武定鸡 IFN-γ基因-316A／G SNP 对H5N1亚型高致病性禽流感灭活疫苗免疫效果的影响(论文)

Ｍ． ＤＮＡ 标准 ＤＬ ５ ０００ ； １ ～ ５． ＰＣＲ 产物 Ｍ． ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ ＤＬ ５ ０００ ；１ ５． ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ
图 １ ＩＦＮ γ 启动子基因的 ＰＣＲ 扩增
Ｆｉｇ． １ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＩＦＮ γ ｇｅｎｅ
２． ３ ＳＮＰ 测序鉴定 纯化 的 ＰＣＲ 产 物 经 测 序 后 ， 发 现 在 ＩＦＮ γ基 因 图 ２） ， 将测序所得序 ３ １ ６ 位出现 ３ 种 不 同 峰 图 （ 列与 ＧｅｎＢａｎｋ 中原鸡 ＩＦＮ ＮＣＢＩ： γ启动子区序列（ 进 行 比 对， 发 现 ＩＦＮ ＥＦ６９２４９５． １） ３１６ 位 点 γ基因 发生了 Ａ→ Ｇ 的点突变 。 测序图重叠 峰作 为 一个 杂
中图分类号 ： Ｓ８５２． ６５ ９． ５； Ｓ８５２． ４２ 文献标识码 ： Ａ 文章编号 ： １００７ ５０３８ （ ２０１ ５ ） ０４ ０００７ ０４
武定鸡原 产 于 云 南 省 楚 雄 彝 族 自 治 州 武 定 县 ， 为当地群众经长期闭锁选育而逐渐形成的优良地方 鸡品种
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行分析 ， 以期明确代表 ＨＰＡＩ 较强抗性的基因型 。
， 因体大 、 肉质鲜美 ， 素有 “ 武定壮鸡 ” 之美
１ 材料与方法
１． １ 材料 １． １． １ 试验 用 动 物 云 南 农 业 大 学 实 验 鸡 场 自 行 孵化的同日龄武定鸡 １００ 只 。 宝生物 １． １． ２ 主 要 试 剂 ＤＮＡ Ｍａｋｅｒ ＤＬ ５ ０００ ， 工程 （ 大 连） 有 限 公 司 产 品； 重 组 ＨＰＡＩ 灭 活 疫 苗 （ ， 乾元浩生 物 股 份 有 限 公 司 郑 州 制 Ｈ５Ｎ１ ， Ｒｅ ５ 株） 药厂 产 品 ； Ｈ５ 亚 型 禽 流 感 病 毒 血 凝 抑 制 试 验 抗 原 ， 哈尔 滨 维 科 生 物 技 术 有 限 公 司 产 品 ； 血 液／细 胞／组 织基因组 ＤＮＡ 提取 试 剂 盒 、 小 量 琼 脂 糖 凝 胶 ＤＮＡ 回收试剂盒 ， 北京庄盟国际生物基 因 科技有 限 公 司 ； 北京全式金生 物 技术 有 ＥａｓｙＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ， 限公司产品 。 １． ２ 方法 １． ２． １ 试 验 动 物 处 理 试 验 鸡 隔 离 饲 养 至 ３５ 日 龄， 从翅下静脉以负压采血管采集 抗 凝外周 全 血 ， 低 速离心分离并 分 别 保 存 血 细 胞 和 血 浆 ， 血细胞用于 提取 基 因 组 ＤＮＡ， 血 浆 用 于 检 测 ＨＰＡＩＶ 母 源 抗 体 。 确认母 源 抗 体 均 为 阴 性 后 ， １００ 只 鸡 全 部 接 种
（ 云南农业大学动物科学技术学院学院 ， 云南昆明 ６５０２０１ ； 楚雄州动物疫病预防控制中心 ， 云南楚雄 ６７５０００ ） １． ２．
