内参基因选择相关软件
利用geNorm、NormFinder和BestKeeper软件进行内参基因稳定性分析的方法
摘 要 实时 荧光定 量 Ｐ Ｃ Ｒ （ Ｒ Ｔ — ｑ Ｐ Ｃ Ｒ） 由于具 备灵敏 度 高 、 重复性好 、 特 异性 强及 高通 量等 优点 ， 已经成 为研 究基 因表达 分析 的 常 用方 法， 但 其结 果 的准确 性 取 决于 内参基 因。 在任 何 试验 条件 下都 能 稳定 表达 的 内参 基 因几乎 不存 在 ， 科研 工作 者 为பைடு நூலகம்了获得精 准 的试 验 结果 ， 首先 必须从 众 多的 内参基 因 中 筛选 出稳 定 的 内参 基 因。 ｇ ｅ Ｎ ｏ ｒ ｍ、 Ｎ ｏ ｒ ｍ Ｆ ｉ ｎ ｄ ｅ ｒ 和Ｂ ｅ ｓ ｔ Ｋ ｅ ｅ ｐ ｅ ｒ 等 是 专 门用 于筛选稳 定性 内参基 因的软件 ， 但 这
农村 经 济学
现 代 农业科 技
２ ０ １ ７年 第 ５期
利用 ｇ ｅ Ｎ ｏ ｒ ｍ、 Ｎ ｏ ｒ ｍＦ ｉ ｎ ｄ ｅ ｒ 和Ｂ ｅ ｓ ｔ Ｋｅ ｅ ｐ ｅ ｒ 软件进行 内参基因稳定性 分 析 的方 法
吴建 阳 何 冰 ・ 杜 玉洁 ・ 李 伟才 魏 永赞
（ － 岭南师范学院基础教育学院 ， 广东 湛 江 ５ ２ ４ ０ ３ ７ ； 农 业 部热 带 果树 生 物 学 重 点 实 验 室 ， 中 国 热带 农 业 科 学 院 南 亚 热带 作物 研 究 所 ）
Ａｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ） ， Ｓ ｏ ｕ ｔ ｈ Ｓ ｕ ｂ ｔ ｒ ｏ ｐ ｉ ｃ ａ ｌ Ｃ ｒ ｏ ｐ ｓ Ｒｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈＩ ｎ ｓ ｔ ｉ ｔ ｕ ｔ ｅ， Ｃ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ Ａｃ ａ ｄ ｅ ｍｙｏ ｆ Ｔ ｒ ｏ ｐ ｉ ｃ ａ ｌ Ａｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｌ ａ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ｓ ） Ａｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ Ｒ ｅ ｌ— ａ ｔ ｉ ｍｅ ｌ ｆ ｕ ｏ ｒ ｅ ｓ ｃ ｅ ｎ ｔ ｑ ｕ ａ ｎ ｔ ｉ ｔ ａ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｐ Ｃ Ｒ ｔ ｅ ｃ ｈ ｎ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ （ Ｒ Ｔ — ｑ Ｐ Ｃ Ｒ） ｉ ｓ ｕ ｓ ｅ ｄ ｆ ｏ ｒ ｇ ｅ ｎ ｅ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ｉ ｏ ｎ ａ ｎ ｌｙ ａ ｓ ｉ ｓ ｗ ｉ ｔ ｈ ｈ ｉ ｇ ｈ ｓ ｅ ｎ ｓ ｉ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｙ， ｇ ｏ ｏ ｄ ｒ ｅ ｐ ｅ ａ —
geNorm操作说明
1. 打开geNorm, 点击第一个图标导入数据；
[eimg]45/26/293863_1295618193_417.jpg[/eimg]
2. 数据导入后的效果，每行代表一个样品，列是待选内参基因（当然越多越好，一般8个左右，也看样品，比如高盐处理，很多内参发生很大变化，这样就的多选一些）；
[eimg]a2/9a/293863_1295618186_126.jpg[/eimg]
3. 点击calculate后，每个基因的稳定性分别给出来了。
绿色是最稳定的，红色是最不稳定的；
[eimg]1c/3f/293863_1295618187_331.jpg[/eimg]
4. 选择最不稳定的，点删除，软件会重新计算剩下基因的稳定性；
[eimg]78/d7/293863_1295618189_429.jpg[/eimg]
5. 一般最后留下来3-4最稳定的内参基因，对后面Q-PCR结果分析有用的就是后面一列红色字体的“Normalisation Factor”
[eimg]78/d7/293863_1295618189_429.jpg[/eimg]。
qPCR 内参基因选择
7.Haas M J, Plazarte M, Chamseddin A, et al. Inhibition of hepatic apolipoprotein AI gene expression by histamine[J]. European journal of pharmacology, 2018, 823: 49-57.
乳腺癌转BPI基因研究中，qPCR选择了18S rRNA作内参，而Western blot选择了GAPDH为 内参
➢内参基因使用示例 文献3
材料： 1. 人结肠癌组织 2. 人正常结肠粘膜组织 3. EGFR敲除和野生小鼠
小鼠结肠癌表皮生长因子下调miRNA的研究中，qPCR和weatern都选择β-actin作为内参 基因
5. Xu H, Bionaz M, Sloboda D M, et al. The dilution effect and the importance of selecting the right internal control genes for RT-qPCR: a paradigmatic approach in fetal sheep[J]. Bmc Research Notes, 2015, 8(1):1-15.
