关于内参基因的选择
qPCR 内参基因选择——【RT-PCR技术】
➢内参基因GAPDH
GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶，是糖酵解反应中的一个关键酶,为管家基因， 几乎在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般 是恒定的，且不受含有的部分识别位点、佛波脂等的诱导物质的影响而保持恒 定，被广泛用作内参。
➢内参基因GAPDH
内参基因GAPDH应用及注意事项
➢内参基因选择和使用
参考文献及网页：
1. 董恩妮, 梁青, 李利,等. 实时荧光定量PCR内参基因的选择[J]. 中国畜牧杂志, 2013, 49(11):92-96.
2. /article/news_detail-34321
3.Prasad N B, Somervell H, Tufano R P, et al. Identification of genes differentially expressed in benign versus malignant thyroid tumors[J]. Clinical Cancer Research, 2008, 14(11):3327-3337.
4. 肿瘤细胞一般不用GAPDH和β-actin作为mRNA表达内参，18S rRNA更适合肿瘤细胞 mRNA内参基因
5.此外，肝组织研究,发现UBC（泛素）和HMBS（胆色素原脱氨酶）对于肝组织的表达分 析是最佳mRNA内参；在白血病、正常、恶性肿瘤中比较β-actin、β2-MG和PBGD （胆色 素原脱氨酶），发现β2-MG最合适作为mRNA内参。PRKG1和TBP是适合于在B和T细胞及 其肿瘤中控制RNA的质量和产量。
➢内参基因的选择
1.内参基因选择标准
1).在组织和细胞中表达量相对较高 2).稳定表达于不同类型的细胞和组织 3).表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关 4).不受任何内源性或外源性因素的影响 5).不存在假基因，以避免基因组 DNA 的污染扩增
内参基因使用方法
内参基因使用方法
内参基因是在分子生物学和基因表达研究中常用的实验技术。
它是一种可以用作对比和标准化基因表达水平的参考基因。
以下是内参基因的使用方法。
首先，选择一个合适的内参基因。
内参基因应该具有以下特征：在不同样本中表达稳定，不受研究条件的影响，并且其表达水平与感兴趣的基因相对稳定。
常用的内参基因包括β-actin、GAPDH和18S rRNA等。
其次，设计合适的实验方案。
确定研究目的和实验条件，并选择适当的实验方法。
例如，可以使用实时定量PCR（qPCR）技术来测量内参基因和感兴趣的基因的表达水平。
接下来，实施实验。
收集样本，并提取RNA或DNA。
使用逆转录酶将RNA 转录成cDNA，然后用qPCR技术测量内参基因和感兴趣基因的表达水平。
在实验过程中，应该设置技术重复和生物重复来保证实验结果的可靠性。
最后，分析实验结果。
使用合适的统计方法对实验数据进行分析，比较不同样本中内参基因和感兴趣基因的表达水平。
根据实验结果，可以确定内参基因的表达水平，并将其用作标准化感兴趣基因的表达水平。
需要注意的是，在使用内参基因时，应该选择多个内参基因进行验证，以确保结果的可靠性。
此外，内参基因的选择应该根据研究对象和实验条件进行优化，并与其他研究结果进行比较。
总结一下，内参基因是基因表达研究中常用的参考基因。
通过选择合适的内参基因、设计合理的实验方案、实施实验和分析实验结果，可以准确使用内参基因来标准化和对比感兴趣基因的表达水平。
这种方法有助于我们更深入地了解基因的功能和调控机制。
LGGH内参基因的选择
拟使用软件：geNorm NormFinder BestKeeper
拟使用的内参基因：如3一磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)、肌动蛋白基因(actin)、微管蛋白基因ftubulin)、18S核糖体RNA(18SrRNA)、40S核糖体蛋白S3A(40S ribosomal protein S3A,WS21)、多聚泛素酶基因(ubiquitin)，β-肌动蛋白基因(β-actin)和α-微管蛋白基因（α-aubulin）、ldh（L-lactate dehydrogenase）、rpoB（DNA-directed RNA polymerase subunit beta）、gapdh (Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）、recA （Recombinase A）、16S rRNA （16S ribosomal RNA）。
实验数据：
1 总RNA的质量（电泳，浓度，纯度）总RNA的完整性通过2．5％琼脂糖凝胶电泳鉴定，电泳槽用O．5 M NaOH浸泡20 min去除RNase，去除DNA后进行PCR(40个循环)验证是否有DNA污染。
2 关系数(R2)、解链温度（Tm值）。
3 扩增效率（E）与标准曲线的斜率(slope)相关，计算方程式为：E=(10-I/slope-1)×100。
4 对pH、温度、盐含量、的响应。
内参基因_精品文档
内参基因摘要：内参基因是一类在基因表达研究中被广泛应用的基因，它们在细胞中的表达不受外界条件和实验干扰的影响，并在分析基因表达水平时被用作参照基因。
本文将介绍内参基因的定义、特点和选择方法，并讨论其在基因表达研究中的重要性和应用前景。
