离子交换色谱

离子交换色谱
一、实验原理：
离子交换层析(Ion Exchange Chromatography简称为IEC)是以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。

离子交换层析中，基质是由带有电荷的树脂或纤维素组成。

带有正电荷的称之阴离子交换树脂;而带有负电荷的称之阳离子树脂。

离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。

由于蛋白质也有等电点，当蛋白质处于不同的pH条件下，其带电状况也不同。

阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质，所以这类蛋白质被留在柱子上，然后通过提高洗脱液中的盐浓度等措施，将吸附在柱子上的蛋白质洗脱下来。

结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。

反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质，结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。

离子交换层析是用离子交换剂作固定相，利用它与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的层析方法。

即溶液中的离子同离子交换剂上功能基团交换反应的过程。

带电荷量少，亲和力小的先被洗脱下来，带电荷量多，亲和力大的后被洗脱下来。

二、实验设计
离子交换剂；缓冲液；洗脱剂
具体操作：
离子交换介质的选择：
考虑目的分子的大小，目的分子会影响其接近介质上的带电功能集团；功能集团的强弱，目的分子稳定，选择强交换介质。

对于大多数纯化步骤来说，建议开始的时候使用强离子交换柱，可在摸索方法的过程中有一个宽的pH范围。

对于一个已知等电点的蛋白质，可根据其等电点来选择。

如果选用阴离子交换剂，使用缓冲液的pH值应高于该蛋白质等电点，因为此时蛋白质在该缓冲液中携带净负电荷，可与阴离子交换剂结合。

如果选用阳离子交换剂，缓冲液的pH值应低于该蛋白质的等电点，因为此时蛋白质在该缓冲液中携带净正电荷，可与阳离子交换剂结合。

对于一个未知等电点的蛋白质，可以先选择一个阴离子交换剂，再选择一个中性的pH缓冲液，将蛋白质样品透析至pH7.0，然后过阳离子交换柱，根据过柱后的结果确定下一个使用的缓冲液的pH。

如果目的蛋白再穿过液中，说明目的蛋白在此pH条件下带正电荷，可将缓冲液升高一个pH，将蛋白质样品透析纸8.0，然后再过阴离子交换柱，根据过柱后的结果确定下一个使用的缓冲液的pH。

以此类推，直至目的蛋白能够结合在阴离子交换柱上为止，也可用阳离子交换剂作类似的选择，不过要注意，pH的改变应向减小的方向进行。

功能集团的强弱
一般情况下，在分离等电点pH为6-9的目的分子，尤其是当目的分子不稳定时，需要较温和的色谱条件才会选用弱交换介质。

流动相（缓冲液）的选择：
离子交换色谱的流动相必须是有一定离子强度的并且对pH有一定缓冲作用的溶液；阳离子交换剂应选择阴离子缓冲液，可用柠檬酸盐、醋酸盐、磷酸盐等；阴离子交换剂应选用阳离子缓冲液，可用乙二胺、Tris等；起始缓冲液浓度应尽可能低，这样可使色谱柱上吸附更多的分离物质。

色谱柱的选择
通常选择粗短柱，即高径比小的色谱柱。

离子交换分离蛋白质是依靠吸附强弱不同，发生吸
附时蛋白质会优先结合在色谱柱的上部，如果柱子过长，增加了从吸附位置到收集位置的流程距离，容易增加样品扩散，导致峰值增加
折叠预处理和装柱
对于离子交换纤维素要用流水洗去少量碎的不易沉淀的颗粒，以保证有较好的均匀度，对于已溶胀好的产品则不必经这一步骤。

溶胀的交换剂使用前要用稀酸或稀碱处理，使之成为带H+或OH-的交换剂型。

阴离子交换剂常用"碱-酸-碱"处理，使最终转为-OH-型或盐型交换剂；对于阳离子交换剂则用"酸-碱-酸"处理，使最终转为-H-型交换剂。

洗涤好的纤维素使用前必须平衡至所需的pH和离子强度。

已平衡的交换剂在装柱前还要减压除气泡。

为了避免颗粒大小不等的交换剂在自然沉降时分层，要适当加压装柱，同时使柱床压紧，减少死体积，有利于分辨率的提高。

柱子装好后再用起始缓冲液淋洗，直至达到充分平衡方可使用。

5、折叠加样与洗脱及洗脱组分的收集和分析
加样：
层析所用的样品应与起始缓冲液有相同的pH和离子强度，所选定的pH值应落在交换剂与被结合物有相反电荷的范围，同时要注意离子强度应低，可用透析、凝胶过滤或稀释法达此目的。

