于收集洗脱液;6、离子交换剂的再生与保存离子交换剂可在柱上再生;如离子交换纤维素可用2mol/:NaCl淋洗柱,若有强吸附物则可用LNaOH洗柱；若有脂溶性物质则可用非离子型去污剂洗柱后再生,也可用乙醇洗涤,其顺序为：LNaOH-水-乙醇-水-20%NaOH-水;保存离子交换剂时要加防腐剂;对阴离子交换剂宜用%氯已定洗必泰,阳离子交换剂可用乙基硫柳汞%;有些产品建议用%叠氮钠;三、举例：离子交换层析法分离氨基酸原理：所用样品为天冬氨酸和组氨酸的混合液,分别属酸性氨基酸、碱性氨基酸,用强酸型阳离子交换树脂Dowex50,在一定洗脱条件下洗脱,将它们分离;组氨酸pH>10,天冬氨酸.器材：层析柱,沸水浴等试剂：Dowex50；LNaOH；柠檬酸缓冲液；氨基酸混合液；茚三酮混合液目数：离子交换树脂的颗粒直径大小Dowex50为20-50目Dowex20 840µmDowex50 297µmDowex100 149µm代表二乙烯苯的百分含量操作：1、层析：将Dowex50装柱后,用LNaOH清洗树脂5分钟,再用柠檬酸缓冲液平衡10分钟;方法同凝胶层析法加样5-6滴;当样品进入树脂后,加入柠檬酸缓冲液洗脱加样后立即收集,每管收集3ml控制流速15滴/分钟;当第一峰一出现,换用LNaOH作洗脱液,直至第二峰收集完毕;用柠檬酸缓冲液再平衡10分钟,再生;2、检测：从第二管起每收集管中加入茚三酮显色液,充分混合,沸水浴15分钟,自来水冷却,观察氨基酸与茚三酮的显色反应,若生成紫色混合物,则说明收集到氨基酸;四、离子交换色谱的优缺点：优点：1、具有开放性支持骨架,大分子可以自由进入和迅速扩散,故吸附容量大；2、有亲水性,对大分子的吸附不太牢固,用温和条件即可洗脱,不致引起蛋白质变性和酶的失活；3、多孔性、表面积大、交换容量大、回收率高,可用于分离和制备;缺点：由交换层析介质决定,不同蛋白质相互分离效果也不确定,这种分离也易造成各蛋白峰的重叠,造成分离纯度的下降;四、离子交换色谱的优缺点：优点：1、具有开放性支持骨架,大分子可以自由进入和迅速扩散,故吸附容量大；2、有亲水性,对大分子的吸附不太牢固,用温和条件即可洗脱,不致引起蛋白质变性和酶的失活；3、多孔性、表面积大、交换容量大、回收率高,可用于分离和制备;缺点：由交换层析介质决定,不同蛋白质相互分离效果也不确定,这种分离也易造成各蛋白峰的重叠,造成分离纯度的下降;。
离子交换色谱法的主要操作步骤
离子交换色谱法的主要操作步骤
离子交换色谱法（Ion exchange chromatography）是一种常见的化学分离技术，主要用于离子物质的分离和纯化。
其操作步骤如下：
1. 样品处理：首先需要将待测样品进行配制处理，如去除杂质、调节pH 值等。
2. 样品进样：将经过处理的样品通过注射器、自动进样器或其他进样方式加入到离子交换柱内。
3. 洗脱液选取：根据样品的性质及所需纯度和分离效果，选择合适的洗脱液，通常是盐酸、硫酸或其他缓冲液。
洗脱液的pH 值是影响分离效果的重要因素。
4. 进行色谱分离：将样品溶液从离子交换柱的顶端缓慢流过，在中性或弱酸性条件下，离子样品在离子交换树脂中进行吸附和解吸，以达到分离和纯化的目的。
5. 洗脱收集：待分离的离子物质通过离子交换柱后，再用洗脱液冲洗掉不需要的杂质和离子，最终收集所需的纯化离子物质。
6. 洗脱后处理：将收集到的离子物质进行洗脱液去除或其他处理方式，以得到目标样品。
以上便是离子交换色谱法的主要操作步骤。
色谱分离技术—离子交换色谱分离技术
离子交换剂
离子交换树脂的性能评价——滴定曲线 滴定曲线也是检验和测定离子交换剂性能的重要数据，如下图是几种离子交
换剂的滴定曲线。
几种典型离子交换剂的滴定曲线
n为单位质量离子交换剂所加入的NaOH或HCl的毫摩尔数 1,2,3,4分别为强酸型、弱酸型、强碱型、弱碱型离子交换剂滴定曲线
影响离子交换的因素
温度的影响 温度的改变对稀溶液的离子交换性能影响不大，但在0.1mol/L以上浓度时，
温度升高对水合倾向大的离子容易交换吸附。同时离子的活性系数增大，对弱 酸、弱碱交换剂来说其交换率有较大的影响。一般温度增高，离子交换速度加 快，在洗脱时亦可提高洗脱能力。但对不耐热的交换剂应注意提高温度的条件， 避免引起交换剂的破坏。