1rtpcr和qpcr实验内参基因选择内参基因概念和作用内参基因的选择参考示例目录加入标题入标题加入标题内参即为内部参照内参基因则是在检测目的基因从dna到mrna表达过程中可用来当作参照的基因
基因测序分析软件的选择与使用教程
基因测序分析软件的选择与使用教程基因测序分析软件在生物信息学研究中扮演着至关重要的角色。
随着测序技术的快速发展，越来越多的数据被产生出来，需要强大而高效的分析软件来处理和解读这些数据。
本文将介绍基因测序分析软件的选择与使用教程，帮助读者更好地了解与应用这些工具。
一、基因测序分析软件的选择选择适合自己的基因测序分析软件是非常重要的，不同软件具有不同的功能和适用范围。
以下是一些常用的基因测序分析软件及其特点：1. BLAST：BLAST（基本局限序列比对搜索工具）是一种用于序列比对的基本工具。
它可以比较两个或多个序列，并通过计算相似性来评估它们之间的关系。
BLAST非常适合于寻找相关基因序列、片段或蛋白质序列。
2. Bowtie：Bowtie是一款用于序列比对的高效软件。
它能够在基因组数据中查找与给定序列片段相匹配的位置，并生成对应的比对结果。
Bowtie在处理大规模测序数据方面表现出色。
3. TopHat：TopHat是一款用于分析RNA测序数据的软件。
它能够从原始测序数据中鉴定基因表达模式，并帮助研究者理解基因调控机制。
TopHat对于RNA测序数据的分析和重组定位特别有用。
4. Cufflinks：Cufflinks是一个用于RNA测序数据分析的流行软件包。
它可以将测序数据定量转化为基因表达水平，并帮助识别新转录本和剪接变异。
Cufflinks在基因组学研究中具有广泛应用。
根据具体研究需求和测序数据类型选择适合的软件是至关重要的。
在选择之前，建议研究者先对自己的数据类型、分析目标和软件特点进行充分了解。
此外，网络上有许多生物信息学研究者的博客和论坛，可以从中获得宝贵的经验和指导。
二、基因测序分析软件的使用教程选择好适合的基因测序分析软件后，正确使用软件以获取准确的结果是至关重要的。
以下是一些基本的使用教程，供参考：1. 学习软件命令：大部分基因测序分析软件都是通过命令行界面运行的。
研究者需要先学习软件的命令语法和参数设置，以正确使用软件。
花绒寄甲荧光定量PCR分析中内参基因的选择
花绒寄甲荧光定量PCR分析中内参基因的选择宋旺;王小纪;郭瑞坚;张伟;张正青;李孟楼【摘要】合适的内参基因是利用实时荧光定量PCR准确分析基因相对表达量的先决条件.以存活时间为6个月、12个月、18个月、24个月、30个月和36个月的花绒寄甲成虫为研究对象,应用实时荧光定量PCR技术,检测了核糖体蛋白11 (RPS),丁二酸脱氢酶复合物(SDHA)、组蛋白(Histone)、泛素结合蛋白(UBC)、cGMP依赖性蛋白激酶Ⅰ(PGK)、延伸因子(EF-1α)、β-肌动蛋白(β-Actin)、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、核糖体蛋白RPL13 (L13)、α-微管蛋白(α-Tubul in)共10个看家基因mRNA的表达情况.经过geNorm、NormFinder和BestKeeper 3个统计学程序,综合分析确定RPS基因或α-Tubul in基因在不同存活时间的花绒寄甲中为较佳用于校正目标基因的内参选择,而RPS、GAPDH和α-Tubulin的组合为最佳校正目标基因内参基因组合.【期刊名称】《西北农业学报》【年(卷),期】2015(024)002【总页数】6页(P156-161)【关键词】实时定量PCR;内参基因;花绒寄甲【作者】宋旺;王小纪;郭瑞坚;张伟;张正青;李孟楼【作者单位】西北农林科技大学林学院,陕西杨凌712100;西安市林业技术推广中心,西安710061;西北农林科技大学林学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学林学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学林学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学林学院,陕西杨凌712100【正文语种】中文【中图分类】Q966随着高通量测序技术的发展，多个物种转录组或基因组序列已揭晓，定量研究特定基因表达水平、揭示其功能的研究已日渐增多。
荧光定量PCR(QuantitativeReal-Time PCR)是一种在转录水平上对mRNA 表达量进行定量检测的成熟技术，在基因表达的定量研究中广泛应用[1]。
qpcr 基因组内参基因标准曲线
qpcr 基因组内参基因标准曲线
在qPCR（quantitative polymerase chain reaction）实验中，基因组内参基因标准曲线是用于定量PCR实验的重要工具。
基因组
内参基因通常是稳定表达的基因，其在不同样本中的表达水平相对
稳定，因此被用作qPCR的内部参照。
建立基因组内参基因标准曲线
的过程通常包括以下步骤：
1. 选择合适的基因，首先需要选择适合作为内参基因的稳定表
达基因。
常用的内参基因包括β-actin、GAPDH、18S rRNA等。
2. 克隆基因，选定内参基因后，需要从相应的生物样本中提取RNA，并通过逆转录反应合成cDNA。
随后将内参基因的cDNA序列克
隆到适当的载体中，以便后续的标准曲线实验。
3. 构建标准曲线，将克隆的基因组内参基因的标准品系列稀释
成不同浓度的cDNA模板，然后进行qPCR实验。
通过测定不同浓度
下的Ct值（threshold cycle，阈值周期），可以得到基因组内参
基因的标准曲线。
4. 分析数据，利用qPCR仪器软件或其他数据分析工具，对标
准曲线的Ct值和对应的模板浓度进行分析，得出标准曲线的斜率、截距和相关系数等参数。
基因组内参基因标准曲线的建立对于qPCR实验的准确定量非常重要。
它能够帮助研究人员确定样本中目标基因的表达水平，并进行相对定量或绝对定量分析。
同时，建立标准曲线还能够评估PCR 反应的效率和灵敏度，确保实验结果的可靠性和准确性。
因此，在进行qPCR实验时，建立基因组内参基因标准曲线是一个必不可少的步骤。
内参基因选择相关软件剖析
比较。其优点是不但可以分析内参基因的稳
定性，而且可以比较目标基因的表达水平。