第一部分：引言内参基因是指在特定细胞或组织中表达稳定且没有明显变化的基因，它们的表达水平被广泛应用于基因表达研究的标准化和比较。
与实验条件和处理无关，内参基因在基因表达分析过程中能提供一个相对稳定的参照点，从而减小实验误差。
在过去的几十年中，内参基因已成为基因表达研究中不可或缺的重要因素。
第二部分：内参基因的特点1. 表达稳定性：内参基因的表达水平相对稳定，不受外界条件和实验干扰的影响。
这使得内参基因成为一个可靠的参照标准。
2. 丰度适中：内参基因的表达水平应适中，既不能太高，也不能太低。
如果表达水平过高，会导致内参基因的扩增曲线过早饱和，影响定量结果的准确性。
3. 表达均匀性：内参基因的表达在不同样本中应该是均匀的。
这意味着在不同组织或条件下，内参基因的表达水平不会发生明显的变化。
第三部分：内参基因的选择方法内参基因的选择是基因表达研究中的一个关键环节。
目前常用的方法包括基于文献综述、生物信息学分析和实验验证等。
以下是一些常用的内参基因选择方法：1. 综合评估：通过综合考虑内参基因的表达稳定性、丰度适中性和表达均匀性等因素，从候选基因中筛选出最适合的内参基因。
2. 基因表达稳定性分析：利用统计学方法，比较多个候选内参基因的表达数据，选取具有最小变异的基因作为内参基因。
3. 基因表达数据库：利用公开的基因表达数据库，比如GEO数据库和TCGA数据库，分析不同基因在不同样本中的表达水平，选择表达稳定的基因作为内参基因。
4. 实验验证：通过逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）或实时定量PCR等技术，验证候选基因的表达稳定性和适用性。
第四部分：内参基因的应用前景内参基因在基因表达研究中的应用前景广阔。
内参基因的选择及数据初步分析
三个内参基因在某些特定的实验条件下表达并不稳定 AtCBP20
AtUBC
AtACT2
（ https:///gv/plant.jsp ）
内参基因的评价
• 内参基因获得的途径
常规的内参基因：ACT，TUB，UBQ，18S-rRNA，
GAPDH等。
芯片数据：
Ruibo Hu，et al.， BMC Molecular Biology, 2009, 10(1)
实例分析
内参基因的评价
2. 候选内参基因的稳定性分析
M ≤0.15
Ruibo Hu，et al.， BMC Molecular Biology, 2009, 10(1)
实例分析
内参基因的评价
3. 多内参基因的评价体系优于单内参基因
1多内参基因的数据分析多内参基因sd的计算多内参基因的标准化目标基因sd的计算qpcr的数据分析及作图基因家族的作图将相对表达量做到一个表中拷贝到txt文件中gensisqpcr的数据分析及作图2gensis分析数据及作图1根据自己的实验条件对所选用的内参基因做稳定性评价
范成明
1
主要内容
内参基因的评价 qRT-PCR的引物设计及评价 qRT-PCR的数据分析
实例分析
qPCR引物的设计及评价
大豆的PHT1基因家族
实例分析
qPCR引物的设计及评价
1. 下载GmPHT1家族成员的转录序列；
对于没有UTR区的，用softberry （ FGENESH，/ ）预测，并将其做成 fasta格式的文件。
2. 用Bioedit做成本地数据库；
/life-science/molecular-biology/plant-biotechnology/plant-molecular-biology/control-primers-for-arabidopsis.html
植物实时荧光定量PCR内参基因的选择_胡瑞波
中国农业科技导报,2009,11(6):30-36Journa l o f Ag ricu ltura l Sc ience and T echno l ogy收稿日期:2009-03-25;修回日期:2009-10-28基金项目:国家863计划项目(2006AA10A111,2007AA10Z119);国家转基因重大专项(2008ZX0809-001);/十一五0国家科技支撑计划项目(2007BAD59B02)资助。
作者简介:胡瑞波,博士研究生,研究方向为植物发育分子生物学。
E-m ai:l rayhu@yahoo .cn 。
通讯作者:傅永福,研究员,主要研究方向为植物发育分子生物学。
Te:l 010-********;E -ma i :l f u f u19c n@163.co m植物实时荧光定量PCR 内参基因的选择胡瑞波, 范成明, 傅永福(中国农业科学院作物科学研究所,国家农作物基因资源与遗传改良重大科学工程,北京100081)摘 要:实时荧光定量RT-PCR (rea -l ti m e quantitati ve reverse transcripti on PCR,qRT-PCR )具有定量准确、灵敏度高和高通量等特点,已被广泛应用于基因的表达分析。
常规q RT-PCR 采用相对定量进行分析,其关键步骤是选择合适的稳定内参基因进行校正和标准化。
持家基因被广泛用作内参基因,但在所有生理条件下均稳定表达的理想内参基因并不存在。
大多数传统内参基因已不能满足qRT-PCR 准确定量的要求。
基于基因芯片表达数据和EST 数据库并结合qRT-PCR,可以筛选稳定性好的新的内参基因。
简要综述了植物qRT-PCR 内参基因的研究进展,并就内参基因的选择中应注意的问题进行了探讨。
