第十四章基因重组与基因工程第14章基因重组与基因工程
合集下载
第七版生物化学_第14章基因工程
5´ 3´
5´ 3´
3´
5´
5´
3´
DNA
连接酶 3´
5´
5´
拼 接
片 段
3´
重
重
组
组
5´ 3´
5´3´
体
体
3´ 5´
3´ 内切酶
5´
(ruvC)
3´ 5´
5´ 3´
3´
5´
5´
3´
DNA
5´
连接酶
3´ 5´
3´
3´
53´´
5´
E.coli同源重组分子机制：
需数十种酶参与，其中最关键的是：RecA蛋白、 RecBCD复合物及RuvC蛋白。 RecA蛋白是由rec基因编码的，可结合单链DNA， 形成RecA—ssDNA复合物。 RecA蛋白具有多个DNA 结合位点，因此线性RecA—ssDNA复合物可以通过插 入同源的DNA双螺旋的大沟，形成三链DNA中间物， 并通过旋转逐渐取代双螺旋DNA中的一条链，与互补 链配对，将同源链置换出来，产生新的双链DNA分子， 从而完成DNA重组。
通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细 胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，称为转 化作用 (transformation)。
例如：当细菌破裂溶解（溶菌）时，其裂解 的DNA片断可被另一细菌作为外源DNA摄取，并 重组整合进自己的基因组，随细菌基因一起复制、 转录、翻译，使受体菌获得新的遗传表型。
目录
2.倒位重组及后果： 以hix为特异重组位点，在倒位酶作用下，两个hix 之间的H片段进行特异位点重组(倒位)。其结果是 H2和rH1基因不表达，因为没有了启动子。但远方 的H1基因因没有阻遏蛋白的抑制而得以表达。所以， 倒位重组的后果是表达H1鞭毛蛋白而不表达H2鞭毛 蛋白。因此，沙门氏菌的位相是由于它的两种鞭毛 蛋白质H1和H2的交迭表达。在某一时期，菌体表达 其中的一种，但从不表达两种。
14章基因重组与基因工程
载 体 的 选 择 标 准
常用载体：质粒DNA、噬菌体DNA、病毒DNA 粘粒(柯斯质粒）、细菌/酵母人工染色体
克隆载体(cloning vector)：
为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设计的载体。 表达载体(expression vector)： 为使插入的外源 DNA 序列可转录翻译成多肽链而 特意设计的 载体。 在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如 启动子、RBS、终止子等）。
（三）目的基因（又称外源DNA）
• 基因组DNA：
在真核生物体，基因组是指一套完整单倍体DNA
（染色体DNA）和线粒体DNA的全部序列。
• cDNA：
经反转录合成的、与RNA（mRNA或病毒RNA）互补的
单链DNA。。
（四）基因载体
为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义
的蛋白质所采用的一些DNA分子。
重组DNA分子 的获得
重组DNA分子 的扩增（克隆）
目的 :
1、获得大量某一感兴趣的基因或DNA序列
2、获得感兴趣基因的表达产物(蛋白质)
基因工程---- 实现基因克隆所采用的方法
及相关的工作称基因工程,
又称重组DNA工艺学。
生物技术工程:
基因工程、蛋白质工程、 酶工程、细胞工程等
（二） 工具酶
接合作用
转化作用
第二节
重组DNA技术
--DNA克隆，分子克隆
1972年，伯格首次证明可以用两种不 同物种的基因来人工合成DNA分子. 因在核酸的生化领域完成的重大研究 获得了1980年的诺贝尔化学奖。
加州大学旧金山分校的赫伯特· 博耶和斯坦福大学的斯坦 利· 科恩公布了他们的重组试验。他们使用的是大肠杆菌 中具有抗四环素功能的pSC101质粒，通过在这个质粒中嵌 入能够抗卡那霉素的基因，含有该质粒的大肠杆菌就可以 在同时加入了四环素和卡那霉素的培养基中生存繁殖。
生物化学第十四章-基因重组和基因工程
第十四章基因重组和基因工程一、自然界的基因转移和重组：基因重组(gene recombination)是指DNA片段在细胞内、细胞间，甚至在不同物种之间进行交换，交换后的片段仍然具有复制和表达的功能。
1．接合作用：当细胞与细胞相互接触时，DNA分子即从一个细胞向另一个细胞转移，这种遗传物质的转移方式称为接合作用（conjugation）。
2．转化和转染：由外来DNA引起生物体遗传性状改变的过程称为转化(transformation)。
噬菌体常常可感染细菌并将其DNA注入细菌体内，也可引起细菌遗传性状的改变。
通过感染方式将外来DNA引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染(transfection)。
转染是转化的一种特殊形式。
3．整合和转导:外来DNA侵入宿主细胞，并与宿主细胞DNA进行重组，成为宿主细胞DNA的一部分，这一过程称为整合。
整合在宿主细胞染色体DNA中的外来DNA，可以被切离出来，同时也可带走一部分的宿主DNA，这一过程称为转导(transduction)。
来源于宿主DNA的基因称为转导基因。
4．转座：转座又称为转位（transposition），是指DNA的片段或基因从基因组的一个位置转移到另一个位置的现象。
这些能够在基因组中自由游动的DNA片段包括插入序列和转座子两种类型。
⑴插入序列：典型的插入序列（insertion sequence，IS）是长750-1500bp的DNA片段，由两个分离的反向重复序列和一个转座酶基因。
当转座酶基因表达时，即可引起该序列的转座。
其转座方式主要有保守性转座和复制性转座。
⑵转座子：转座子(transposons)是可从一个染色体位点转移到另一个位点的分散的重复序列，含两个反向重复序列、一个转座酶基因和其他基因（如抗生素抗性基因）。
免疫球蛋白重链基因由一组可变区基因（VH）和一组恒定区基因（CH）构成，通过这些基因的选择性转座和重组，就可以转录表达出各种各样的免疫球蛋白重链，以对付不同的抗原。
生物化学教案：第十四章 基因重组与基因工程
4、转座重组
转座子(transposon, Tn)
1950年麦克林托克(McClintock)在对玉米籽粒颜色遗传进行观察时所发现。转座子在移位过程中，导致DNA链的断裂/重接，或是某些基因启动/关闭。
（1）原核细胞转座子
其原型是E.coli的IS(insertion sequence,插入序列)，一个细菌细胞常带少于10个IS序列。IS两端存在着反向重复序列IR(inverted repeat)，IR长短不一。IS本身没有任何表型效应，只携带和它转座作用有关的基因，称转座酶基因。