参考文献：Determination of stable housekeeping genes, differentially regulated target genes and sample integrity: BestKeeper–Excel-based tool using pair-wise correlations， 2004， Biotechnology Letters
内参基因选择相关软件
相关软件
GeNorm程序
NormFinder 程序
获得最稳定的内参基因
BestKeeper 程序
GeNorm程序是Jo Vandesompele于 2002年编写的专门用qPCR方法选择内参基 因的程序。geNorm程序核心原理是：不同 实验条件或不同组织细胞中，2个理想看家 基因表达水平的比值在所有样本中应当一 致，表达水平比值变异度的增加意味着看 家基因表达稳定性的下降。该程序将某一 看家基因与其他看家基因表达水平的两两 比值经对数变换后，计算其平均标准差作 为基因表达稳定度的平均值M。对所有候 选看家基因的表达稳定度进行排序，看家 基因的M值越小，表示该看家基因的表达 越稳定。GeNorm程序可以用于筛选任何组 细胞的任意数量内参基因，选择出2个以上， 而不是传统地使用单一内参基因，有利于 系统偏差的校正，得到更可靠的相对定量 结果。另外geNorm程序可以利用对标准化 因子进行差异分析确定所需看家基因的最 适数目。
GeNorm计算公式
BestKeeper是Michael等(2004)编写的针对 内参基因和目标基因进行选择的程序。 BestKeeper软件可以比较100个样品中10个内 参基因和10个目标基因的表达水平。具体操 作是把原始数据输入BestKeeper 软件的Excel 表格中，内参基因和目标基因进行单独分析。 BestKeeper程序在每个基因之间产生配对的 相关系数和BestKeeper指数（每个候选基因 Ct值的几何平均数），根据其值的大小进行
拟穴青蟹不同发育时期胚胎基因表达的内参基因的筛选
拟穴青蟹不同发育时期胚胎基因表达的内参基因的筛选吕梁;张子平;万海付;孙玉龙;王艺磊【摘要】为获得适用于研究拟穴青蟹(Scylla paramamosain)不同发育时期胚胎基因表达的内参基因, 本研究采用3个内参基因筛选软件 geNorm、NormFinder 及 BestKeeper 对微管蛋白α1A(Tuba1a)、核糖体蛋白 L13(Rpl13)、泛素(UBQ)、核糖体蛋白 S6激酶(Rps6)、精氨酸激酶(Ak)、3-磷酸甘油脱氢酶(gapdh)、28S核糖体 RNA(28S)、18S核糖体RNA(18S)和延伸因子1A基因(EF-1α)等9个常用候选内参基因在拟穴青蟹不同发育时期胚胎的表达稳定性进行分析.geNorm分析表明, EF-1α和Rpl13的表达稳定性最高, 并且采用2个内参基因同时校正目标基因的定量结果可以达到最优效果; NormFinder分析表明, gapdh和EF-1α是9个候选内参基因中表达最稳定的; BestKeeper分析表明, gapdh的标准偏差和变异系数是9个候选基因中最低的.综合 3个内参基因筛选软件, 可以选用EF-1α, 或选用EF-1α和gapdh双内参同时校正拟穴青蟹不同胚胎发育时期各基因的表达情况.【期刊名称】《中国水产科学》【年(卷),期】2019(026)003【总页数】8页(P457-464)【关键词】拟穴青蟹;荧光定量PCR;内参基因;稳定性【作者】吕梁;张子平;万海付;孙玉龙;王艺磊【作者单位】集美大学水产学院,农业部东海海水健康养殖重点实验室,福建厦门361021;福建农林大学动物科学学院,福建福州 350002;集美大学水产学院,农业部东海海水健康养殖重点实验室,福建厦门 361021;福建农林大学动物科学学院,福建福州 350002;集美大学水产学院,农业部东海海水健康养殖重点实验室,福建厦门361021【正文语种】中文拟穴青蟹(Scylla paramamosain)是中国南方沿海地区广泛养殖的最重要的海洋蟹类,同时也是印度洋和太平洋地区许多国家重要的近岸渔业资源[1]。
活动性肺结核患者PBMCs实时定量PCR内参基因的选择
活动性肺结核患者PBMCs实时定量PCR内参基因的选择翟斐;杨秉芬;王若;曹志红;程小星【摘要】目的筛选适用于活动性肺结核患者PBMCs的内参基因.方法用密度梯度离心方法分离活动性肺结核患者PBMCs,然后使用结核分枝杆菌 H37Rv裂解液、CFP-10 和 ESAT-6 多肽库、共刺激因子CD28共孵育,或者不添加任何刺激物,培养过夜后收集细胞;使用Trizol提取mRNA,逆转录获得cDNA,然后用6个常用的内参基因ACTB、B2M、DDX5、GAPDH、YWHAZ和18sRNA的特异性引物进行实时定量PCR检测,结果用geNorm 、NormFinder和Bestkeeper软件进行数据分析.结果 18sRNA基因丰度太高,在PBMCs表达不稳定,DDX5、YWHAZ和B2M的稳定最好,适合作为活动性肺结核患者PBMCs的内参基因,而ACTB和GAPDH稳定性略低.结论筛选出稳定的内参基因DDX5、YWHAZ和B2M,可用于活动性肺结核患者PB-MCs基因表达分析.【期刊名称】《临床肺科杂志》【年(卷),期】2018(023)011【总页数】6页(P1941-1945,1958)【关键词】内参基因;实时定量PCR;结核;外周血单个核细胞【作者】翟斐;杨秉芬;王若;曹志红;程小星【作者单位】100091 北京,中国人民解放军军事科学院军事医学研究院;100091 北京,解放军第三〇九医院全军结核病研究所全军结核病防治重点实验室/结核病诊疗新技术北京市重点实验室;100091 北京,解放军第三〇九医院全军结核病研究所全军结核病防治重点实验室/结核病诊疗新技术北京市重点实验室;100091 北京,解放军第三〇九医院全军结核病研究所全军结核病防治重点实验室/结核病诊疗新技术北京市重点实验室;100091 北京,中国人民解放军军事科学院军事医学研究院;100091 北京,解放军第三〇九医院全军结核病研究所全军结核病防治重点实验室/结核病诊疗新技术北京市重点实验室【正文语种】中文实时定量PCR (Quantitative Real-time PCR)是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每个扩增循环后产物总量的方法，具有灵敏度高、重复性好、高通量和定量准确等特点，被广泛应用于微生物检测、单个核酸多态性分析和基因表达等研究[1-3]。
