8.1-2 凝胶色谱与离子交换色谱

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• 凝胶的孔隙大小分布有一定范围（Φmin～ Φmax ） • 若Φ分子＞ Φmax →全部被排阻在凝胶颗粒之外→全排阻 • 两种全排阻的分子即使大小差别很大，也不能有分离效果 • 若Φ分子＜ Φmin→能进入凝胶的全部孔隙。
• 如果两种分子都能全部进入凝胶孔隙，即使它们的大小有差 别，也不会有好的分离效果。
①Vo的测定
选用分子量约200万的蓝色葡聚糖-2000（或一种不被凝胶
滞留的有颜色的大分子物质，便于观察)，测定它的洗脱曲线，洗脱 峰峰顶洗出的体积就是该柱的Vo值。
②Vi的测定
选用一种分子量小于凝胶工作范围下限的化合物，测出其 洗脱体积Vei，减去Vo就是该柱的Vi 。常用铬酸钾(黄色)或有UV吸收 的物质如N-乙酰酪氨酸乙酯来测定Vi。
SephadexG-10 SephadexG-15 SephadexG-25 SephadexG-50 SephadexG-75
“G-X”反映凝胶的交联程度及持水量。 G-25为每克干凝胶膨 胀时吸水2.5ml 交联葡聚糖凝胶的种类有G-10、15、25、50、75、100、150 和200。通常≤G50的常用于样品的脱盐 23
(Bio-Gel P)
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聚丙烯酰胺凝胶
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3）聚乙烯醇系凝胶
• 以交联聚乙烯醇为骨架的SEC介质，典型产品为日本 TOSOH 拓索公司的Toyopearl
• 大分子链上有丰富的-OH→骨架具有高度亲水性，方便进行 化学改性，生物相容性好
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2、多糖类
• 1）葡聚糖系 • 2）琼脂糖系
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1）葡聚糖 (Sephadex)系凝胶
③Vt的测定
D 2 Vt （ ） h 2
式中，π为常数3.14，D为柱直径，h为凝胶床的高度。
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分配系数（Kd）
Ve＝Vo十KdVi
Ve：洗脱体积，自样 品加入到组分最大浓 度(峰)出现时所流出的 容积；
(V e V o ) Kd Vi
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(V e V o ) Kd Vi
。
1.5M，5M，15M，50M和150M。阿拉伯数字乘以106表 示排阻限度。
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英国的称为Sagavac，又分为Sagavac 2F，4F， 6F，8F，10F和2C，4C，6C，8C，10C。前面的阿 拉伯数字表示凝胶中干胶的百分数，F代表粉末状， C代表颗粒状。
丹麦的称为Gelarose，有5种类型，即 2％，4％，6%，8％和10％。
2）琼脂糖(Sepharose)系凝胶
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Fig1. Gel structure of agarose
Fig2. Structure of the repeating unit of agarose（琼脂糖）
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琼脂糖凝胶特点：
1、没有共价键的交联。 2、孔径依赖于琼脂糖的浓度。 3、琼脂糖凝胶的化学稳定性较差。 4、非特异性吸附力低。 5、分离范围大。 6、颗粒强度差。
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厂家：Amersham Pharmacia Biotech安玛西亚公司
体积排阻层析介质 葡聚糖凝胶G10 葡聚糖凝胶G15 葡聚糖凝胶G25 葡聚糖凝胶G50 葡聚糖凝胶G75 分离范围 （球蛋白） <700 <1500 1000-5000 1500-30,000 3000-80,000 分离范围 （葡聚糖） <700 <1500 100-4,000 500-9,000 1,000-50,000 相应产品
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3、凝胶装柱
①将层析柱垂直装载支架上， 将下端输液管夹紧；
②向柱中加入约1/3体积的0.9 ％NaCl溶液； ③将一细玻棒伸入柱内，靠近 管内壁，顺着玻棒缓慢的向管内 加入混匀的凝胶溶液； ④凝胶加至层析柱顶端约3cm 时，打开柱下端输液开关，使流 速控制在0.25-0.5ml/cm2·min。 ④连续缓慢地加凝胶直到稳定 在离管口约5cm处。 39
→多用于凝胶渗透色谱（GPC）中
商品为Styrogel
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2）聚丙烯酰胺凝胶 商品名为生物凝胶-P（Bio-Gel P）。
CH2=CH C=O NH CH2 NH C=O CH2=CH N,N’-亚甲基双丙烯酰胺
CH2=CH
C=O NH2
丙烯酰胺
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聚丙烯酰胺凝胶
聚 丙 烯 酰 胺 凝 胶 的 部 分 结 构
8.1 凝胶色谱
Size Exclusion/Excluding Chromatography(SEC)
Gel Filtration Chromatography(GFC)
Gel Penetration Chromatography(GPC)
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8.1.1、凝胶色谱原理
以各种具有网状结构的凝胶颗粒为固定相，根据流动 相中所含各组分的分子大小不同而达到物质分离目的的一 种色谱技术。
①将称好的干粉倾入过量的 洗脱液中，室温下充分溶胀。注意 不要过分搅拌，以防颗粒破碎。为 了缩短溶胀时间，可在沸水浴中加 热溶胀3-5小时，这样还可以杀死细 菌和霉菌，并排除凝胶内气泡。 ②为了保证流速稳定，获得 较好的实验结果，使用前用倾泻法 倾去不易沉下的较细颗粒，使凝胶 颗粒大小一致。