1、同源重组的概念和机制。
最基本的DNA重组方式，同源重组是指发生在同源序列间的重组，它通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换，又称基因重组。
2、细菌的基因转移与重组
接合作用、转化作用、转化作用。
3、特异位点重组
λ噬菌体DNA的整合，细菌的特异位点重组，免疫球蛋白的基因重排。
B．人工接尾法：即同聚物加尾连接法。当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断，无法得到相同得粘性末端时，可采用此方法。此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的基因的3'-端，如载体上添加一段polyG，则可在目的基因上添加一段polyC，故二者即可通过碱基互补进行粘合，再由DNA连接酶连接。
授课章节
第三篇 基因信息传递·第十四章 基因重组与基因工程
授课对象
2007级本科
临床专业1、2、3班
学时
4
时间
2008.11.24/30
授课地点
5315、5506、2301教室
教材
《生物化学》·第六版·人民卫生出版社
转座子(transposon, Tn)
1950年麦克林托克(McClintock)在对玉米籽粒颜色遗传进行观察时所发现。转座子在移位过程中，导致DNA链的断裂/重接，或是某些基因启动/关闭。
（1）原核细胞转座子
其原型是E.coli的IS(insertion sequence,插入序列)，一个细菌细胞常带少于10个IS序列。IS两端存在着反向重复序列IR(inverted repeat)，IR长短不一。IS本身没有任何表型效应，只携带和它转座作用有关的基因，称转座酶基因。
1、同源重组的概念和机制。
最基本的DNA重组方式，同源重组是指发生在同源序列间的重组，它通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列间进行单链或双链片段的交换，又称基因重组。
2、细菌的基因转移与重组
接合作用、转化作用、转化作用。
3、特异位点重组
λ噬菌体DNA的整合，细菌的特异位点重组，免疫球蛋白的基因重排。
B．人工接尾法：即同聚物加尾连接法。当载体和目的基因无法采用同一种限制酶进行切断，无法得到相同得粘性末端时，可采用此方法。此法首先使用单链核酸酶将粘性末端切平，再在末端核苷酸转移酶的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于载体或目的基因的3'-端，如载体上添加一段polyG，则可在目的基因上添加一段polyC，故二者即可通过碱基互补进行粘合，再由DNA连接酶连接。
授课章节
第三篇 基因信息传递·第十四章 基因重组与基因工程
授课对象
2007级本科
临床专业1、2、3班
学时
4
时间
2008.11.24/30
授课地点
5315、5506、2301教室
教材
《生物化学》·第六版·人民卫生出版社
14第十四章 基因重组与基因工程
重组DNA技术学 recombination DNA Technology
自然界不同物种或个体之间的基因重组和 基因转移是经常发生的，它是基因变异和 物种演变、进化的基础。 人类进行基因克隆、动物克隆以及基因治 疗等科学实验和实践中所进行的基因操作 也离不开基因转移和重组。 重组DNA技术就是基于人们对自然界的基 因转移和重组的认识发展起来的。
基因重组有多种方式。
DNA重组 重组
同源重组 (homologous recombination) 接合作用 (conjugation) 转化作用 (transformation) 转导作用 (transduction) 位点特异的重组(site-specific recombination) 位点特异的重组 转 座 (transposition)
一、同源重组
发生在同源序列间的重组称为 同 源 重 组 (homologous recombination)， ， 又称基本重组。 又称基本重组。 基本重组 是最基本的DNA重组方式 ， 重组方式 是最基本的 通过链的断裂和再连接， 通过链的断裂和再连接，在两 个 DNA分子同源序列间进行 分子同源序列间进行 单链或双链片段的交换。 单链或双链片段的交换。
一、重组DNA技术相关概念 重组DNA技术相关概念
（一） DNA克隆 克隆 克隆(clone) 克隆
来自同一始祖的相同 副本或拷贝的集合。 副本或拷贝的集合。
“克隆” 在生物学领域不同层次的含义
（1）分子克隆(molecular clone) 、 DNA克隆、 基因克隆：
将某一特定DNA片段通过重组DNA技术插入到一个 载体中，然后在宿主细胞中进行自我复制所得到的 大量完全相同的该DNA片段的“群体”。
基因重组与基因工程概述
同源序列愈长，同源重组率愈高，反之，则 不易发生重组。
同源重组意义
同源重组发生在任何生物中。 细菌如果通过接合或转化获得的外源
DNA与宿主DNA充分同源，那末外源 DNA就可以整合进宿主的染色体。 同源重组也是DNA损伤修复的重要机制
Electron micrograph of a Holliday Junction
溶原状态
cI基因
结合协同 cro基因
溶菌状态
cI基因
cro基因
思考：当含噬菌体的细菌用紫外线轻度 照射后，cI蛋白被降解,接下去会发生什
么？停止照射后会怎样？为什么会进化 成这种机制？
二、同源重组 （homologous recombination）
概念
不需要特异DNA序列，而是依赖两分子之间 序列的相同或相似性而进行的重组。
重组体DNA，分别为：
片段重组体(patch recombinant)
拼接重组体(splice recombinant)
片段重组体 （见模型图右边产物）：
切开的链与原来断裂的是同一条链，重组 体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本 DNA。
片 5´ 段 3´ 重 组 体 53´´
3´ 5´
3´ 5´
基因移动和重组是生物界普遍现象， 是生物进化的动力，DNA重组具有 重要的生物学意义
DNA重组的类型
细菌的基因转移与重组
接合(conjugation) 转化(tranformation)
转导(transduction)
同源重组（homologous recombination）
位点特异性重组 （site-specific recombination）
第十四章
同源重组意义
同源重组发生在任何生物中。 细菌如果通过接合或转化获得的外源