利用geNorm、NormFinder和 BestKeeper软件进行内参基因稳定性分析的方法
利用geNorm、NormFinder和 BestKeeper 软件进行内参基因稳定性分析的方法作者：吴建阳何冰杜玉洁李伟才魏永赞来源：《现代农业科技》2017年第05期摘要实时荧光定量PCR（RT-qPCR）由于具备灵敏度高、重复性好、特异性强及高通量等优点，已经成为研究基因表达分析的常用方法，但其结果的准确性取决于内参基因。
在任何试验条件下都能稳定表达的内参基因几乎不存在，科研工作者为了获得精准的试验结果，首先必须从众多的内参基因中筛选出稳定的内参基因。
geNorm、NormFinder和BestKeeper等是专门用于筛选稳定性内参基因的软件，但这3种软件使用方法差异很大，为了让更多的科研人员了解这些软件、节省时间，笔者结合自己的科研经验详细介绍了这3种软件的使用方法，以期为相关科研人员利用这些软件筛选内参基因提供便利。
关键词内参基因；稳定性分析；geNorm；NormFinder；BestKeeper中图分类号 S60 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2017）05-0278-04Abstract Real-time fluorescent quantitative PCR technology（RT-qPCR） is used for gene expression analysis with high sensitivity，good repea-tability，strong specificity，high throughput，but the veracity and reliability results depend on whether select appropriate reference gene ornot.However，no universally applicable reference genes with an invariant expression are available.In order to obtain accurate results，appropriate reference genes for RT-qPCR normalisation must systematically evaluate the stability of candidate reference genes prior to using in each experimental system.geNorm，NormFinder and BestKeeper are useful programs to identify appropriate reference genes for RT-qPCR analysis，but the methods for using the three softwares were different.In order to save the time to understanding the way to use them and provide convenient for new researchers，this study described the methods of application.Key words reference gene；stability analysis；geNorm；NormFinder；BestKeeper实时荧光定量PCR（RT-qPCR）由于具备灵敏度高、重复性好、特异性强及高通量等优点，已经成为研究基因表达分析的常用方法[1-2]。
不同人源性细胞中内参基因的筛选
不同人源性细胞中内参基因的筛选
李俊慧;裴倩倩;赵晓转;王新明;刘功成
【期刊名称】《中国医学工程》
【年(卷),期】2024(32)6
【摘要】目的为筛选在不同人源性细胞中能够稳定表达的内参基因,以期为不同组织的定量研究提供一定的参考。
方法通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)方法检测
36种人源性细胞中β-珠蛋白(β-Globin)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、核糖
体RNA(18S rRNA)和核糖核酸酶P(Rnase P)4个候选内参基因的表达量,并利用geNorm、NormFider和BestKeeper三个软件对候选内参基因的稳定性进行评价。
结果同一种细胞中,Rnase P的表达量较高;不同细胞中,18S rRNA的表达较为稳定。
结论综合分析发现候选内参基因18S rRNA虽较为稳定,但并不是最优选择。
【总页数】4页(P10-13)
【作者】李俊慧;裴倩倩;赵晓转;王新明;刘功成
【作者单位】郑州标源生物与科技有限公司研发部
【正文语种】中文
【中图分类】Q812
【相关文献】
1.BCB筛选后的绵羊卵母细胞中母源基因mRNA表达量的差异性分析
2.结核性与恶性胸腔积液中微小核糖核酸内参基因筛选的初步研究
3.结核性与恶性胸腔积液
中微小核糖核酸内参基因筛选的初步研究4.外源AHLs培养下荧光假单胞菌qPCR 内参基因的筛选5.甜瓜属异源多倍体不同倍性材料内参基因的筛选及评估
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植物实时荧光定量PCR内参基因的选择_胡瑞波
中国农业科技导报,2009,11(6):30-36Journa l o f Ag ricu ltura l Sc ience and T echno l ogy收稿日期:2009-03-25;修回日期:2009-10-28基金项目:国家863计划项目(2006AA10A111,2007AA10Z119);国家转基因重大专项(2008ZX0809-001);/十一五0国家科技支撑计划项目(2007BAD59B02)资助。
作者简介:胡瑞波,博士研究生,研究方向为植物发育分子生物学。
E-m ai:l rayhu@yahoo .cn 。
通讯作者:傅永福,研究员,主要研究方向为植物发育分子生物学。