关键词:实时荧光定量RT -PCR;内参基因;ge N o r m;基因表达中图分类号:Q 789 文献标识码:A 文章编号:1008-0864(2009)06-0030-07R eference G ene Selecti on i n P l ant R ea-l ti m e QuantitativeR everse Transcri pti on PCR (q RT -PCR )HU Ru-i bo ,FAN Cheng -m i n g ,F U Yong -fu(Instit u t e of C rop Science ,N ati on alKey Facilit y of C rop Gen e Res ou rce and Genetic I m prove m en t ,Ch i n ese Acade m y ofAgricultura lS ci en ces ,B eiji ng 100081,Ch i na)Abstract :R ea-l ti m e quantitati v e RT-PCR (q RT-PCR )techno l ogy ,w ith quantitati ve accuracy ,h i gh sens i tiv it y andhi gh -throughput character i sti cs ,has been w i de l y used in gene expression analysis .Based on t he re l a tive quan tita ti ve ana l ys i s ,q RT-PCR data must be norma li zed w ith one o r mo re proper and stab le i n ternal reference genes .H ouse -keepi ng genes are custo m ar il y used as endogenous references for re lati ve quan tificati on .But no t a si ng le g ene can act as a un i v ersal reference reported so far .M ost o f the trad iti ona l housekeepi ng genes a re unab le to ensure accurate norma li zati on i n q RT-PCR.Based on t he trem endous gene -chip expressi on da ta and public deposited EST data ,ne w reference genes w ith superior stab ilit y w ere selected and ver ifi ed w ith q RT-PCR.T he research progress of reference genes in plant q RT-PCR w as rev ie w ed and aspects t o be consi dered i n f u t ure reference gene se lecti on were a lso discussed .K ey words :rea-l ti m e quanti tati ve reverse transcr i pti on PCR;reference genes ;ge N o r m;gene expression实时荧光定量RT-PCR (rea-l ti m e quantitative reverse transcri p ti o n PCR,qRT-PC R )是在传统PCR 技术基础上发展起来的一种新的核酸定量技术,具有定量准确、灵敏度高、重复性好、高通量等特点,已被广泛应用于基因的表达分析[1,2]。
内参基因筛选方法
内参基因筛选方法
内参基因是指在细胞或组织中表达稳定、不受外部刺激影响、对于生物体正常生长发育至关重要的基因。
内参基因的表达量在分子生物学研究中常被用作参考，因为它们在不同样本中的表达量应该是相同的。
然而，在进行基因表达定量时，应选用适当的内参基因，否则可能会导致结果偏差。
因此，内参基因筛选方法是分子生物学研究中的重要步骤之一。
目前，内参基因的筛选方法主要包括三种：文献综述法、基因芯片法和实时荧光定量PCR法。
文献综述法是指通过文献调研，选择已有研究证实表达稳定、适合做内参基因的基因。
这种方法的优点是简单快捷，但缺点是容易出现结果偏差，因为不同实验条件下内参基因的选择可能不同。
基因芯片法是指利用基因芯片技术，同时检测多个基因的表达量，然后利用统计学方法筛选出表达稳定的内参基因。
这种方法的优点是高通量、准确性高，但缺点是成本较高，同时需要非常严格的数据分析方法。
实时荧光定量PCR法是指利用实时荧光定量PCR技术，同时检测多个基因的表达量，然后利用统计学方法筛选出表达稳定的内参基因。
这种方法的优点是准确性高、成本低，且操作简单。
缺点是只能同时检测有限数量的基因。
综上所述，内参基因筛选方法的选择应根据实验设计、设备条件等多个因素综合考虑。
无论采用何种方法，都应该进行严格的数据分
析和统计学处理，以确保得到准确、可靠的结果。
选择内参原则
选择内参基因的原则日期：2012-05-03来源：未知作者：周慕云点击：次相关专题PCR内参：选还是不选？我们在做PCR的时候经常会遇见一些问题，比如说目的基因条带没有P出来。