离子交换树脂的命名 离子交换树脂的型号由三位阿拉伯数字组成：第一位数
字代表产品的分类；第二位数字代表骨架；第三位数字为顺 序号，用以区别基团。
离子交换色谱分离技术
离子交换剂
离子交换树脂的性能评价——交换容量
不同的树脂其交换能力大小不同，表征树脂交换能力大 小的主要参数是交换容量，即指每克干燥离子交换树脂或每 毫升完全溶胀的离子交换树脂所能吸收的一价离子的毫摩尔 数。交换容量的大小，取决于网状结构中活性基团的数目， 含有活性基团越多，交换容量也越大。但交换容量太大，活 性基团太多，树脂不稳定。
影响离子交换的因素
溶剂的影响 通常在水中进行交换，亦可采用含水溶剂，但在极性小的溶剂中难以进行
或不进行交换，同时还导致离子交换的选择性的降低或消失。
离子交换色谱分离技术的应用
可溶性的有机或无机离子化合物均可进行离子交换色谱操作。 化合价越高，被结合的生物物质越强，相同化合价和条件下，结合的亲和力
离子交换色谱
离子交换色谱
离子交换色谱（Ion exchange chromatography，简称IEX）是一种在离子交换树脂上进行的分离技术。
该技术基于样品中离子与固相固定离子之间的相互作用，实现样品中化合物的分离和纯化。
离子交换色谱的原理是利用带电的离子交换树脂作为固定相，当样品溶液经过固定相时，离子交换树脂上的固定离子会与样品中的带电离子发生相互作用。
在交换树脂上，样品中的带电离子可以与固定离子发生相互作用，形成离子交换。
通过调节溶液的离子强度或改变pH值，可以控制离子交换的强弱，从而实现对样品中的离子的分离。
离子交换色谱技术广泛应用于生物化学、生命科学、制药和环境科学等领域，常用于分离和纯化蛋白质、多肽、核酸、多糖等生物分子。
同时，离子交换色谱也可以用于分析和测定样品中特定离子的浓度。
离子交换色谱可以分为阳离子交换色谱（Cation Exchange Chromatography，简称CEX）和阴离子交换色谱（Anion Exchange Chromatography，简称AEX）
两种类型。
阳离子交换色谱适用于带正电荷的物质的分离，而阴离子交换色谱则适用于带负电荷的物质的分离。
离子交换色谱的原理
离子交换色谱的原理摘要：本文主要从基础原理与实验设计思路两个方面讲述了蛋白纯化实验中离子交换色谱的应用，并附有AKTA离子交换色谱操作案例。
基本原理离子交换色谱是蛋白纯化技术中常用的一种纯化方法，其原理是指被分离物质所带的电荷可与离子交换剂所带的相反电荷结合，这种带电分子与固定相之间的结合作用是可逆的，在改变pH或者用逐渐增加离子强度的缓冲液洗脱时，离子交换剂上结合的物质可与洗脱液中的离子发生交换而被洗脱到溶液中。
由于不同物质的电荷不同，其与离子交换剂的结合能力也不同，所以被洗脱到溶液中的顺序也不同，从而被分离出来。
离子交换剂是由不溶于水的网状结构高分子聚合物骨架构成，骨架上有许多共价结合的带电基团，如果侧链是带正电基团，就可与带负离子相结合，称为阴离子交换剂，吸附带负电蛋白质。
如果侧链是带负电的基团，则称为阳离子交换剂。
强离子交换树脂在宽pH范围内保持离子化，而弱离子交换树脂只在窄pH值内离子化。
类型名称英文符号阴离子交换剂二乙基氨乙基季氨基乙基季氨基三乙基氨乙基氨乙基DEAEQAEQTEAEAE阳离子交换剂羧甲基磺丙基磺甲基磷酸基CMSPSP大多数重组蛋白通过离子交换纯化。
离子交换色谱基于高分辨率，可直接放大并应用于工业。
该柱可以容易地再生，并且可以浓缩蛋白质。
大部分蛋白质的静电荷是负电荷，所以阴离子交换色谱是应用最广泛的。
实验设计介质的选择首先，在离子交换介质中要考虑目标分子的大小，因为目标分子会影响其与介质上带电官能团的接近程度，所以也会影响介质对目标分子的动载荷，从而影响其分离。
对于大多数纯化步骤来说，建议从开始的阶段使用强离子交换柱，可在摸索方法的过程中有一个宽的pH范围。
对于已知等电点的蛋白质，可根据其等电点来选择。
而未知等电点的蛋白质，在实际操作中常采用这样的方法，先选择一个阴离子交换剂，再选择一个中性的pH缓冲液，将蛋白质样品透析至pH7.0，然后过阴离子交换柱。
根据过柱后的结果确定下一个使用的缓冲液pH。
弱阳离子交换色谱