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2.柱层析系统的安装
• 大、中、小三类分子彼此间较易分开，但每种凝胶分离范围之 外的分子，在不改变凝胶种类的情况下是很难分离的。 • 化学结构不同但相对分子质量相近的物质，不可能通过凝胶色 谱法达到完全的分离纯化的目的。
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• 根据分离的对象是水溶性的化合物还是有机溶剂可溶物，又
可分为凝胶过滤色谱（GFC）和凝胶渗透色谱（GPC）。 • GFC一般用于分离水溶性的大分子，如多糖类化合物。凝胶 的代表是葡聚糖系列，洗脱溶剂主要是水。 • GPC主要用于分离测定有 机溶剂中可溶的高聚物(聚苯乙烯、 聚氯已烯、聚乙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等)的分子量和分子量
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Superdex (高交联葡聚糖)
Fig. 15. Structure of Superdex. Dextran chains are covalently linked to a highly cross-linked agarose matrix. 厂家：Amersham Pharmacia Biotech安玛西亚公司
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琼脂糖的商品名称有: Sepharose(瑞典) Bio-gel A(美国) Segavac(英国) Gelarose(丹麦)
瑞典的商品名称为Sepharose，有3种型号，即 Sepharose 2B，4B和6B（同中国相同）。阿拉伯数 字表示凝胶中干胶的百分含量。
美国的为Bio－GA，有6个型号，即Bio-G 0.5M，
分布，常用的凝胶为聚苯乙烯凝胶，洗脱溶剂为四氢呋喃等
有机溶剂。
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8.1.2、凝胶色谱理论
Vt ：柱床总体积 Vo：柱床内凝胶颗粒外面空隙之间的水相容积 Vi：即凝胶颗粒内部所含水相的容积 Vg：干凝胶颗粒体积 Vi =g（干凝胶质量）×Wr（凝胶单位吸水量） Vt＝Vo十Vi十Vg
5ห้องสมุดไป่ตู้
Vo、Vi、Vt的测定
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Table 6. Properties of Sepharose
应用最广，机械强度较低，不能高压灭菌
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架桥琼脂糖凝胶（Sepharose CL）
• 架桥琼脂糖凝胶为琼脂线性 分子经1，3-二溴丙醇交联 的凝胶。 • 它的凝胶孔径均匀，机械强 度明显加大。 • 对热和化学物质的稳定性大 大 增 加 , 在 pH3-14 范 围 内 稳 定。
Sephadex G50 的溶胀率为500%30%。
（4）凝胶粒径：
一般为球形，其粒径大小对分离度有重要影响。 粒径越小，分离效率越高。
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8.1.3、凝胶色谱介质
• SEC介质的要求
• 基于凝胶过滤层析的原理，对其介质的最基本要求： 不能与原料组分发生除排阻外的任何其他相互作用， 如电荷作用、化学作用、生物学作用等
• 理想的凝胶过滤介质具有高物理强度及化学稳定性， 能够耐受高温高压、强酸强碱、高化学惰性、颗粒 大小均一度高的珠状颗粒。
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凝胶色谱介质
• 可分为合成树脂以及多糖类衍生物两类
1）苯乙烯、丙烯酰胺、聚乙烯醇→打开不饱合键而发生共
聚作用
2）单糖间通过糖苷键发生缩聚→多糖如纤维素、葡聚糖、
琼脂糖等
• →聚合大都仅能得到线性聚合物，小分子量时可溶于
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4、样品上柱及洗脱 ①加样量的控制
分析：1-2ml/100ml床体积， 制备：10-30ml/100ml床体积
②洗脱液的选择：洗脱液应与浸泡
凝胶时所用的溶液一致，否则由于更 换溶剂，凝胶体积会发生变化而影响 分离效果。
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凝胶粒度的大小对分离效果的影响
细粒凝胶柱流速低，但洗脱峰窄，分辨率高，多用于精制分 离或分析等。
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Superose (高交联琼脂糖)
• Superose is composed of highly cross-linked（高度交 联） porous rigid agarose beads.
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常用的商品化凝胶介质
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粗粒凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，多用于粗制 分离，脱盐等。
凝胶粒度与洗脱效果的关系图 同一流速下不同粒度的Sephadex G-25柱
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将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋 白质与盐类，称作类分离或组分离。 将分子量相差不大的大分子物质加以分离， 如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级 分离。
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a．类分离