所以在试验中往往要用到一些在细胞内稳定表达的基因来作为参照，来使实验组的数据更有说服力，也更能快速的找到实验失败的问题所在。
做相对定量的real-time PCR遇到如下问题：实验组和对照组内参基因(如β-actin或GAPDH) 的CT不一致如何判断，这种不一致到底是由于初始cDNA拷贝数不一致导致的，还是由于内参基因受到处理因素影响，从而发生变化导致的?举个例子，A组为对照组大鼠，B、C、D组为实验组大鼠选用β-actin作为内参基因，进行预实验，A、B、C、D四个组各取3只老鼠的cDNA(同一组内3个生物学重复)，每个样本有三个复孔(3个操作平行)，计算β-actin CT值的均值，发现A、B、C、D四个组的CT值均值分别为16.2，18.2，17.5，17.8;我是应该换一个内参基因，使其在四组间CT均值保持一致?(万一换了还是不一致呢?)还是应该将CT低的样本的cDNA进行稀释，如将A组cDNA稀释100倍，这样理论上来说，其β-actin的Ct均值应该就增大了2;有高手说可以用多个看家基因结合的方法，来进行相对定量，但具体是怎么操作的呢?答：首先先要确定处理后不发生变化的内参基因。
可以搞个试剂盒，如takara的，有一系列的house keeping gene的primer，先做一次实验，比较这些内参基因中，哪些是不受你的处理因素影响的。
挑选合适的内参基因。
然后就是做下一步的实验了，你说是做相对定量，那么首先要做目的基因和内参基因的标准曲线，确定扩增效率是否一致，不一致的话，就考虑用双标准曲线法啦。
你说你的实验组和对照组内参基因(如β-actin或GAPDH) 的CT不一致，这个很正常啊，你最后的结果是要通过将目的基因和内参基因的比值来获得的。
福建柏实时荧光定量PCR内参基因的选择
DOI:10.13275/ki.lykxyj.2021.01.017福建柏实时荧光定量PCR 内参基因的选择周成城1，荣俊冬2，谢德金2，杨德明2，何天友1，郑郁善1,2*(1. 福建农林大学园林学院，福建 福州 350002；2. 福建农林大学林学院，福建 福州 350002)摘要：[目的]筛选稳定的内参基因，用于福建柏不同组织部位荧光定量PCR 分析。
[方法]基于福建柏转录组数据，以福建柏的根、皮和鳞叶为材料，设置5个浓度梯度（0.32、1.6、8、40、200 ng·μL −1）的各组织cDNA 混样作为模板，选择ACT7、UBQ 、EF2、CACs 、TIP41、UBC2b 、RH8、GAPDH 8个基因作为候选内参基因。
利用实时荧光定量PCR 技术并结合geNorm 、Normfinder 和 BestKeeper 等软件对候选内参基因的表达稳定性进行评价。
选择评价结果中较为稳定的候选基因作为内参基因，通过分析4个萜类合成酶基因（FhTPS1、FhTPS2、FhTPS3、FhTPS4）在福建柏不同组织部位的相对表达情况，对候选内参基因的稳定性进行验证。
[结果]geNorm 、Normfinder 和 BestKeeper 分析结果均表明: 不同质量浓度福建柏各组织cDNA 混合样品中，最稳定的内参基因是UBC2b 和ACT7。
荧光定量PCR 分析表明，候选内参基因ACT7和UBC2b 在福建柏不同组织部位中表达稳定。
4个目的基因的相对表达量在福建柏根、皮和鳞叶中均有所不同，FhTPS1基因在根中相对表达量最高，FhTPS2和FhTPS4在鳞叶中相对表达量最高，FhTPS3在皮中相对表达量最高。
[结论]8个候选内参基因中，ACT7与 UBC2b 稳定表达且不受cDNA 质量浓度变化影响，二者的组合能够实现稳定归一化并提高定量分析结果准确性，适合作为福建柏各组织部位荧光定量表达分析的理想内参基因。
相对定量中内参基因的引物
在相对定量中，内参基因的选择是非常关键的一步，因为它的表达量通常保持相对稳定，不会受到实验条件或因素变化的影响。
内参基因的选择通常取决于你的样本类型和实验设计。
通常可以选择β-actin、GAPDH、18S rRNA等作为内参基因。
对于内参基因的引物设计，需要注意以下几点：
1. 引物长度和GC含量：引物长度通常在18-27bp之间，GC含量在40%-60%之间。
过长或过短的引物可能导致引物自身折叠或与非特异性模板结合，影响扩增效率。
2. 引物碱基：避免使用嘌呤（A）嘧啶（T）单链互补序列，以减少引物二聚体形成和非特异性扩增。
同时，应避免使用三级结构中的特定碱基序列，以减少非特异性扩增。
3. 引物设计原则：引物设计时应该考虑退火温度，考虑上下游引物的最佳互补区域。
避免使用邻近的GC四联体，以防止形成引物二聚体，降低引物的特异性。
在靠近3'端的碱基处选择能提高PCR扩增效率的碱基。
同时考虑引物二级结构的形成，以免影响扩增效率。
至于具体的设计步骤，一般包括以下步骤：
1. 根据内参基因的序列信息设计一对特异性引物。
2. 优化引物的长度、GC含量、退火温度等参数，确保引物的特异性。
3. 进行引物特异性验证，可以使用不同来源的样品进行预实验，观察特异性扩增情况。
4. 根据实验需求和样品性质，调整引物浓度和其他实验参数，进行后续实验分析。
以上信息仅供参考，如需了解更多信息，请查阅相关文献资料或咨询专业人士。
医学实验内参的选择
实验内参，即是在检测细胞内分子表达变化时选择的参照物，其在细胞内的表达相对恒定，在处理因素作用条件下不会发生表达改变的基因。
内参同样可以校正上样量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。
1、管家基因最普通的内参是内源性参照基因，也就是管家基因（持家基因，house keeping gene）。