DNA与宿主DNA充分同源，那末外源 DNA就可以整合进宿主的染色体。 同源重组也是DNA损伤修复的重要机制
Electron micrograph of a Holliday Junction
溶原状态
cI基因
结合协同 cro基因
溶菌状态
cI基因
cro基因
思考：当含噬菌体的细菌用紫外线轻度 照射后，cI蛋白被降解,接下去会发生什
么？停止照射后会怎样？为什么会进化 成这种机制？
二、同源重组 （homologous recombination）
概念
不需要特异DNA序列，而是依赖两分子之间 序列的相同或相似性而进行的重组。
重组体DNA，分别为：
片段重组体(patch recombinant)
拼接重组体(splice recombinant)
片段重组体 （见模型图右边产物）：
切开的链与原来断裂的是同一条链，重组 体含有一段异源双链区，其两侧来自同一亲本 DNA。
片 5´ 段 3´ 重 组 体 53´´
3´ 5´
3´ 5´
基因移动和重组是生物界普遍现象， 是生物进化的动力，DNA重组具有 重要的生物学意义
DNA重组的类型
细菌的基因转移与重组
接合(conjugation) 转化(tranformation)
转导(transduction)
同源重组（homologous recombination）
位点特异性重组 （site-specific recombination）
第十四章
第十四章 基因重组与基因工程
安徽医科大学基础医学院生物化学教案
教材名称：授课对象：编写时间：授课日期：教学内容：普通高等教育“十五”规划教材《生物化学》第六版五年制心理、护理、妇幼、卫生等专业（理论54学时）
学年/学期：
年级/班级：
基因重组与基因工程
【教学目的与要求】
掌握：1. 基本概念：同源重组、基因工程。
2. 基因工程的基本过程。
熟悉：重组DNA技术的基本思路。
了解：重组DNA技术与医学的关系。
【本课内容学习指导】
重点：1. 重组DNA技术的相关概念。
2. 基因工程中常用的工具酶及载体。
3. 重组DNA技术基本原理。
难点：1. 基因重组。
2. 重组DNA技术基本原理。
进展：1. 克隆基因的表达。
2. 重组DNA技术的应用。
【教学方法】
多媒体教学为主，采用讲授式、启发式进行教学。
【教学时间分配】
3学时。
其中DNA的重组1学时，重组DNA技术2学时。
【自学内容与要点】
自学内容：重组DNA技术与医学的关系。
要点：重组DNA技术对生物学发展的作用。
【课后小结】
1. 自然界基因重组现象及意义。
2. 基因工程的概念。
3. 常用工具酶及载体。
4. 重组DNA技术的基本过程。
2010-第14章基因重组和基因工程 PPT课件
目录
Promega
Polylinker
MCS: multiple cloning site
目录
真 核 表 达 载 体 示 例
Invitrogen
目录
噬菌体 载体
目录
粘性质粒(cosmid) 酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒）
目录
内
容
一、自然界DNA重组和基因转移 二、重组DNA技术 三、重组DNA技术与 医学
目录
常用的工具酶
限制性核酸内切酶
逆转录酶 T4DNA连接酶
目录
限制性核酸内切酶(restriction endonuclease,
RE)是识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其
周围切割双链DNA的一类内切酶。
二、重组DNA技术基本原理
目录
基 因 克 隆 过 程 示 意 图
目录
以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程
（一）目的基因的获取
1. 化学合成法 2. 基因组DNA(genomic DNA library酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)
HindⅡ Bam HⅠ
GTCGAC CAGCTG
GGATCC CCTAGG
GTC GAC CAG + CTG
G + GATCC G CCTAG
目录
目录
DNA连接酶(DNA ligase)
5’
O
3’
基因重组与基因工程综述(ppt 15页)
第十四章 基因重组与基因工程
Chapter 14 gene recombination and genetic engineering
基因重组与基因工程
基因重组(gene recombination)是指DNA片段在 细胞内、细胞间，甚至在不同物种之间进行交 换，交换后的片段仍然具有复制和表达的功能。 基因工程(genetic engineering）是指采用人工 方法将不同来源的DNA进行重组，并将重组后 的DNA引入宿主细胞中进行增殖或表达的过程。
二、转化和转染
➢噬菌体常常可感染细菌并将其DNA注入细菌 体内，也可引起细菌遗传性状的改变。
➢通过感染方式将外来DNA引入宿主细胞，并 导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染 (transfection)。
➢转染是转化的一种特殊形式。
三、整合和转导
➢外来DNA侵入宿主细胞，并与宿主细 胞DNA进行重组，成为宿主细胞DNA 的一部分，这一过程称为整合。
区 一
基 组
因恒（定V区H
） 基
和 因
（CH）构成。
o 通过这些基因的
选择性转座和重
组，就可以转录
表达出各种各样
的免疫球蛋白重
链，以对付不同
的抗原。
五、基因重组的方式
➢常见的基因重组方式有：
➢（一）位点特异性重组：在整合酶的催化 下，两段DNA序列的特异的位点处发生整 合并共价连接，称为位点特异性重组。
➢（二）同源重组： 发生在同源DNA序列之 间的重组称为同源重组(homologous recombination)。这种重组方式要求两段 DNA序列类似，并在特定的重组蛋白或酶 的作用下完成。