弱阳离子交换色谱离子交换色谱( ion exchange chromatography,IEC)是最早应用的液相色谱技术之离子交换色谱法针对离子型样品,根据样品离子与固定相表面离子交换基团的交换能力差异进行分离,对生物样品,如蛋自质、肽类、氨基酸、核酸、核苷、碱基、碳水化合物等的分离尤为适宜,因此已成为相关领域中非常有效的分析检测和分离纯化手段。
一、原理与色谱柱推荐IEC分离机理建立在样品分子与固定相表面基团之间电荷相互作用的基础上,这种相互作用可能表现为离子与离子、偶极与离子或者其他动态平衡作用力的形式。
图1直观地给出了样品离子在色谱柱中发生的离子交换过程。
样品离子将同离子从固定相表面顶替下来带电性质、分子结构等不同,其与固定相表面的作用力也不同,因此被顶替的难易程度存在差异,最终实现分离。
按所使用的离子交换剂的不同,IEC方法可分强阴、强阳、弱阴、弱阳离子交换色谱四种模式。
离子交换固定相大多在有机高聚物或硅胶上接枝离子交换基团制备。
离子交换剂上的活性离子交换基团决定着其性质和功能,带磺酸基的为强阳离子交换剂;带羧酸基的为弱阳离子交换剂:带季铵基(一RN)的为强阴离子交换剂;带伯、仲、叔氨基的为弱阴离子交换剂。
使用最多的阴离子交换基团是季铵、二乙氨基乙基和聚乙亚胺,使用最多的阳离子交換基团是磺丙基和羧基。
硅胶基质离子交换键合相具有刚性强、耐压及无树脂固有的溶胀和收缩现象等优点。
此外,硅胶基质粒度小、均匀性好、表面传质过程快,因而柱效比离子交换树脂柱高。
离子交换键合相柱的操作比树脂柱简单,通常在室温下操作即可获得良好的分离。
有机高分子类离子交换固定相如纤维素、葡萄糖、琼脂糖的衍生物等具有全pH值(1范围适用、可以选择各种缓冲液流动相体系、使用寿命长、色谱柱易于再生、固定相色谱容量高、非特性吸附少、有利于保持样品生物活性等特点,因此在离子交换色谱固定相中占据主要地位。
聚合物基质的离子交换色谱固定相通常用聚苯乙烯和二乙烯基苯进行交联共聚生成不溶性的聚合物基质,再对芳环进行磺化制成强酸性阳离子交换剂;或对芳环进行季铵盐化,制成带有烷基胺官能团的强碱性阴离子交换剂。
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洗脱体积 色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动 相体积，为洗脱体积
Ve Vm K dVs
不同的溶质，由于和固定相的亲和力的 不同，洗脱体积也有所差异。
理论板，理论板当量高度（HETP），理论塔板数 （N）、 反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度 与柱高之间的关系。 理论板：将溶质达到一次分配平衡的色谱柱段。 理论板当量高度：该段色谱柱的高度。
色谱法的基本原理
色谱法是利用混合物中各组分物理化学性质的差 异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、 分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的， 称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相） 中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度 移动而达到分离的目的。
色谱分离
淋洗液
慢 中等 快
Temporal course
分子筛凝胶色谱原理
分离关系：组分0的M最大，不能进入gel，洗脱体 积为空隙体积V0；组分t的M最小，能进入到gel 的细孔中，其洗脱体积接近柱体积Vt, 组分1-2 在V0-Vt之间. 显然，GFC能分离洗脱体积在V0Vt之间的组分。对于组分1和2，两峰距离
V2 V1 Vt V0 m2 m1
两个相邻洗脱峰之间的距离与两个峰宽的代数平均值.
阻滞因子Rf 阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速 度和标准物（与固定相没有亲和力的流 动相 Kd=0）的迁移率之比
溶质的迁移距离 Rf 流动相在色谱系统中的迁移距离
Am Rf Am K d As
其意义在于体现某一种溶质与固定相之间 的亲和力大小.