管家基因是一类始终保持着低水平的甲基化并且一直处于活性转录状态的基因，高度保守并且在大多数情况下持续表达。
其表达水平受环境因素影响较小，而且是在个体各个生长阶段的大多数，或几乎全部组织中持续表达，或变化很小，因此常存在于生物细胞核的常染色质中。
它的表达只受启动序列或启动子与RNA 聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制调节。
管家基因维持细胞最低限度功能所不可少的基因, 如编码组蛋白基因、编码核糖体蛋白基因、线粒体蛋白基因、糖酵解酶的基因等。
这类基因在所有类型的细胞中都进行表达，因为这些基因的产物对于维持细胞的基本结构和代谢功能是必不可少的。
部分人类管家基因列表2、内参基因选择的条件1、不存在假基因，以免基因组DNA的扩增；2、高度或中度表达，避免太高或太低的丰度；3、稳定表达于不同类型的细胞和组织中，表达量无明显差异；4、表达水平与细胞周期、活化等无关；5、不受外源性或内源性因素的影响。
3、不同管家基因在选择管家基因作为内参时，首先要按不同类型的分子选择正确的内参。
曾看到有人用检测miRNA时选择了GAPDH作为内参呢。
a、检测mRNA时的内参通常使用的是GAPDH、beta-actin、tubulinGAPHDGAPDH是糖酵解反应中的一个酶，由4个30－40kDa的亚基组成，分子量146kDa。
该酶基因为管家（house keeping）基因，几乎在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，且不受含有的部分识别位点、佛波脂等的诱导物质的影响而保持恒定，故被广泛用作抽提total RNA，poly(A)+ RNA，Western blot等实验操作的标准化的内参。
核质分离内参选择
核质分离内参选择
- β-actin（ACTB）：广泛使用的核内参基因，编码肌动蛋白，在多个细胞类型中表达稳定。
- 乙酰化酶B（GAPDH）：常用的核内参基因，编码糖酵解途径中的酶，在多种细胞类型和组织中表达稳定。
- 18S rRNA：核糖体RNA的一个组成部分，在核内丰度较高，通常用于评估细胞核RNA 的丰度。
- 28S rRNA：另一个核糖体RNA，与18S rRNA一起组成核糖体，也可用作核内参基因。
- TATA-box结合蛋白（TBP）：转录起始因子之一，参与基因转录的调控，在多个细胞类型中表达稳定。
请注意，核内参基因的选择应该基于你的实验设计和研究对象的特定需求。
在选择核内参基因时，最好进行验证，以确保在你的实验条件下，选定的核内参基因在不同样本和实验条件下的表达稳定性。
内参的选择原则
内参的选择原则
在选择内参时，需要遵循以下原则：
1.高度或中度表达：内参基因应该具有相对稳定的表达水平，这样可以减少实验误差。
2.表达稳定：内参基因的表达水平在不同时间和不同细胞中应保持相对稳定，不受外界条件的影响。
3.在不同条件下表达稳定：内参基因的表达水平应不受实验条件（如处理措施、细胞周期和细胞活化状态）的影响。
4.不同样本类型中选择不同的内参基因：根据样本类型选择合适的内参基因。
例如，对于哺乳动物组织，常用的内参基因包括β-actin、GAPDH、β-tubulin 和PCNA等；对于植物组织，常用的内参基因包括actin、Rubisco等。
5.注意内参基因的同源性：在选择内参基因时，需要考虑其与目标基因的同源性，以避免潜在的同源序列干扰。
6.确定内参基因的表达水平与目标基因相似：选择的内参基因的表达水平应该与目标基因相似，这样可以更好地反映目标基因的表达情况。
7.确定内参基因不受任何实验处理措施的影响：内参基因的表达水平应不受任何实验处理措施的影响，这样可以更好地反映实验处理对目标基因表达的影响。
总体来讲，选择合适的内参基因对于实验结果的准确性和可靠性至关重要。
因此，在实验设计阶段应该仔细考虑选择哪种内参基因，并遵循上述原则进行选择。
内参基因的选择
内参基因的选择关于内参基因的选择很多初级的实验人员很少会去思考这个问题，因为摆在面前的只有两种选择，β-actin和GAPDH，甚至在很多人长期的观念中对于内参的认知也仅仅停留在是一个表达量相对较高较稳定的看家基因，对于分子层面相对表达量的一个重要参照而已，至于为什么要选这两种，还有没有其他的内参，人们的回答往往是“Sorry，I don’t care.”或者“我的前辈就是这样用的，别的文献是这样写的，有问题吗？”。
有问题吗？BioTNT要在这里大声的疾呼“有，而且是很大的问题。
”当人们检测某个基因的表达降低或者提高得出结果以后，你并不知道是它本身的表达量发生变化，还是因为样本量大小或者操作导致RNA的损失等其他原因导致的表达量变化，所以这个时候需要同时检测另外的基因作为参照。
这另外的基因就是内参基因。
于是，从我们本身科学的要求来看，理想的内参就会有这样几个条件，1、表达量较大；2、稳定表达于不同类型的细胞和组织；3、表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关；4、不受任何内源性或外源性因素的影响；5、不存在假基因，以避免基因组DNA 的污染扩增。
请注意这是理想的内参，让我们来一个一个看看我们常见的经典内参是不是真的够理想呢？第一，是β-actin，即β肌动蛋白。