1、只要有坚强的意志力，就自然而然地会有能耐、机灵和知识。2、你们应该培养对自己，对自己的力量的信心，百这种信心是靠克服障碍，培养意志和锻炼意志而获得的。 3、坚强的信念能赢得强者的心，并使他们变得更坚强。4、天行健，君子以自强不息。5、有百折不挠的信念的所支持的人的意志，比那些似乎是无敌的物质力量有更强大 的威力。6、永远没有人力可以击退一个坚决强毅的希望。7、意大利有一句谚语：对一个歌手的要求，首先是嗓子、嗓子和嗓子……我现在按照这一公式拙劣地摹仿为：对 一个要成为不负于高尔基所声称的那种“人”的要求，首先是意志、意志和意志。8、执着追求并从中得到最大快乐的人，才是成功者。9、三军可夺帅也，匹夫不可夺志也。 10、发现者，尤其是一个初出茅庐的年轻发现者，需要勇气才能无视他人的冷漠和怀疑，才能坚持自己发现的意志，并把研究继续下去。11、我的本质不是我的意志的结果， 相反，我的意志是我的本质的结果，因为我先有存在，后有意志，存在可以没有意志，但是没有存在就没有意志。12、公共的利益，人类的福利，可以使可憎的工作变为可 贵，只有开明人士才能知道克服困难所需要的热忱。13、立志用功如种树然，方其根芽，犹未有干；及其有干，尚未有枝；枝而后叶，叶而后花。14、意志的出现不是对愿 望的否定，而是把愿望合并和提升到一个更高的意识水平上。15、无论是美女的歌声，还是鬓狗的狂吠，无论是鳄鱼的眼泪，还是恶狼的嚎叫，都不会使我动摇。16、即使 遇到了不幸的灾难，已经开始了的事情决不放弃。17、最可怕的敌人，就是没有坚强的信念。18、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下 去。19、意志若是屈从，不论程度如何，它都帮助了暴力。20、有了坚定的意志，就等于给双脚添了一对翅膀。21、意志坚强，就会战胜恶运。22、只有刚强的人，才有神 圣的意志，凡是战斗的人，才能取得胜利。23、卓越的人的一大优点是：在不利和艰难的遭遇里百折不挠。24、疼痛的强度，同自然赋于人类的意志和刚度成正比。25、能 够岿然不动，坚持正见，度过难关的人是不多的。26、钢是在烈火和急剧冷却里锻炼出来的，所以才能坚硬和什么也不怕。我们的一代也是这样的在斗争中和可怕的考验中 锻炼出来的，学习了不在生活面前屈服。27、只要持续地努力，不懈地奋斗，就没有征服不了的东西。28、立志不坚，终不济事。29、功崇惟志，业广惟勤。30、一个崇高 的目标，只要不渝地追求，就会居为壮举；在它纯洁的目光里，一切美德必将胜利。31、书不记，熟读可记；义不精，细思可精；惟有志不立，直是无着力处。32、您得相 信，有志者事竟成。古人告诫说：“天国是努力进入的”。只有当勉为其难地一步步向它走去的时候，才必须勉为其难地一步步走下去，才必须勉为其难地去达到它。33、 告诉你使我达到目标的奥秘吧，我唯一的力量就是我的坚持精神。34、成大事不在于力量的大小，而在于能坚持多久。35、一个人所能做的就是做出好榜样，要有勇气在风 言风语的社会中坚定地高举伦理的信念。36、即使在把眼睛盯着大地的时候，那超群的目光仍然保持着凝视太阳的能力。37、你既然期望辉煌伟大的一生，那么就应该从今 天起，以毫不动摇的决心和坚定不移的信念，凭自己的智慧和毅力，去创造你和人类的快乐。38、一个有决心的人，将会找到他的道路。39、在希望与失望的决斗中，如果 你用勇气与坚决的双手紧握着，胜利必属于希望。40、富贵不能淫，贫贱不能移，威武不能屈。41、生活的道路一旦选定，就要勇敢地走到底，决不回头。42、生命里最重 要的事情是要有个远大的目标，并借助才能与坚持来完成它。43、事业常成于坚忍，毁于急躁。我在沙漠中曾亲眼看见，匆忙的旅人落在从容的后边；疾驰的骏马落在后头， 缓步的骆驼继续向前。44、有志者事竟成。45、穷且益坚，不坠青云之志。46、意志目标不在自然中存在，而在生命中蕴藏。47、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。 48、思想的形成，首先是意志的形成。49、谁有历经千辛万苦的意志，谁就能达到任何目的。50、不作什么决定的意志不是现实的意志；无性格的人从来不做出决定。我终 生的等待，换不来你刹那的凝眸。最美的不是下雨天，是曾与你躲过雨的屋檐。征服畏惧、建立自信的最快最确实的方法，就是去做你害怕的事，直到你获得成功的经验。 真正的爱，应该超越生命的长度、心灵的宽度、灵魂的深度。生活真象这杯浓酒，不经三番五次的提炼呵，就不会这样可口！人格的完善是本，财富的确立是末能力可以慢 慢锻炼，经验可以慢慢积累，热情不可以没有。不管什么东西，总是觉得，别人的比自己的好！只有经历过地狱般的折磨，才有征服天堂的力量。只有流过血的手指才能弹 出世间的绝唱。对时间的价值没有没有深切认识的人，决不会坚韧勤勉。第一个青春是上帝给的；第二个的青春是靠自己努力的。不要因为寂寞而恋爱，孤独是为了幸福而 等待。每天清晨，当我睁开眼睛，我告诉自己：我今天快乐或是不快乐，并非由我所遭遇的事情造成的，而应该取决于我自己。我可以自己选择事情的发展方向。��
Chapter 14 gene recombination and genetic engineering
基因重组与基因工程
基因重组(gene recombination)是指DNA片段在 细胞内、细胞间，甚至在不同物种之间进行交 换，交换后的片段仍然具有复制和表达的功能。 基因工程(genetic engineering）是指采用人工 方法将不同来源的DNA进行重组，并将重组后 的DNA引入宿主细胞中进行增殖或表达的过程。
二、转化和转染
➢噬菌体常常可感染细菌并将其DNA注入细菌 体内，也可引起细菌遗传性状的改变。
➢通过感染方式将外来DNA引入宿主细胞，并 导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染 (transfection)。
➢转染是转化的一种特殊形式。
三、整合和转导
➢外来DNA侵入宿主细胞，并与宿主细 胞DNA进行重组，成为宿主细胞DNA 的一部分，这一过程称为整合。
区 一
基 组
因恒（定V区H
） 基
和 因
（CH）构成。
o 通过这些基因的
选择性转座和重
组，就可以转录
表达出各种各样
的免疫球蛋白重
链，以对付不同
的抗原。
五、基因重组的方式
➢常见的基因重组方式有：
➢（一）位点特异性重组：在整合酶的催化 下，两段DNA序列的特异的位点处发生整 合并共价连接，称为位点特异性重组。
➢（二）同源重组： 发生在同源DNA序列之 间的重组称为同源重组(homologous recombination)。这种重组方式要求两段 DNA序列类似，并在特定的重组蛋白或酶 的作用下完成。