理论板数的计算方法
tR 2 N 5.54( ) W1/ 2
tR 2 N 16( ) Wb
理论塔板高度：
N---理论塔板数 tR---保留时间 W1/2---半峰宽 Wb---峰底宽度
L H N
L---柱长
22.2 色谱分离方法的分类
色谱分离方法很多，种类有四、五十种 但常用于生物大分子分离的色谱方法，按机 理分，有以下几种：
按分离的压力 高压色谱 中压色谱 低压色谱 按流动相分 气相色谱 液相色谱 超临界流体色谱
22.3
各类色谱技术及应用
凝胶过滤色谱 离子交换色谱 疏水色谱 聚焦色谱 反相色谱 超临界流体色谱 羟基磷灰石色谱 灌注filtration chromatography(GFC)原理 操作与原理：含有不同组分的溶液， 通过网状结构的凝胶粒子(a)， 小分子扩散进入凝胶相，大分 子被排阻于凝胶相外，加入洗 脱剂后溶液向下推移，大分子 及剩余的小分子进入下层新的 凝胶相中，重复上述扩散和排 阻。这样最先流出的为最大的 分子，最后流出的为最小分子， 分段收集可以获得按分子量大 小分布的各组分。 分子筛色谱 : 从上可见，凝胶过滤 具有分子筛的作用。
吸水率 W溶胀平衡后gel W干gel W干gel 100 %
分配系数 可由Langmuir方程得出
q Kd c
Kd---分配系数 q、c---溶质在固相和液相中的浓度
保留时间（tR）和保留体积（VR） 反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱 过程的基本热力学参数之一。
分离度:又称分辨率，用来表示两种洗脱曲线 相邻的溶质相互分离的程度。
2( R1 R 2 ) R W1 W2
按操作形式不同分类：
柱色谱：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动 而达到分离。 纸色谱：用滤纸做液体的载体，点样后，用流动相展 开，以达到分离鉴定的目的。 薄层色谱：将适当粒度的吸附剂铺成薄层，以纸色谱 类似的方法进行物质的分离和鉴定。 纸色谱和薄层色谱主要适用于小分子物质的快速检 测分析和少量分离制备，通常为一次性使用，而柱 色谱是常用的色谱形式，适用于样品分析、分离。 生物化学中常用的凝胶色谱、离子交换色谱、亲和 色谱、高效液相色谱等都通常采用柱色谱形式。
分配系数m影响因素：分子量, 分子形状, gel孔 径结构；与pH, I, T无关.
2)凝胶介质 对介质的要求： 1st 亲水性高； 2nd 表面惰性，不发生化学和物理变化； 3rd 高稳定性，有较宽的pH和I适应范围； 4th 具有一定的孔径分布； 5th 机械强度高，耐高压操作，寿命长。 商品化的介质均能满足1-4条的要求。 介质的类型： 1st Sephadex 2nd Sephacryl 3rd Superose/-dex, Sepharose 4th Cellulose 5th TSKgel
22 液相色谱技术 Chromatography
背景
色谱法也称色层法，是1906年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。他将植物叶子的色素通过装填有吸 附剂的柱子，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色 带而被分开，由此得名为“色谱法”（Chromatography) 。 后来无色物质也可利用吸附柱色谱分离。 英国生物学家Martin和Synge。他们首先提出了色谱塔板 理论，以及其远见卓识的预言。 1944年出现纸色谱以后，色谱法不断发展，相继出现薄层 色谱、亲和色谱、凝胶色谱、气相色谱、高压液相色谱 （HPLC）等。
凝胶介质特征参数 排阻极限 (exclusion limit) ：指不能扩散到凝胶 网络内部的最小分子的 M 。如， Sephadex G50 的 排阻极限为30kD。 分级范围 (fractionation range) ：能阻滞组分并 且使组分相互之间得到分离的组分分子量范围。 如， Sephadex G50的分级在1.5-30KD内。 溶胀率/吸水率：
22.1色谱的基本概念
固定相：固定相是色谱的一个基质。它可以是固 体物质（如吸附剂，凝胶，离子交换剂等），也 可以是液体物质（如固定在硅胶或纤维素上的溶 液），这些基质能与待分离的化合物进行可逆的 吸附，溶解，交换等作用。
流动相：在色谱过程中，推动固定相上待分离的 物质朝着一个方向移动的液体、气体等，都称为 流动相。柱色谱中一般称为洗脱剂，薄层色谱时 称为展层剂。