我们先要来看看actin是什么，所谓的actin肌动蛋白，是细胞的一种重要骨架蛋白，大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，包括α-skeletal （骨骼）、cardiac （心）、smooth （平滑）muscle actin和γ-smooth muscle actin，其余两种广泛分布于各种组织中，包括β-actin和γ-non-muscle actin。
这些不同的亚型组织分布是不一样的，在肌肉组织中的beta-actin分布就很少，心肌主要是α-cardiac muscle actin。
显而易见，如果我的研究模型是心或者是骨骼，β-actin作为内参显然就不合适。
染色质免疫共沉淀 内参基因
染色质免疫共沉淀内参基因染色质免疫共沉淀（ChIP）是用来研究蛋白质与染色质相互作用的一种实验技术，通过利用特异性抗体来富集与目标蛋白质结合的染色质片段。
然而，在进行ChIP实验时，需要使用内参基因来进行标准化和校正实验结果，以确保实验的准确性和可靠性。
内参基因是指在特定条件下表达稳定、不受外界因素干扰的基因。
在ChIP实验中，内参基因被用来标准化目标基因的富集水平，以消除实验中可能出现的误差。
下面将从内参基因选择、内参基因验证及常用内参基因几个方面来详细探讨。
一、内参基因选择选择适当的内参基因是进行ChIP实验的关键步骤之一。
一个理想的内参基因应具备以下特点：1. 稳定的表达水平：内参基因的表达水平应在不同样品、不同处理条件下保持稳定，不受干扰因素的影响。
这可以通过实时定量PCR （qPCR）或基因芯片技术来评估基因的表达稳定性。
2. 细胞类型特异性：内参基因的表达水平应在所研究的细胞类型中具有一定特异性，并且不受目标蛋白质结合与浓度的影响。
这可以通过在不同细胞类型中进行实时定量PCR检测来评估。
3. 控制组条件下表达水平不变：在ChIP实验中，常常需要对比不同样品或处理条件下的富集水平。
因此，内参基因的表达水平应在不同组别条件下保持相对稳定，以确保实验结果的可比较性。
根据以上的特点，常用的内参基因包括GAPDH、ACTB、GUSB等，这些基因的表达水平通常在不同细胞类型和处理条件下比较稳定，且与ChIP实验中的目标基因的结合无关。
二、内参基因验证为确保选择的内参基因在实验条件下满足稳定性和特异性等要求，进行内参基因验证是必要的。
验证内参基因的常用方法有：1. 实时定量PCR：通过实时定量PCR测定一系列候选内参基因的表达水平，根据表达的稳定性和特异性选择最合适的内参基因。
在实验中，可以根据ChIP-qPCR的结果及对应内参基因的表达情况，评估其在ChIP实验中的可靠性。
2. 基因芯片技术：利用基因芯片技术可以同时检测大量基因的表达水平，对于内参基因的选择具有更高的精确性和鉴定能力。
节旋藻实时荧光定量PCR内参基因选择论文
节旋藻实时荧光定量PCR内参基因的选择摘要:本实验利用实时荧光定量pcr对极大节选藻中16srrna、tef(翻译延伸因子,gtpases)、rpl13(核糖体蛋白)、psr(藻蓝蛋白β亚基)、cyp(亲环素家族)、gapdh(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、hsp(热休克蛋白)和rpod(rna聚合酶σ70 因子)八个候选基因在正常生长和持续光照条件下的稳定性进行了检测。
用genorm软件对实验数据进行处理,从中选出合适的内参基因。
结果表明rpl13和cyp38可以作为正常生长和持续光照处理下极大节选藻节律性研究通用的内参基因16srrna基因的稳定性要低于其他的候选内参基因,并不是一个合适的内参基因。
关键词:节旋藻内参基因实时荧光定量pcr genorm 生物节律中图分类号:q78 文献标识码:a 文章编号:1672-3791(2012)06(c)-0102-01用实时荧光定量pcr进行相对定量时,需选取在不同实验条件下表达恒定的基因作为内参对目标基因的表达量进行校正。
常用的内参基因有gapdh、β-actin、18srna、16srna、rpl13、cyclophilin 等,然而近年来的研究发现常用的内参基因存在一些缺陷。
revillion等[1]发现gapdh mrna在不同癌组织、不同个体间以及细胞周期的不同阶段变化较大。
18srrna和16srrna作为内参也遭到了质疑。
tricarico等[2]认为对于已纯化mrna中的目标基因进行定量时,rrna不能用于标准化;相对于大部分目标基因,rrna的表达量太高,不能真实的反映目标基因的降解情况。
1 材料与方法将节旋藻arthrospira fachb 438于zarrouk液体培养基中进行预培养至对数期。
培养条件为23℃恒温,光强30μmol·m-2·s-1,12l/12d培养。
藻液黑暗处理12h以达到同步化后,分别进行持续光照处理和正常培养。
关于内参基因的选择
关于内参基因的选择关于内参基因的选择实验内参，即是在检测细胞内分子表达变化时选择的参照物，其在细胞内的表达相对恒定，在处理因素作用条件下不会发生表达改变的基因。
内参同样可以校正上样量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。
1、管家基因最普通的内参是内源性参照基因，也就是管家基因（持家基因，house keeping gene）。
管家基因是一类始终保持着低水平的甲基化并且一直处于活性转录状态的基因，高度保守并且在大多数情况下持续表达。
其表达水平受环境因素影响较小，而且是在个体各个生长阶段的大多数，或几乎全部组织中持续表达，或变化很小，因此常存在于生物细胞核的常染色质中。
它的表达只受启动序列或启动子与RNA聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制调节。