1、只要有坚强的意志力，就自然而然地会有能耐、机灵和知识。2、你们应该培养对自己，对自己的力量的信心，百这种信心是靠克服障碍，培养意志和锻炼意志而获得的。 3、坚强的信念能赢得强者的心，并使他们变得更坚强。4、天行健，君子以自强不息。5、有百折不挠的信念的所支持的人的意志，比那些似乎是无敌的物质力量有更强大 的威力。6、永远没有人力可以击退一个坚决强毅的希望。7、意大利有一句谚语：对一个歌手的要求，首先是嗓子、嗓子和嗓子……我现在按照这一公式拙劣地摹仿为：对 一个要成为不负于高尔基所声称的那种“人”的要求，首先是意志、意志和意志。8、执着追求并从中得到最大快乐的人，才是成功者。9、三军可夺帅也，匹夫不可夺志也。 10、发现者，尤其是一个初出茅庐的年轻发现者，需要勇气才能无视他人的冷漠和怀疑，才能坚持自己发现的意志，并把研究继续下去。11、我的本质不是我的意志的结果， 相反，我的意志是我的本质的结果，因为我先有存在，后有意志，存在可以没有意志，但是没有存在就没有意志。12、公共的利益，人类的福利，可以使可憎的工作变为可 贵，只有开明人士才能知道克服困难所需要的热忱。13、立志用功如种树然，方其根芽，犹未有干；及其有干，尚未有枝；枝而后叶，叶而后花。14、意志的出现不是对愿 望的否定，而是把愿望合并和提升到一个更高的意识水平上。15、无论是美女的歌声，还是鬓狗的狂吠，无论是鳄鱼的眼泪，还是恶狼的嚎叫，都不会使我动摇。16、即使 遇到了不幸的灾难，已经开始了的事情决不放弃。17、最可怕的敌人，就是没有坚强的信念。18、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下 去。19、意志若是屈从，不论程度如何，它都帮助了暴力。20、有了坚定的意志，就等于给双脚添了一对翅膀。21、意志坚强，就会战胜恶运。22、只有刚强的人，才有神 圣的意志，凡是战斗的人，才能取得胜利。23、卓越的人的一大优点是：在不利和艰难的遭遇里百折不挠。24、疼痛的强度，同自然赋于人类的意志和刚度成正比。25、能 够岿然不动，坚持正见，度过难关的人是不多的。26、钢是在烈火和急剧冷却里锻炼出来的，所以才能坚硬和什么也不怕。我们的一代也是这样的在斗争中和可怕的考验中 锻炼出来的，学习了不在生活面前屈服。27、只要持续地努力，不懈地奋斗，就没有征服不了的东西。28、立志不坚，终不济事。29、功崇惟志，业广惟勤。30、一个崇高 的目标，只要不渝地追求，就会居为壮举；在它纯洁的目光里，一切美德必将胜利。31、书不记，熟读可记；义不精，细思可精；惟有志不立，直是无着力处。32、您得相 信，有志者事竟成。古人告诫说：“天国是努力进入的”。只有当勉为其难地一步步向它走去的时候，才必须勉为其难地一步步走下去，才必须勉为其难地去达到它。33、 告诉你使我达到目标的奥秘吧，我唯一的力量就是我的坚持精神。34、成大事不在于力量的大小，而在于能坚持多久。35、一个人所能做的就是做出好榜样，要有勇气在风 言风语的社会中坚定地高举伦理的信念。36、即使在把眼睛盯着大地的时候，那超群的目光仍然保持着凝视太阳的能力。37、你既然期望辉煌伟大的一生，那么就应该从今 天起，以毫不动摇的决心和坚定不移的信念，凭自己的智慧和毅力，去创造你和人类的快乐。38、一个有决心的人，将会找到他的道路。39、在希望与失望的决斗中，如果 你用勇气与坚决的双手紧握着，胜利必属于希望。40、富贵不能淫，贫贱不能移，威武不能屈。41、生活的道路一旦选定，就要勇敢地走到底，决不回头。42、生命里最重 要的事情是要有个远大的目标，并借助才能与坚持来完成它。43、事业常成于坚忍，毁于急躁。我在沙漠中曾亲眼看见，匆忙的旅人落在从容的后边；疾驰的骏马落在后头， 缓步的骆驼继续向前。44、有志者事竟成。45、穷且益坚，不坠青云之志。46、意志目标不在自然中存在，而在生命中蕴藏。47、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。 48、思想的形成，首先是意志的形成。49、谁有历经千辛万苦的意志，谁就能达到任何目的。50、不作什么决定的意志不是现实的意志；无性格的人从来不做出决定。我终 生的等待，换不来你刹那的凝眸。最美的不是下雨天，是曾与你躲过雨的屋檐。征服畏惧、建立自信的最快最确实的方法，就是去做你害怕的事，直到你获得成功的经验。 真正的爱，应该超越生命的长度、心灵的宽度、灵魂的深度。生活真象这杯浓酒，不经三番五次的提炼呵，就不会这样可口！人格的完善是本，财富的确立是末能力可以慢 慢锻炼，经验可以慢慢积累，热情不可以没有。不管什么东西，总是觉得，别人的比自己的好！只有经历过地狱般的折磨，才有征服天堂的力量。只有流过血的手指才能弹 出世间的绝唱。对时间的价值没有没有深切认识的人，决不会坚韧勤勉。第一个青春是上帝给的；第二个的青春是靠自己努力的。不要因为寂寞而恋爱，孤独是为了幸福而 等待。每天清晨，当我睁开眼睛，我告诉自己：我今天快乐或是不快乐，并非由我所遭遇的事情造成的，而应该取决于我自己。我可以自己选择事情的发展方向。��
第14章 基因重组和基因工程
2. 分子生物学的技术进步
限制性内切酶等工具酶的发现 载体的发现和构建
3. 分子生物学的发展要求
基因的结构和序列 基因功能和调节 新DNA分子的构建
二. 面临新挑战 解决新问题
1. 基因的结构 2. 基因的功能 3. 基因表达调节 4. 基因工程产品 5. 构建新基因
三. 相关的基本概念
1. 克隆 2. 目的基因 3. 载体 4. 工具酶 5. 宿主细胞
1. 能识别和切割DNA双链内部特异 核苷酸序列的一类核酸内切酶。
2. 核酸内切酶是原核细胞识别和破 坏外源DNA分子的初级免疫形式。
3. 原核细胞具有限制性/甲基化系统， 通过甲基化保护自身的DNA不被 破坏
②. 限制性内切酶分类
1. 限制性内切酶可分为三类：Ⅰ 类，Ⅱ类和Ⅲ类。
2. 基因重组技术中使用的是Ⅱ类。 3. Ⅱ类限制性内切酶的酶切位点
2. 黏性末端可分为 5’突出黏性 末端和 3’突出黏性末端
限制性核酸内切酶作用后产生两种末端：
钝性末端(blunt end) 粘性末端(sticky end)
H in dIII
B am HI
GTCGAC GGATCC CAGCTGCCTAGG
GT+G CAC CAC GTG
G +GATCC CCTAGG
T4-DNA连接酶
pGEX-mApo CⅡ
pUC18质粒 pUC18 质粒
小鼠肝组织总RNA的提取
SmaⅠ
RT-PCR
ApoCⅡ
EcoRⅠ
T4-DNA连接酶
EcoRⅠ
附图1 pUC18-mApoCⅡ克隆策略
pUC18-mApoCⅡ
pGEX.3X质粒 4952bp
限制性内切酶等工具酶的发现 载体的发现和构建
3. 分子生物学的发展要求
基因的结构和序列 基因功能和调节 新DNA分子的构建
二. 面临新挑战 解决新问题
1. 基因的结构 2. 基因的功能 3. 基因表达调节 4. 基因工程产品 5. 构建新基因
三. 相关的基本概念
1. 克隆 2. 目的基因 3. 载体 4. 工具酶 5. 宿主细胞
1. 能识别和切割DNA双链内部特异 核苷酸序列的一类核酸内切酶。
2. 核酸内切酶是原核细胞识别和破 坏外源DNA分子的初级免疫形式。
3. 原核细胞具有限制性/甲基化系统， 通过甲基化保护自身的DNA不被 破坏
②. 限制性内切酶分类
1. 限制性内切酶可分为三类：Ⅰ 类，Ⅱ类和Ⅲ类。