Te:l 010-********;E -ma i :l f u f u19c n@163.co m植物实时荧光定量PCR 内参基因的选择胡瑞波, 范成明, 傅永福(中国农业科学院作物科学研究所,国家农作物基因资源与遗传改良重大科学工程,北京100081)摘 要:实时荧光定量RT-PCR (rea -l ti m e quantitati ve reverse transcripti on PCR,qRT-PCR )具有定量准确、灵敏度高和高通量等特点,已被广泛应用于基因的表达分析。
常规q RT-PCR 采用相对定量进行分析,其关键步骤是选择合适的稳定内参基因进行校正和标准化。
持家基因被广泛用作内参基因,但在所有生理条件下均稳定表达的理想内参基因并不存在。
大多数传统内参基因已不能满足qRT-PCR 准确定量的要求。
基于基因芯片表达数据和EST 数据库并结合qRT-PCR,可以筛选稳定性好的新的内参基因。
简要综述了植物qRT-PCR 内参基因的研究进展,并就内参基因的选择中应注意的问题进行了探讨。
关键词:实时荧光定量RT -PCR;内参基因;ge N o r m;基因表达中图分类号:Q 789 文献标识码:A 文章编号:1008-0864(2009)06-0030-07R eference G ene Selecti on i n P l ant R ea-l ti m e QuantitativeR everse Transcri pti on PCR (q RT -PCR )HU Ru-i bo ,FAN Cheng -m i n g ,F U Yong -fu(Instit u t e of C rop Science ,N ati on alKey Facilit y of C rop Gen e Res ou rce and Genetic I m prove m en t ,Ch i n ese Acade m y ofAgricultura lS ci en ces ,B eiji ng 100081,Ch i na)Abstract :R ea-l ti m e quantitati v e RT-PCR (q RT-PCR )techno l ogy ,w ith quantitati ve accuracy ,h i gh sens i tiv it y andhi gh -throughput character i sti cs ,has been w i de l y used in gene expression analysis .Based on t he re l a tive quan tita ti ve ana l ys i s ,q RT-PCR data must be norma li zed w ith one o r mo re proper and stab le i n ternal reference genes .H ouse -keepi ng genes are custo m ar il y used as endogenous references for re lati ve quan tificati on .But no t a si ng le g ene can act as a un i v ersal reference reported so far .M ost o f the trad iti ona l housekeepi ng genes a re unab le to ensure accurate norma li zati on i n q RT-PCR.Based on t he trem endous gene -chip expressi on da ta and public deposited EST data ,ne w reference genes w ith superior stab ilit y w ere selected and ver ifi ed w ith q RT-PCR.T he research progress of reference genes in plant q RT-PCR w as rev ie w ed and aspects t o be consi dered i n f u t ure reference gene se lecti on were a lso discussed .K ey words :rea-l ti m e quanti tati ve reverse transcr i pti on PCR;reference genes ;ge N o r m;gene expression实时荧光定量RT-PCR (rea-l ti m e quantitative reverse transcri p ti o n PCR,qRT-PC R )是在传统PCR 技术基础上发展起来的一种新的核酸定量技术,具有定量准确、灵敏度高、重复性好、高通量等特点,已被广泛应用于基因的表达分析[1,2]。
mRNA的qRT-PCR检测方法
mRNA的qRT-PCR检测方法（1）选择内参基因：一般为actin 、tublin、5S、EF1-a，最好选择两个内参为参照（两个内参结果更加可靠）。
（2）引物设计：所选基因使用Bencon Designer 软件进行引物设计。
此软件会把输入的序列和NBCI上的基因做对比，选出特异性的区域自动设计引物，而Primer 5只在本序列上设计引物，这样设计可能会有非特异性扩增。
Bencon Designer 软件使用步骤如下:打开Bencon Designer--File--New Sequence--粘贴序列--Add--在此方框中选择SYBR Green Design。
单击符号BLAST Search Sequence--Eukaryotic Genome BLAST--Search（等一会自动生成一个对比结果，可以不用看）--单击Primer Search--Primer Parameters（Tm和Ta为55±5℃、Length 18 to 24bp、Amplicon Length 75 to 200 bp、Alternate Primer Pairs 5）--Search--OK（自动生成Sense和Anti Sense序列，直接可以送公司合成序列）。
（OD260/OD280在1.8-2.2（3）RNA提取：Trizol法提取植物总RNA，跑1%的琼脂糖凝胶电泳。
之间，OD260/OD230在2.0-2.2之间）。