样品中的不溶物应在透析后或凝胶过滤前，以离心法除去。

为了达到满意的分离效果，上样量要适当，不要超过柱的负荷能力。

柱的负荷能力可用交换容量来推算，通常上样量为交换剂交换总量的1%-5%。

折叠洗脱：
已结合样品的离子交换前，可通过改变溶液的pH或改变离子强度的方法将结合物洗脱，也可同时改变pH与离子强度。

为了使复杂的组份分离完全，往往需要逐步改变pH或离子强度，其中最简单的方法是阶段洗脱法，即分次将不同pH与离子强度的溶液加入，使不同成分逐步洗脱。

由于这种洗脱pH与离子强度的变化大，使许多洗脱体积相近的成分同时洗脱，纯度较差，不适宜精细的分离。

最好的洗脱方法是连续梯度洗脱，两个容器放于同一水平上，第一个容器盛有一定pH的缓冲液，第二个容器含有高盐浓度或不同pH的缓冲液，两容器连通，第一个容器与柱相连，当溶液由第一容器流入柱时，第二容器中的溶液就会自动来补充，经搅拌与第一容器的溶液相混合，这样流入柱中的缓冲液的洗脱能力即成梯度变化。

第一容器中任何时间的浓度都可用下式进行计算:C=C2-(C2-C1)(1-V)A2/A1
式中A1、A2分别代表两容器的截面积:C1、C2分别表示容器中溶液的浓度;V为流出体积对总体积之比。

当A1=A2时为线性梯度，当A1>A2时为凹形梯度，A1>A2时为凸形梯度。

洗脱时应满足以下要求:
①洗脱液体积应足够大，一般要几十倍于床体积，从而使分离的各峰不至于太拥挤。

②梯度的上限要足够高，使紧密吸附的物质能被洗脱下来。

③梯度不要上升太快，要恰好使移动的区带在快到柱末端时达到解吸状态。

目的物的过早解吸，会引起区带扩散;而目的物的过晚解吸会使峰形过宽。

洗脱馏份的分析按一定体积(5-10ml/管)收集的洗脱液可逐管进行测定，得到层析图谱。

依实验目的的不同，可采用适宜的检测方法(生物活性测定、免疫学测定等)确定图谱中目的物的位置，并回收目的物。

洗脱组分的收集和分析：
通常色谱柱下端连接一个紫外检测器，用于检测蛋白质组分的洗脱过程，而后又连接着部分收集器，用于收集洗脱液。

离子交换剂的再生与保存
离子交换剂可在柱上再生。

如离子交换纤维素可用2mol/:NaCl淋洗柱，若有强吸附物则可用0.1mol/LNaOH洗柱；若有脂溶性物质则可用非离子型去污剂洗柱后再生，也可用乙醇洗涤，其顺序为：0.5mol/LNaOH-水-乙醇-水-20%NaOH-水。

保存离子交换剂时要加防腐剂。

对
阴离子交换剂宜用0.002%氯已定(洗必泰)，阳离子交换剂可用乙基硫柳汞(0.005%)。

有些产品建议用0.02%叠氮钠。

三、举例：离子交换层析法分离氨基酸
原理：所用样品为天冬氨酸和组氨酸的混合液，分别属酸性氨基酸（pI2.77）、碱性氨基酸（pI7.59），用强酸型阳离子交换树脂Dowex50，在一定洗脱条件下洗脱，将它们分离。

组氨酸pH>10，天冬氨酸pH4.2.
器材：层析柱，沸水浴等
试剂：Dowex50；0.1mol/LNaOH；pH4.2柠檬酸缓冲液；氨基酸混合液；茚三酮混合液
目数：离子交换树脂的颗粒直径大小
Dowex50为20-50目
Dowex20 840µm
Dowex50 297µm
Dowex100 149µm
（代表二乙烯苯的百分含量）
操作：
层析：将Dowex50装柱后，用0.1mol/LNaOH清洗树脂5分钟，再用pH4.2柠檬酸缓冲液平衡10分钟。

（方法同凝胶层析法）加样5-6滴。

当样品进入树脂后，加入pH4.2柠檬酸缓冲液洗脱加样后立即收集，每管收集3ml（控制流速15滴/分钟）。

当第一峰一出现，换用0.1mol/LNaOH作洗脱液，直至第二峰收集完毕。

用pH4.2柠檬酸缓冲液再平衡10分钟，再生。

检测：
从第二管起每收集管中加入1.5ml茚三酮显色液，充分混合，沸水浴15分钟，自来水冷却，观察氨基酸与茚三酮的显色反应，若生成紫色混合物，则说明收集到氨基酸。

四、离子交换色谱的优缺点：
优点：
具有开放性支持骨架，大分子可以自由进入和迅速扩散，故吸附容量大；
2、有亲水性，对大分子的吸附不太牢固，用温和条件即可洗脱，不致引起蛋白质变性和酶的失活；
3、多孔性、表面积大、交换容量大、回收率高，可用于分离和制备。

缺点：
由交换层析介质决定，不同蛋白质相互分离效果也不确定，这种分离也易造成各蛋白峰的重叠，造成分离纯度的下降。

四、离子交换色谱的优缺点：
优点：
具有开放性支持骨架，大分子可以自由进入和迅速扩散，故吸附容量大；
有亲水性，对大分子的吸附不太牢固，用温和条件即可洗脱，不致引起蛋白质变性和酶的失活；
多孔性、表面积大、交换容量大、回收率高，可用于分离和制备。

缺点：
由交换层析介质决定，不同蛋白质相互分离效果也不确定，这种分离也易造成各蛋白峰的重叠，造成分离纯度的下降。