2. 基因重组技术中使用的是Ⅱ类。 3. Ⅱ类限制性内切酶的酶切位点
2. 黏性末端可分为 5’突出黏性 末端和 3’突出黏性末端
限制性核酸内切酶作用后产生两种末端：
钝性末端(blunt end) 粘性末端(sticky end)
H in dIII
B am HI
GTCGAC GGATCC CAGCTGCCTAGG
GT+G CAC CAC GTG
G +GATCC CCTAGG
T4-DNA连接酶
pGEX-mApo CⅡ
pUC18质粒 pUC18 质粒
小鼠肝组织总RNA的提取
SmaⅠ
RT-PCR
ApoCⅡ
EcoRⅠ
T4-DNA连接酶
EcoRⅠ
附图1 pUC18-mApoCⅡ克隆策略
pUC18-mApoCⅡ
pGEX.3X质粒 4952bp
第十四章基因重组与基因工程2
的筛选和鉴定； • 有克隆位点（外源DNA插入点），常具
有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； • 分子量小，以容纳较大的外源DNA。
第十四章基因重组与基因工程2
（三）外源基因与载体的连接
第十四章基因重组与基因工程2
1、粘性末端连接： • 同一限制酶切割位点连接 • 配伍末端连接
第十四章基因重组与基因工程2
第十四章基因重组与基因工程2
（五）重组体的筛选
1、直接选择： 抗药性标记选择
插入失活法 标志补救 分子杂交法：
原位杂交、Southern印迹
第十四章基因重组与基因工程2
第十四章基因重组与基因工程2
原 位 杂 交
第十四章基因重组与基因工程2
2、非直接选择法： 免疫学方法：如免疫化学方法 酶免检测法
指一套完整单倍体DNA（染色体DNA） 和线粒体DNA的全部序列。
第十四章基因重组与基因工程2
（四）基因载体（克隆载体）：为携带目 的基因，实现其无性繁殖或表达有意义 的蛋白质所采用的一些DNA分子。
常用载体：质粒DNA、噬菌体DNA、病 毒DNA
第十四章基因重组与基因工程2
克隆载体(cloning vector)：为使插入的外 源DNA序列被扩增而特意设计的载体。 表达载体(expression vector)：为使插入的 外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意 设计的载体。
组织或培养细胞 mRNA
载体
cDNA
cDNA与载体连接基因工程2
（二）克隆载体的选择 常用载体：质粒DNA、噬菌体DNA、病 毒DNA
第十四章基因重组与基因工程2
载体的选择标准： • 能自主复制； • 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体
（三）转导作用(transduction)：当病毒从被 感染的（供体）细胞释放出来、再次感染 另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与 受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为 转导作用。
有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； • 分子量小，以容纳较大的外源DNA。
第十四章基因重组与基因工程2
（三）外源基因与载体的连接
第十四章基因重组与基因工程2
1、粘性末端连接： • 同一限制酶切割位点连接 • 配伍末端连接
第十四章基因重组与基因工程2
第十四章基因重组与基因工程2
（五）重组体的筛选
1、直接选择： 抗药性标记选择
插入失活法 标志补救 分子杂交法：
原位杂交、Southern印迹
第十四章基因重组与基因工程2
第十四章基因重组与基因工程2
原 位 杂 交
第十四章基因重组与基因工程2
2、非直接选择法： 免疫学方法：如免疫化学方法 酶免检测法
指一套完整单倍体DNA（染色体DNA） 和线粒体DNA的全部序列。
第十四章基因重组与基因工程2
（四）基因载体（克隆载体）：为携带目 的基因，实现其无性繁殖或表达有意义 的蛋白质所采用的一些DNA分子。
常用载体：质粒DNA、噬菌体DNA、病 毒DNA
第十四章基因重组与基因工程2
克隆载体(cloning vector)：为使插入的外 源DNA序列被扩增而特意设计的载体。 表达载体(expression vector)：为使插入的 外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意 设计的载体。
组织或培养细胞 mRNA
载体
cDNA
cDNA与载体连接基因工程2
（二）克隆载体的选择 常用载体：质粒DNA、噬菌体DNA、病 毒DNA
第十四章基因重组与基因工程2
载体的选择标准： • 能自主复制； • 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体
（三）转导作用(transduction)：当病毒从被 感染的（供体）细胞释放出来、再次感染 另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与 受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为 转导作用。
【VIP专享】14 基因工程和基因重组44
一、选择题 【A 型题】 1．下列 DNA 序列属于回文结构的是 （ ） A．ATGCCG
TACGGC B．GAATTC
CTTAAG C．GGCCGG
CCGGCC D．TCTGAC
AGACTG E．CTAGGG
GATCCC 2．DNA 经限制性内切核酸酶切割后，断端易于首尾相接，自行成环。这是因为存在着（ ）
重组 DNA 技术是在人们对自然界基因转移和重组的认识基础上创立的新技术。为研究基 基因就是 基因克隆或分子克隆，又称重组 DNA 技术。一个完整的基因克隆过程应包括：1．分，即目 的基因的获取及基因载体的选择。目的基因指科学家感兴趣的外源基因，其来源有几的携带者，常用的 载体有质粒、噬菌体等。2．切，即限制性核酸内切酶的应用。限制性内切酶是识别 DNA 的 特异序列，并在识别位点或其周围切割双链 DNA 的一类内切酶，是实现重组 DNA 技术的重要 的工具酶。3．接，即将目的基因与载体连接形成重组体（或重组 DNA）。4．转，即将重组 体导入宿主菌（或细胞），根据采用的载体性质不同，将重组体导入宿主菌的方法有转化、 转染及感染。5．筛，即重组体的筛选与鉴定，将重组体导入宿主菌后，通过适当形式的培 养板生长即可获得一定的抗药菌落。利用原位杂交，和 Southern 印迹或免疫学方法对抗药 菌落进行筛选，获得含目的基因的转化子菌落，再经扩增、分离重组 DNA 获得基因克隆。重 组 DNA 技术在疾病基因的发现，表达有药用价值的蛋白质，DNA 诊断及疾病的预防等方面具 有广泛应用价值，并促进了当代分子医学的诞生和发展。