（4）RNA反转录：mRNA的qRT-PCR用普通的反转录即可（反转录出来的产物跑1%的琼脂糖凝胶电泳，有弥散的带表明反转录效果好）。
（5）以反转录产物为模板稀释5倍、10倍、20倍、40倍，每个倍数做2管，qRT-PCT选择合适的稀释倍数。
（6）选择一个合适的稀释倍数，Ct值在20-30之间，溶解曲线要为单峰。
在此阶段最好把处理和对照的内参基因的Ct值都调于接近，这样两者最后做出来的数值可比性数值结果更强。
杉木实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择
关键词：杉木；荧光定量；内参基因；ＢｅｓｔＫｅｅｐｅｒ
中图分类号：Ｓ７１８．４６
文献标识码：Ａ 文章编号：１００１１４９８（２０１９）０２００６５０８
实 时 荧 光 定 量 ＰＣＲ（Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＰＣＲ）是一种高精度、高通量地检测目的基因表达水 平的稳定方法，在现代分子生物学研究中的应用十 分广泛。但 是，实 时 荧 光 定 量 ＰＣＲ实 验 很 容 易 受 ＲＮＡ质量、上样量、逆转录效率等的试验误差干扰， 这就需要内参基因 （Ｉｎｔｅｒｎａｌｒｅｆｅｒｅｎｃｅｇｅｎｅ）作为参 照物来校正样品间的试验误差［１－４］。内参基因的表 达量越稳定，越能更好地检测目的基因的特异性表 达水平 ［５－８］。针对 不 同 的 植 物 种 类 和 组 织 部 位，前 人对内参基 因 的 选 择 进 行 了 较 多 研 究［９－１３］。大 量 研究表明，内参基因的表达稳定性是相对的，在植物 的不同品种、组织部位和试验条件下表达的稳定性 差异较大［１４－１６］。因此，筛选和评估内参基因表达的 稳定性，建立多内参基因的评价体系，是提高实时荧 光定量 ＰＣＲ试验准确性的重要保证。
杉木 （Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍｉａｌａｎｃｅｏｌａｔａ（Ｌａｍｂ．）Ｈｏｏｋ．） 是我国重要的针叶速生用材树种之一，具有速生、丰
产、材质优良等特点，在我国南方地区有广泛的栽培 和利用。随着分子生物学的发展，目前针对杉木的 转录组测序、基因克隆和 ｍｉｃｒｏＲＮＡ功能研究越来越 多，这些研究涉及到使用荧光定量 ＰＣＲ技术检测目 的基因 的 表 达 情 况［１７－１８］。在 荧 光 定 量 ＰＣＲ实 验 中，前人 在 对 杉 木 内 参 基 因 的 选 择 上 各 不 相 同， ＥＦ１α、Ａｃｔｉｎ、２８ＳｒＲＮＡ等被选用，但是对杉木在不同 组织 中 内 参 基 因 的 筛 选 和 表 达 稳 定 性 研 究 极 少［１９－２０］。筛选和评估内参基因表达的稳定性，是保 证杉木荧光定量 ＰＣＲ准确性的重要前提。本文通 过对比分析杉木中甘油醛三磷酸脱氢酶基因（ＧＡＰ ＤＨ）、转录延伸因子（ＥＦ１α）、１８Ｓ核糖体 ＲＮＡ基因 （１８ＳｒＲＮＡ）、２８Ｓ核糖体 ＲＮＡ基因（２８ＳｒＲＮＡ）、泛 素基因（ＵＢＱ）、泛素结合酶基因（ＵＢＣ）以及肌动蛋 白基因（Ａｃｔｉｎ）这 ７个传统的内参基因的稳定性，挑 选出可作为杉木在不同组织中基因表达分析所用的 内参基因，并通过杉木纤维素合酶基因 ＣｌＣｅｓＡ１和
茶树实时荧光定量PCR分析中内参基因的选择
植物学报 Chinese Bulletin of Botany 2010, 45 (5): 579–587, doi: 10.3969/j.issn.1674-3466.2010.05.007——————————————————收稿日期: 2009-12-08; 接受日期: 2010-03-30基金项目: 973计划前期项目(No.2007CB116211)、国家自然科学基金(No.30771755和No.30972401)和安徽省自然科学基金(No.09041- 1006)* 通讯作者。
E-mail: xiatao62@; gaolp62@茶树实时荧光定量PCR 分析中内参基因的选择孙美莲1, 王云生2, 杨冬青1, 韦朝领1, 高丽萍2*, 夏涛1*, 单育1, 骆洋21安徽农业大学农业部茶叶生物化学与生物技术重点实验室, 合肥 2300362安徽农业大学生命科学学院, 合肥 230036摘要 选择合适的内参基因是提高实时荧光定量PCR 分析(qRT-PCR)准确性的先决条件。
该文以茶树(Camellia sinensis )芽、叶、幼根、嫩茎、花瓣、种子和愈伤组织为材料, 应用实时荧光定量PCR 技术, 分析了18S rRNA 、GAPDH 、β-actin 和α-tubulin 4个常用内参基因在茶树不同器官组织中的表达情况。
经GeNorm 和NormFinder 软件分析发现, 当利用荧光定量PCR 分析比较茶树不同器官组织中的基因表达差异时, 可选择β-actin 作为校正内参基因; 而比较不同成熟度的叶片和愈伤组织时, 可以选择GAPDH 作为校正内参基因。
关键词 茶树, 实时荧光定量PCR, 内参基因孙美莲, 王云生, 杨冬青, 韦朝领, 高丽萍, 夏涛, 单育, 骆洋 (2010). 茶树实时荧光定量PCR 分析中内参基因的选择. 植物学报 45, 579–587.实时荧光定量PCR(real time fluorescence qua- ntitative PCR, qRT-PCR)实现了聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction, PCR)从定性到定量的飞跃, 具有重复性好、灵敏度高、定量准确、速度快等优点, 已成为分子生物学研究中分析基因表达的重要工具(Heid et al., 1996; Haller et al., 2004; Ransbotyn and Reusch, 2006; Yoo et al., 2009)。
葡萄实时定量PCR中稳定内参基因的筛选
葡萄实时定量PCR中稳定内参基因的筛选查倩;奚晓军;蒋爱丽;田益华;王世平【期刊名称】《果树学报》【年(卷),期】2016(33)3【摘要】【目的】通过ge Norm软件筛选实时荧光定量PCR稳定内参基因,基于多内参基因评价体系进行目的基因相对表达量的计算。
【方法】获得不同葡萄品种叶片和果皮中6个候选内参基因的循环阈值(Ct),利用ge Norm软件计算内参基因平均表达稳定性数值M和基因配对差异值V,从而判断内参基因最适组合。