管家基因维持细胞最低限度功能所不可少的基因, 如编码组蛋白基因、编码核糖体蛋白基因、线粒体蛋白基因、糖酵解酶的基因等。
这类基因在所有类型的细胞中都进行表达，因为这些基因的产物对于维持细胞的基本结构和代谢功能是必不可少的。
部分人类管家基因列表2、内参基因选择的条件1、不存在假基因，以免基因组DNA的扩增；2、高度或中度表达，避免太高或太低的丰度；3、稳定表达于不同类型的细胞和组织中，表达量无明显差异；4、表达水平与细胞周期、活化等无关；5、不受外源性或内源性因素的影响。
3、不同管家基因在选择管家基因作为内参时，首先要按不同类型的分子选择正确的内参。
曾看到有人用检测miRNA时选择了GAPDH作为内参呢。
a、检测mRNA时的内参通常使用的是GAPDH、beta-actin、tubulin•GAPHDGAPDHGAPDH是糖酵解反应中的一个酶，由4个30－40kDa的亚基组成，分子量146kDa。
该酶基因为管家（house keeping）基因，几乎在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，且不受含有的部分识别位点、佛波脂等的诱导物质的影响而保持恒定，故被广泛用作抽提total RNA，poly(A)+ RNA，Western blot等实验操作的标准化的内参。
内参基因选择相关软件-PPT
NormFinder 程序是用于选择合适内参基 因的工具，由 Claus 等 2004 年编写其运行 原理与 geNorm 程序类似，产生基因表达稳 定值,然后根据稳定值排序，最终将表达稳 定值最小的基因作为最稳定的基因。其缺点 是只能选择一适的内参基因作标准。而 geNorm 程序通过基因配对的形式,筛选出最 不稳定基因，然后将剩下基因重新排序重新 配对进行筛选，最终选出适当数目的合适基 因。
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geometric averaging of multiple internal control genes， 2002， Genome Biology
例如：
大家好
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大家好
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GeNorm计算公式
大家好
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大家好Hale Waihona Puke 10大家好11
BestKeeper是Michael等(2004)编写的针对 内参基因和目标基因进行选择的程序。 BestKeeper软件可以比较100个样品中10个内 参基因和10个目标基因的表达水平。具体操 作是把原始数据输入BestKeeper 软件的Excel 表格中，内参基因和目标基因进行单独分析。 BestKeeper程序在每个基因之间产生配对的 相关系数和BestKeeper指数（每个候选基因 Ct值的几何平均数），根据其值的大小进行 比较。其优点是不但可以分析内参基因的稳 定性，而且可以比较目标基因的表达水平。
想看家基因表达水平的比值在所有样本
中应当一致，表达水平比值变异度的增
加意味着看家基因表达稳定性的下降。
该程序将某一看家基因与其他看家基因
表达水平的两两比值经对数变换后，计
内参基因选择相关软件
参考文献：Determination of stable housekeeping genes, differentially
regulated target genes and sample integrity: BestKeeper–Excel-based tool
12
using pair-wise correlations， 2004， Biotechnology Letters
NormFinder 程序是用于选择合适内参基 因的工具，由 Claus 等 2004 年编写其运行 原理与 geNorm 程序类似，产生基因表达稳 定值,然后根据稳定值排序，最终将表达稳 定值最小的基因作为最稳定的基因。其缺点 是只能选择一适的内参基因作标准。而 geNorm 程序通过基因配对的形式,筛选出最 不稳定基因，然后将剩下基因重新排序重新 配对进行筛选，最终选出适当数目的合适基 因。
内参基因选择相关软件
1
相关软件
GeNorm程序 NormFinder 程序 BestKeeper 程序
获得最稳定的内参基因
2
GeNorm程序是Jo Vandesompele于 2002年编写的专门用qPCR方法选择内参基 因的程序。geNorm程序核心原理是：不同 实验条件或不同组织细胞中，2个理想看家 基因表达水平的比值在所有样本中应当一 致，表达水平比值变异度的增加意味着看 家基因表达稳定性的下降。该程序将某一 看家基因与其他看家基因表达水平的两两 比值经对数变换后，计算其平均标准差作 为基因表达稳定度的平均值M。对所有候 选看家基因的表达稳定度进行排序，看家 基因的M值越小，表示该看家基因的表达 越稳定。GeNorm程序可以用于筛选任何组 细胞的任意数量内参基因，选择出2个以上， 而不是传统地使用单一内参基因，有利于 系统偏差的校正，得到更可靠的相对定量 结果。另外geNorm程序可以利用对标准化 因子进行差异分析确定所需看家基因的最 适数目。