第十四章 基因重组与基因工程
内容提要：
细菌的基因转移包括接合作用、转化作用、转导作用等。当细胞与细胞或细菌通过菌毛 相互接触时，质粒 DNA 从一个细胞转移至另一个细胞，这种类型的 DNA 转移称为接合作用。 通过自动获取或人为的供给外源 DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，这就是 转化作用。由病毒携带将宿主 DNA 片段从一个细胞转移至另一细胞的现象或机制，称为转导 作用。在接合、转化、转导或转座过程中，不同 DNA 分子间发生的共价连接即为重组。
TACGGC B．GAATTC
CTTAAG C．GGCCGG
CCGGCC D．TCTGAC
AGACTG E．CTAGGG
GATCCC 2．DNA 经限制性内切核酸酶切割后，断端易于首尾相接，自行成环。这是因为存在着（ ）
重组 DNA 技术是在人们对自然界基因转移和重组的认识基础上创立的新技术。为研究基 基因就是 基因克隆或分子克隆，又称重组 DNA 技术。一个完整的基因克隆过程应包括：1．分，即目 的基因的获取及基因载体的选择。目的基因指科学家感兴趣的外源基因，其来源有几的携带者，常用的 载体有质粒、噬菌体等。2．切，即限制性核酸内切酶的应用。限制性内切酶是识别 DNA 的 特异序列，并在识别位点或其周围切割双链 DNA 的一类内切酶，是实现重组 DNA 技术的重要 的工具酶。3．接，即将目的基因与载体连接形成重组体（或重组 DNA）。4．转，即将重组 体导入宿主菌（或细胞），根据采用的载体性质不同，将重组体导入宿主菌的方法有转化、 转染及感染。5．筛，即重组体的筛选与鉴定，将重组体导入宿主菌后，通过适当形式的培 养板生长即可获得一定的抗药菌落。利用原位杂交，和 Southern 印迹或免疫学方法对抗药 菌落进行筛选，获得含目的基因的转化子菌落，再经扩增、分离重组 DNA 获得基因克隆。重 组 DNA 技术在疾病基因的发现，表达有药用价值的蛋白质，DNA 诊断及疾病的预防等方面具 有广泛应用价值，并促进了当代分子医学的诞生和发展。
第十四章 基因重组与基因工程
内容提要：
细菌的基因转移包括接合作用、转化作用、转导作用等。当细胞与细胞或细菌通过菌毛 相互接触时，质粒 DNA 从一个细胞转移至另一个细胞，这种类型的 DNA 转移称为接合作用。 通过自动获取或人为的供给外源 DNA，使细胞或培养的受体细胞获得新的遗传表型，这就是 转化作用。由病毒携带将宿主 DNA 片段从一个细胞转移至另一细胞的现象或机制，称为转导 作用。在接合、转化、转导或转座过程中，不同 DNA 分子间发生的共价连接即为重组。
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
4、人工接头： 由平端加上新的酶切位点，再用限制酶
切除产生粘性末端，而进行粘端连接。
第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
（四）重组DNA导入受体菌：
受体菌条件: 安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷 处于感受态
第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
2、平端连接 适用于：限制性内切酶切割产生的平端 粘端补齐或切平形成的平端
3、同聚物加尾连接 由末端转移酶作用下，在DNA片段末端 加上同聚物序列、制造出粘性末端，再 进行粘端连接。
第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
第十四章基因重组与基 因工程第14章基因重组
与基因工程
2020/11/28
第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
第一节 DNA的重组 DNA Recombination
第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
一、同源重组
发生在同源序列间的重组称为同源重 组(homologous recombination)，又称基 本重组。是最基本的DNA重组方式，通 过链的断裂和再连接，在两个DNA分子 同源序列间进行单链或双链片段的交换。
第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
二、细菌的基因转移与重组
（一）接合作用(conjugation)：当细胞或 细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从 一个细胞(细菌)转移至另一细胞（细菌）, 这种类型的DNA转移称为接合作用。
二、重组DNA技术基本原理及步骤
1、目的基因的获取 2、基因载体的选择与构建 3、目的基因与载体的拼接 4、重组DNA分子导入受体细
胞 5、筛选并无性繁殖含重组分子
的受体分子（转化子） 第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
（一）目的基因的获取 1、化学合成法
要求：已知目的基因的核苷酸序列或)
第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
（三）转导作用(transduction)：当病毒从被 感染的（供体）细胞释放出来、再次感染 另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与 受体细胞之间的DNA转移及基因重组即为 转导作用。
第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
克隆载体(cloning vector)：为使插入的外 源DNA序列被扩增而特意设计的载体。 表达载体(expression vector)：为使插入的 外源DNA序列可转录翻译成多肽链而特意 设计的载体。
第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
质粒：细菌染色体外的环状双链DNA分子。
第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
可接合质粒，如 F 因子(F factor)
第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