【结果】发现候选内参基因表达稳定性由高到低的排列顺序为Vv EF1r=Vv EF1-α>Vv GAPDH>Vv ACTIN>Vv ACT1>Vv UBQ,不同组织分别分析均发现Vv EF1-α和Vv EF1r的稳定性最高,且基因配对差异值V2/3为0.104,所以内参基因的最适组合为Vv EF1-α和Vv EF1r。
利用ge Norm软件计算得到的多内参基因评价体系的标准化因子可应用于目的基因的相对表达量分析。
【结论】ge Norm软件筛选实时荧光定量PCR稳定内参基因的方法可以应用到多条件和多组织的不同植物样本中,并用于目的基因表达谱的研究,具有重要的广泛应用价值。
【总页数】7页(P268-274)【关键词】葡萄;ge;Norm;内参基因;标准化因子;实时荧光定量PCR【作者】查倩;奚晓军;蒋爱丽;田益华;王世平【作者单位】上海农业科学院林木果树研究所;上海交通大学农学与生物技术学院【正文语种】中文【中图分类】S663.1【相关文献】1.二化螟实时荧光定量PCR内参基因筛选和表达稳定性评价 [J], XU Hongxing;WANG Guorong;LU Yanhui;YANG Yajun;ZHENG Xusong;TIAN Junce;LÜ Zhongxian2.实时荧光定量PCR分析中不同铁浓度处理下玛氏骨条藻内参基因的筛选 [J], 张梅; 邢永泽; 甄毓; 米铁柱; 于志刚3.甜瓜实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选 [J], 章丽珍;韩晓云;吴菁华;Gefu WANG-PRUSKI;张志忠4.钩藤实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选及稳定性评价 [J], 于晓松;王晓红;李雪;贾娜;上官黎阳;强玮;张明生5.山核桃实时荧光定量PCR分析中内参基因的筛选与验证 [J], 赵艺蕊;黄春颖;王克涛;徐一帆;王建华;邢语琳;陶瞫宸;黄坚钦;李岩因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
基因组数据分析的最新软件
基因组数据分析的最新软件随着技术的不断发展，基因组数据分析的应用范围越来越广泛，很多获得基因组数据的实验室，科研机构和医院都需要使用一些专业的软件来帮助他们进行数据分析和处理，这些软件可以帮助研究人员更好地理解基因组数据，从而进一步研究生命科学的一些重要方面。
在过去的几年中，基因组数据分析领域涌现了许多新的软件，这些软件不仅可以高效地处理和分析数据，而且具有许多新的功能和特点。
下面我们就来介绍一些基因组数据分析的最新软件。
1. GATK（Genome Analysis Toolkit）GATK是一款由哈佛大学和布罗德学院开发的免费开源软件工具集，广泛应用于基因组数据的分析和处理。
GATK拥有强大的能力，包括基于文件或自定义参考基因组的数据分析，基于样本和控制组的数据比较和筛选，以及数据可视化等。
GATK特别适用于针对DNA变异的分析工作，如SNP，INDEL和CNV等。
此外，GATK还具有排除和修复错误的功能，这对于提高基因组数据的处理和分析的准确性和效率非常有帮助。
2. BWA（Burrows-Wheeler Aligner）BWA是一款基于算法的软件工具，可以将高通量测序数据与参考基因组进行比对，广泛应用于DNA映射以及DNA序列处理等方面。
BWA具有快速，并行处理大规模数据的能力，并采用了多种对基因组数据的比对方法，从而大大提高了数据准确性。
BWA的最新版本还具有支持多个种族的特性，这对于进行人类基因组数据分析非常有用。
3. R（统计分析）R语言是一种免费的开源软件工具，广泛应用于生物信息学领域，尤其是基因组数据的统计分析方面。
R提供了广泛的生物信息学和统计分析功能和方法，可以进行诸如聚类分析、PCA分析，差异分析等。
同时，R还配备有许多绘图和数据可视化功能，允许用户以图表的形式展现基因组数据的结果。
因此，R语言是生命科学中可重要的一个工具。
4. STAR（RNA-seq分析）STAR是一款RNA测序的分析工具，广泛应用于转录组数据的分析方面。
节旋藻实时荧光定量PCR内参基因的选择
节旋藻实时荧光定量PCR内参基因的选择摘要:本实验利用实时荧光定量PCR对极大节选藻中16SrRNA、TEF(翻译延伸因子,GTPases)、RPL13(核糖体蛋白)、PSR(藻蓝蛋白β亚基)、CYP(亲环素家族)、GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、Hsp(热休克蛋白)和rpoD(RNA聚合酶σ70 因子)八个候选基因在正常生长和持续光照条件下的稳定性进行了检测。
用geNorm软件对实验数据进行处理,从中选出合适的内参基因。
结果表明RPL13和CYP38可以作为正常生长和持续光照处理下极大节选藻节律性研究通用的内参基因16SrRNA基因的稳定性要低于其他的候选内参基因,并不是一个合适的内参基因。
关键词:节旋藻内参基因实时荧光定量PCR geNorm 生物节律用实时荧光定量PCR进行相对定量时,需选取在不同实验条件下表达恒定的基因作为内参对目标基因的表达量进行校正。
常用的内参基因有GAPDH、β-actin、18SRNA、16SRNA、RPL13、Cyclophilin 等,然而近年来的研究发现常用的内参基因存在一些缺陷。
Revillion 等[1]发现GAPDH mRNA在不同癌组织、不同个体间以及细胞周期的不同阶段变化较大。
18SrRNA和16SrRNA作为内参也遭到了质疑。
Tricarico等[2]认为对于已纯化mRNA中的目标基因进行定量时,rRNA不能用于标准化;相对于大部分目标基因,rRNA的表达量太高,不能真实的反映目标基因的降解情况。
1 材料与方法将节旋藻Arthrospira FACHB 438于Zarrouk液体培养基中进行预培养至对数期。
培养条件为23℃恒温,光强30μmol·m-2·s-1,12L/12D 培养。
藻液黑暗处理12h以达到同步化后,分别进行持续光照处理和正常培养。
每隔4小时收一次藻,收集48小时,共得到26个样品组,两种实验条件下各13个。
鹿茸组织中内参基因的筛选和验证