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关于内参基因的选择
实验内参，即是在检测细胞内分子表达变化时选择的参照物，其在细胞内的表达相对恒定，在处理因素作用条件下不会发生表达改变的基因。
内参同样可以校正上样量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。
1、管家基因
最普通的内参是内源性参照基因，也就是管家基因（持家基因，house keeping gene）。
管家基因是一类始终保持着低水平的甲基化并且一直处于活性转录状态的基因，高度保守并且在大多数情况下持续表达。
其表达水平受环境因素影响较小，而且是在个体各个生长阶段的大多数，或几乎全部组织中持续表达，或变化很小，因此常存在于生物细胞核的常染色质中。
它的表达只受启动序列或启动子与RNA 聚合酶相互作用的影响，而不受其他机制调节。
管家基因维持细胞最低限度功能所不可少的基因, 如编码组蛋白基因、编码核糖体蛋白基因、线粒体蛋白基因、糖酵解酶的基因等。
这类基因在所有类型的细胞中都进行表达，因为这些基因的产物对于维持细胞的基本结构和代谢功能是必不可少的。
2、内参基因选择的条件
1、不存在假基因，以免基因组DNA的扩增；
2、高度或中度表达，避免太高或太低的丰度；
3、稳定表达于不同类型的细胞和组织中，表达量无明显差异；
4、表达水平与细胞周期、活化等无关；
5、不受外源性或内源性因素的影响。
3、不同管家基因
在选择管家基因作为内参时，首先要按不同类型的分子选择正确的内参。
曾看到有人用检测miRNA时选择了GAPDH作为内参呢。
a、检测mRNA时的内参
通常使用的是GAPDH、beta-actin、tubulin
GAPHD
GAPDH
GAPDH是糖酵解反应中的一个酶，由4个30－40kDa的亚基组成，分子量
146kDa。
该酶基因为管家（house keeping）基因，几乎在所有组织中都高水平表达，在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，且不受含有的部分识别位点、佛波脂等的诱导物质的影响而保持恒定，故被广泛用作抽提total RNA，poly(A)+ RNA，Western blot等实验操作的标准化的内参。
beta-actin
β-Actin是PCR常用的内参，β-Actin抗体是Western Blot很好的内参指数。
β-Actin是横纹肌肌纤维中的一种主要蛋白质成分，也是肌肉细丝及细胞骨架微丝
的主要成分，具有收缩功能，分布广泛。
ACTB
另外，不同的组织来源的样本在选择内参时还有一定的区别。
比如一些少量特殊的情况下，如脂肪组织或细胞内，β-Actin的表达量就很少，不适合做内参。
tubulin
tubulin（微管蛋白）是球形分子，有两种类型：α微管蛋白(α-tubulin)和β微管蛋白(β-tubulin)，这两种微管蛋白具有相似的三维结构，能够紧密地结合成二聚体，作为微管组装的亚基。
α亚基由450个氨基酸组成，β亚基是由455个氨基
酸组成，它们的分子量约55 kDa。
tubulin
由于β-Tubulin的检测分子量大约在55kD，因此该内参抗体不是很适合用于检测50kD-60kD大小目标蛋白的WB实验中。
b、检测蛋白时的内参
检测蛋白时，常用蛋白内参有GAPDH、β-Actin、β-tubulin。
选择的内参要跟目标蛋白分子量差5KD以上，所以需要根据目标蛋白的分子量来进行内参的选择。
c、检测miRNA时的内参
small nuclear RNA (snRNA)和small nucleolar RNA (snoRNA)长度与miRNA 相近，200bp左右，在多种组织细胞中高表达，不涉及miRNA的调节途径，且与miRNA探针设计方法相同，所以snoRNA是很好的内参选择。
常用内参
简单介绍一下常用的内参U6：U6是一类snRNA，它是由RNA聚合酶III转录。
主要形成小核核糖核蛋白颗粒，定位与细胞核内，表达稳定。
检测lncRNA时，内参选择和mRNA一样，可以选择GAPDH、beta-actin等。
GAPDH虽然在很多细胞实验中都很稳定,但是因为它是个糖代谢相关酶,在很多糖代谢变化的实验中都会剧烈变化,比如缺氧、缺血、糖尿病以及某些肿瘤细胞中。
因此内参不是绝对的。
同样，beta-actin也不是绝对的，如果涉及到细胞骨架重排，解聚，重组的实验，beta-actin一样不可靠。
如果不确定，可以多选几个内参候选，找一个变化量小的。
最后，18S rRNA也可以作为lncRNA检测时的内参。
当然，还有其他的内参可以作为lncRNA检测的内参，如：RPL13A
e、检测circRNA时的内参
检测circRNA时可以用18S rRNA作为内参。
18S rRNA是一类核糖体RNA，所常用来进行生物分类的依据。
由于18SrRNA 在生物中的表达比较保守，所以目前也用来作为内参。
用18s RNA作为RT-PCR的内参，应该和β-actin是一个道理，半定量的目的是要看总RNA中的目的基因mRNA的表达量，内参的目的是去除一些系统误差。
有文献做过比较，之所以18s RNA比β-actin好是因为它含量丰富，且任何情况下稳定存在，所以受外界调控影响小，半定量时背景更加稳定。
但是不同的是18s是rRNA，没有A尾巴，所以选它作内参时，理论上总RNA转录时不能用OligodT作反转录引物，用随机引物或6聚体引
物,OligodT转录出来的可都是mRNA啊！如果选β-actin就不存在这个问题，因为它mRNA，有A尾巴。