（二）转化作用(transformation)：通过自 动获取或人为地供给外源DNA，使细胞 或培养的受体细胞获得新的遗传表型。
第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
组织或细胞染色体 DNA
限制性内切酶
基因片断
克隆载体
重组DNA分子 受体菌
含重组分子的转化菌基因组DNA： 存在于转化细胞内由 克隆载体所携带的所 有基因组DNA的集 合。
第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
小结
• 自然界基因转移伴发重组的形式有多种。 • 细菌的基因转移包括接合、转化、转导
作用等，在这些过程中不同DNA分子间 发生的共价连接即为重组。
第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
3rew
演讲完毕，谢谢听讲!
再见，see you again
2020/11/28
第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
的筛选和鉴定； • 有克隆位点（外源DNA插入点），常具
有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； • 分子量小，以容纳较大的外源DNA。
第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
（三）外源基因与载体的连接
第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
1、粘性末端连接： • 同一限制酶切割位点连接 • 配伍末端连接
限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA 的一类内切酶。
BamHⅠ
GGATCC CCTAGG
G CCTAG
+
GATCC G
第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
Ⅱ类酶识别序列特点—回文结 构
第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
指一套完整单倍体DNA（染色体DNA） 和线粒体DNA的全部序列。
第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
（四）基因载体（克隆载体）：为携带目 的基因，实现其无性繁殖或表达有意义 的蛋白质所采用的一些DNA分子。
常用载体：质粒DNA、噬菌体DNA、病 毒DNA
第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、
酶工程、细胞工程等
基因工程----实现基因克隆所采用的方法
及相关的工作称基因工程, 又称重组DNA工艺学。
目的 ：1、分离获得某一感兴趣的基因或DNA序
“分、切、接、转、筛”
第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
第三节 重组DNA技术与医学的关系
第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
（一）疾病基因的发现与克隆 （二）生物制药 （三）基因诊断 （四）基因治疗 （五）遗传病的预防
第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
列 2、获得感兴趣基因的表达产物(蛋白质)
第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
（二） 工具酶
• 限制性核酸内切酶 • DNA聚合酶I • 逆转录酶 • T4DNA 连接酶 • 碱性磷酸酶 • 末端转移酶 • Taq DNA聚合酶
第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
载体
cDNA
cDNA与载体连接基因工程第14章 基因重组与基因工程
（二）克隆载体的选择 常用载体：质粒DNA、噬菌体DNA、病 毒DNA
第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
载体的选择标准： • 能自主复制； • 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体
第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
导入方式：转化 (transformation) 转染 (transfection) 感染 (infection)
第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
（五）重组体的筛选
1、直接选择： 抗药性标记选择
插入失活法 标志补救 分子杂交法：
HindⅡ
GTCGAC CAGCTG
GTC CAG
+
GAC CTG
平端切口
BamHⅠ
GGATCC CCTAGG
G
+
CCTAG
GATCC G
粘端切口
第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
（三）目的基因（又称外源DNA） • cDNA：经反转录合成的、与RNA
（mRNA或病毒RNA）互补的单链DNA。 • 基因组DNA：在真核生物体，基因组是
原位杂交、Southern印迹
第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
原 位 杂 交
第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
2、非直接选择法： 免疫学方法：如免疫化学方法 酶免检测法
• 重组DNA技术简单概括为：
第十四章基因重组与基因工程第14章mRNA互补的DNA，再 复制成双链cDNA片段，与适第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
组织或培养细胞 mRNA
第二节 重组DNA技术
第十四章基因重组与基因工程第14章 基因重组与基因工程
一、重组DNA技术相关概念
（一）DNA克隆（也称基因克隆或重组 DNA）
应用酶学的方法, 在体外将各种来源的遗传 物质DNA与载体DNA接合成具有自我复制能 力的DNA分子，再通过转化或转染宿主细胞， 筛选出含有目的基因的转化子细胞，经扩增提 取获得大量同一DNA分子。