鹿茸组织中内参基因的筛选和验证张然然;刘华淼;邢秀梅;胡大勇【摘要】为筛选在不同生长时期鹿茸组织中稳定表达的内参基因,试验以不同生长时期(分别为脱盘后10、20、40和60 d)的鹿茸组织为材料,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法分析甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、p2-微球蛋白(B2M)、还原型辅酶Ⅰ(NADH)、60S核糖体蛋白L40 (RPL40)、谷胱甘肽还原酶7(GPx)和β肌动蛋白(ACTB)6个看家基因的表达情况,并运用geNorm和NormFinder两个程序综合分析6个看家基因的表达稳定性.结果显示,GAPDH、ACTB、RPL40表达稳定性较好,可用作鹿茸基因表达研究的内参基因,而NADH和GPx的稳定性最差,不适合作内参基因.通过对鹿茸生长相关基因(ANXA5、HSP27、PRD2、CRABP1、LGALS1)表达分析,进一步验证了上述结果,并且发现这5种基因均在脱盘后10 d的鹿茸组织中高表达.该研究结果为鹿茸快速生长及骨化相关基因的研究奠定了一定基础.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2015(042)004【总页数】7页(P883-889)【关键词】qRT-PCR;鹿茸;内参基因;geNorm;NormFinder【作者】张然然;刘华淼;邢秀梅;胡大勇【作者单位】中国农业科学院特产研究所,特种经济动物分子生物重点实验室,长春130112;中国农业科学院特产研究所,特种经济动物分子生物重点实验室,长春130112;中国农业科学院特产研究所,特种经济动物分子生物重点实验室,长春130112;白城市动物卫生监督所,白城137000【正文语种】中文【中图分类】S825鹿茸是哺乳动物中唯一可再生的附属器官，在脱盘之后的第1个月生长缓慢，但到第2个月生长速度可高达2 cm/d，细胞的增殖速度远远高于癌细胞，第3个月鹿茸逐渐开始骨化。
鹿茸快速生长过程中还伴随着血管和神经组织的快速生长，鹿茸的再生能力及其极高的生长速度得到了人们的广泛关注，是研究组织再生和快速生长的重要模型。
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GeNorm计算公式
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BestKeeper是Michael等(2004)编写的针对 内参基因和目标基因进行选择的程序。 BestKeeper软件可以比较100个样品中10个内 参基因和10个目标基因的表达水平。具体操 作是把原始数据输入BestKeeper 软件的Excel 表格中，内参基因和目标基因进行单独分析。 BestKeeper程序在每个基因之间产生配对的 相关系数和BestKeeper指数（每个候选基因 Ct值的几何平均数），根据其值的大小进行 比较。其优点是不但可以分析内参基因的稳 定性，而且可以比较目标基因的表达水平。
参考文献：Determination of stable housekeeping genes, differentially
regulated target genes and sample integrity: BestKeeper–Excel-based tool
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using pair-wise correlations， 2004， Biotechnology Letters
参考文献： Accurate normalization of real-time quantitative RT-PCR data by
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geometric averaging of multiple internal control genes， 2002， Genome Biology
例如：
内参基因选择相关软件
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相关软件
GeNorm程序 NormFinder 程序 BestKeeper 程序
获得最稳定的内参基因
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GeNorm程序是Jo Vandesompele于 2002年编写的专门用qPCR方法选择内参基 因的程序。geNorm程序核心原理是：不同 实验条件或不同组织细胞中，2个理想看家 基因表达水平的比值在所有样本中应当一 致，表达水平比值变异度的增加意味着看 家基因表达稳定性的下降。该程序将某一 看家基因与其他看家基因表达水平的两两 比值经对数变换后，计算其平均标准差作 为基因表达稳定度的平均值M。对所有候 选看家基因的表达稳定度进行排序，看家 基因的M值越小，表示该看家基因的表达 越稳定。GeNorm程序可以用于筛选任何组 细胞的任意数量内参基因，选择出2个以上， 而不是传统地使用单一内参基因，有利于 系统偏差的校正，得到更可靠的相对定量 结果。另外geNorm程序可以利用对标准化 因子进行差异分析确定所需看家基因的最 适数目。
NormFinder 程序是用于选择合适内参基 因的工具，由 Claus 等 2004 年编写其运行 原理与 geNorm 程序类似，产生基因表达稳 定值,然后根据稳定值排序，最终将表达稳 定值最小的基因作为最稳定的基因。其缺点 是只能选择一适的内参基因作标准。而 geNorm 程序通过基因配对的形式,筛选出最 不稳定基因，然后将剩下基因重新排序重新 配对进行筛选，最终选出适当数目的合适基 因。
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2004， cancer research
ห้องสมุดไป่ตู้
参考文献：Normalization of Real-Time Quantitative Reverse Transcription-
PCR Data: A Model-Based Variance Estimation Approach to Identify Genes
Suited for Normalization, Applied to Bladder and Colon Cancer Data Sets，