为探讨 γ 干扰素 （ ） 基因 ／ ＩＦＮ ３ １ ６Ａ Ｇ ＳＮＰ 对云南地方鸡品种武定鸡接种 Ｈ５Ｎ１ 亚型 高 致 病 摘 要 ： γ 性禽流感 （ 灭 活 疫 苗 效 果 的 影 响， 随 机 选 取 １００ 只 同 日 龄 母 源 抗 体 阴 性 的 武 定 鸡 ， 应 用 ＰＣＲ 结 合 ＨＰＡＩ） ／ 同时应用血凝抑制试验 （ 测定免疫 前和 再 次免 疫 ＤＮＡ 测序确定其 ＩＦＮ ３ １ ６Ａ Ｇ ＳＮＰ 分布状况 ， ＨＩ） γ 基因 后血浆特异抗体水平 ， 随后采用卡方检验总样本基因型频率是否处于 Ｈａｒｄｙ 并采 用 最小 二 Ｗｅｉｎｂｅｒｇ 平衡 ， 乘分析检查基因型组间抗体水平差异 。 结果 发 现 ， 该 试 验 样 本 符 合 Ｈａｒｄｙ ， 并且 Ｗｅｉｎｂｅｒｇ 平 衡 （ Ｐ ＞ ０． ０５ ） 存在随着 Ａ 取 代 Ｇ 抗 体 水 平 呈 逐 渐 升 高 的 趋 势 ， 即 与 ＧＧ 基 因 型 （ 相 比， ｎ＝ ２０ ， ７． ９０ ± ０． ３４３ ） ＡＧ 基 因 型 （ 的抗体水平升高不显著 （ ， 但 ＡＡ 基 因 型 （ 的抗体水平 ｎ＝５ ６ ， ８． ６２±０． ２０５ ） Ｐ ＞ ０． ０５ ） ｎ＝ ２４ ， ９． ０４±０． ３１３） 升高显著 （ 。 结果表明 ， ／ Ｐ ＝０． ０１ ５７ ＜ ０． ０５ ） ＩＦＮ ３ １ ６Ａ Ｇ ＳＮＰ 与 武 定 鸡 ＨＰＡＩ 特 异 性 抗 体 应 答 水 平 γ 基因 存在关联性 ， 这对培育 ＡＡ 基因型抗病品系和制定合理的 ＨＰＡＩ 免疫程序具有积极的指导意义 。 武定鸡 ； 高致病性禽流感疫苗 ； 单核苷酸多态性 关键词 ： γ 干扰素 ；
１１ １ ２］ 。由 合子即重叠峰代表一个位点的 ２ 个 核苷 酸 ［
于鸡为二倍体动物 ， 因 此 用 同 源 染 色 体 上 一 对 ＩＦＮ 等位基因中 ， 被用于转录的模版 单 链 上 同一 ＤＮＡ γ 位置 （ 的 碱 基 组 合 表 示 个 体 在 该 位 点 的 ＳＮＰ ３ １ ６） 基因型 ， 所以根据测序 结 果 将 ＳＮＰ 基 因 型 划 分 为 ３
６ ８］ 病原体的 易 感 性 有 关 ［ 。鉴于免疫应答水平可作 ９］ 为衡量抗病力 高 低 的 间 接 选 择 指 标 ［ ， 本试验拟通
过测定武 定 鸡 ＩＦＮ ／ ３ １ ６Ａ Ｇ ＳＮＰ 的 分 布 状 γ基因 况， 并对其基因 型 与 体 液 免 疫 应 答 水 平 的 关 联 性 进
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动物医学进展 ２０１ ５ 年 第 ３６ 卷 第 ４ 期 （ 总第 ２６２ 期 ）
重组 ＨＰＡＩＶ 灭活 疫 苗 ， ／羽 。 至 ５０ 日 龄 再 ０． ４ ｍＬ 次免疫 ， ７ ｄ 后按上述方法采集和处理抗凝外周血 。 １． ２． ２ 抗 体 效 价 测 定 采 集 ３ 只 ～ ４ 只 未 免 疫 健 康公鸡的抗凝全血 ， 经生理盐水洗涤后 ， 在沉淀红细 胞中加入生理盐水 ， 制成体积分数 为 １０ ｍＬ ／Ｌ 红 细 １ ０］ 用于血凝 及 血 凝 抑 制 试 验 ［ 。在测定抗原 胞悬液 ， 血凝效价 的 基 础 上 ， 依照《 高致病性禽流感诊断技 术》 （ ／ 测 定 ＨＩ 抗 体 效 价 。 即 取 ＧＢ Ｔ１８９３６ — ２００３ ） 待检鸡血浆 ２５ μＬ 于 ９６ 孔 Ｖ 型 底 塑 料 板 进 行 ２ 倍 连续稀释 ， 加 入 ２５ μＬ（ 的 病 毒 血 凝 抗 原， 室 ４ 单 位） 温静置 ３０ ｍｉｎ， 再加入等体积 １０ ｍＬ ／Ｌ 的红细胞悬 液混匀 ， 以充分抑制病毒血凝现 ２０ ｍｉｎ 后观察结果 ， 象发生的 最 高 稀 释 倍 数 所 对 应 的 ｌｏｇ２ 值 表 示 血 浆 并 以 大 于 或 等 于 ５ ｌｏｇ２ 判 定 为 血 浆 抗 ＨＩ 抗体效价 ， 体阳性 。 应 用 血 液／ １． ２． ３ 总 ＤＮＡ 提 取 取 血 细 胞 ３ μＬ， 细胞／组织基因组 ＤＮＡ 提取试剂盒提取总 ＤＮＡ， 并 置 －２０ ℃ 保存 。 １． ２． ４ ＰＣＲ 扩增 目 的 片 段 用 于 扩 增 ＩＦＮ γ启动 子的 上 游 引 物 和 下 游 引 物 序 列 分 别 为 ＧＴＡＡＧ 和 ＧＡＣＧＡＡ ＧＡＡＣＴＴＣＡＧＣＣＡ ＴＴＧ ＴＧＡＡＣＴ ［ １０ ］ ， 扩 增 产 物 大 小 预 计 。 ＴＣＡ ＴＣＴＧＣＣ ６６９ ｂｐ ＰＣＲ 反应 体 系 ： ／Ｌ １０ × ＥａｓｙＴａｑ ｂｕｆｆｅｒ ５ μ Ｌ， ２． ５ ｍｍｏｌ 上、 下游引物各 １ μ 模 板 ＤＮＡ ２ μ ｄＮＴＰ ４ μ Ｌ， Ｌ， Ｌ， 扩增 ＥａｓｙＴａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ １ μ Ｌ， ｄｄＨ２ Ｏ ３６ μ Ｌ； 参数为 ： ９４℃ ５ ｍｉｎ； ９４℃ １ ｍｉｎ， ５８ ℃ ４５ ｓ， ７２℃ ４５ ｓ， 最 后 ７２℃ １０ ｍｉｎ。 取 ５ μＬ 扩 增 产 物 在 ３２ 个循环 ； ／Ｌ 琼 脂 糖 凝 胶 上 １２０ Ｖ 电 泳 ２５ ｍｉｎ， 观察结 １０ ｇ 果。 １． ２． ５ ＳＮＰ 鉴 定 应 用 小 量 琼 脂 糖 凝 胶 ＤＮＡ 回 收试剂盒回收 ＰＣＲ 产物 ， 随后送华大基因公司进行 ＤＮＡ 测 序 。 根 据 基 因 ＧｅｎＢａｎｋ 收 录 的 参 考 序 列 ， 通过比对 ＤＮＡ 测 序 结 果 ， 观 察 ３１６ 位 是 否 出 现 套 峰， 以确定 ＳＮＰ 情况 。 １． ２． ６ 统 计 学 分 析 采 用 卡 方 检 验 ＩＦＮ γ基因 ／ 基 因 型 是 否 处 于 平 ３ １ ６Ａ Ｇ ＳＮＰ Ｈａｒｄｙ Ｗｅｉｎｂｅｒｇ 衡， 若 Ｐ ＞ ０． ０５ 表 明 所 用 样 本 处 于 遗 传 平 衡 状 态 。 采用 ＳＡＳ ／ＳＴＡＴ 软 件 ， 执行普通线性模型（ ＧＬＭ） 过程 ， 分析 ＳＮＰ 基因型与抗体效价的最小二 乘 均 值 （ 的相关性 。 ＧＬＭ 过程基于以下单因素统 ＬＳＭｅａｎ） 计模型 ： ｙ ｉｊ ＝ μ＋ＳＮＰｉ ＋ｅｉｊ ｙ ｉｊ 代表 ＳＮＰ 基因型为 ｉ 的武定鸡 ｊ 的观测值 ； ＳＮＰｉ 为 ＡＡ、 ＡＧ 或 ＧＧ 三 μ 为总抗体效价平均值 ； ［ ６］ 种 ＳＮＰ 基因型效应 ； ｅｉｊ 为随机效应 。
２ 结果
２． １ 疫苗免疫后试验鸡抗体检测结果 免疫前所有 血 浆 样 品 抗 体 检 测 结 果 为 阴 性 ， 可 排除母 源 抗 体 对 后 续 试 验 的 干 扰 。 经 ２ 次 免 疫 ， Ｈ５Ｎ１ 亚 型 禽 流 感 病 毒 抗 体 效 价 达 到 ６ｌｏｇ ２ ～ 均为阳性 ， 同时 表 明 不 同 个 体 之 间 存 在 抗 体 １ １ｌｏｇ ２ ， 应答水平的差异 。 ２． ２ ＩＦＮ γ 启动子区基因片段的扩增 应用设计的引物 ， 利用 ＰＣＲ 仪 扩 增 出 相应 的 片 段， 经 过 １０ ｇ ／Ｌ 琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 检 测 ， 扩增得到 图 １） 。 ６６９ ｂｐ 的目的片段 （
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。在证实鸡
ＩＦＮ γ的 存 在 和 成 功 克 隆 该 单 拷 贝 基 因 的 基 础 ， 有 学 者 进 一 步 研 究 发 现， 鸡 ＩＦＮ γ基因 ／ ３ １ ６Ａ Ｇ 单核苷酸多态性（ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙ 与鸡 对 肠 炎 沙 门 菌 、 新城疫病毒等 ｍｏｒｐｈｉｓｍ， ＳＮＰ）