【CN109897918A】鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量检测方法【专利】
鲤疱疹病毒Ⅰ型(CyHV-1)核酸检测试剂盒(恒温荧光法)
广州华南生物工程有限公司
Guangzhou South China Bioengineering Co., Ltd
鲤疱疹病毒Ⅰ型（CyHV-1）核酸检测试剂盒（恒温荧光法）
鲤疱疹病毒Ⅰ型（CyHV-1）核酸检测试剂盒（恒温荧光法）是广州华南生物工程有限公司研发的一种高度灵敏的检测试剂，适用于检测水生生物中的鲤疱疹病毒。
该试剂盒采用了恒温荧光法技术，可以在短时间内快速准确地检测出病毒核酸，从而为鱼类疾病的早期诊断提供了强有力的支持。
鲤疱疹病毒Ⅰ型（CyHV-1）核酸检测试剂盒的主要特点是高灵敏度、高特异性、操作简便、快速准确。
其检测下限可达到100基因拷贝/μl，可以有效地检测出病毒核酸的存在。
同时，该试剂盒采用了恒温荧光法技术，避免了传统PCR方法中需要多次温度变化和时间较长的缺点，从而提高了检测效率。
此外，该试剂盒还具有高特异性，可以准确地检测出鲤疱疹病毒Ⅰ型，不会出现假阳性或交叉反应。
使用鲤疱疹病毒Ⅰ型（CyHV-1）核酸检测试剂盒进行检测时，需要准备样品、试剂盒、PCR仪、离心机等设备。
首先需要将样品进行处理，提取出其中的病毒核酸。
然后将核酸与试剂盒中的引物和探针进行反应，通过PCR扩增技术使病毒核酸得到大量复制。
最后通过荧光检测技术检测出是否存在鲤疱疹病毒Ⅰ型。
整个过程仅需数小时，大大缩短了检测时间。
总之，鲤疱疹病毒Ⅰ型（CyHV-1）核酸检测试剂盒（恒温荧光法）是一种高度灵敏、快速准确的检测试剂，适用于鱼类疾病的早期诊断和治疗。
它的出现为水生生物的健康和养殖业的可持续发展提供了有力保障。
如果在使用过程中遇到问题，请与广州华南生物工程有限公司技术人员联系。
锦鲤疱疹病毒病的流行特点、诊断及防治的研究进展
验及消杀处理，不可擅自用药[21]或转移运输。对病
毒进行攻毒，发现胆汁酸不仅能促进其生长，还
鱼的来源和销售情况进行溯源跟踪，开展流行病
能提高异育银鲫的抗病能力。随着研究的逐渐深
学调查，及早发现并切断传播路径，降低损失。
入，相信在不久的将来会有针对疱疹病毒病的抗
4.2
穿心莲的饲料的异育银鲫死亡率仅为 15%；何杰
毒饲料问世。
3.2
无害化处理
捞出死鱼和病危鱼，用生石灰处理后深埋。
4.3
加强养殖人员培训
目前，我国水产养殖行业多以家庭作坊式小
隔离消毒
锦鲤疱疹病毒还可存在于病鱼的分泌物中在
规模饲养为主，存在文化水平不高、饲养随意、
水中传播[22]，应注意对染病鱼池的隔离，不得将水外
对设施设备的投入较低等特点，很多养殖户在养
国是渔业大国，据 2020 年中国渔业统计年鉴数据
检测鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒的三重 PCR 检测
2019 年全国淡水养殖总产量的 9.6%，因此对锦鲤
便捷地对该疫病进行确诊。
显示，2019 年我国鲤鱼养殖总产量约 289 万 t，占
方法，相信随着检测技术的进步，可以更快速、更
疱疹病毒病的防治研究非常重要，本文对目前研究
Abstract: Koi herpesvirus disease is an epidemic disease that is easy to invade Cyprinidae fish. It has the
characteristics of strong infectivity, rapid onset and high mortality. It was first found in the 1990s. At present, it has
TaqMan荧光定量PCR快速检测锦鲤疱疹病毒方法的建立与应用
TaqMan荧光定量PCR快速检测锦鲤疱疹病毒方法的建立与应用摘要：本研究采用一步DNA提取法快速提取锦鲤组织样品中的DNA，利用针对锦鲤疱疹病毒（Koi herpesvirus，KHV）TK基因保守区设计的一对特异性引物、一条特异荧光探针，经反应体系优化，应用实时荧光定量PCR检测技术，通过对荧光信号的实时监测实现对KHV的定量检测。
整个过程快速、简捷，操作简单，可对KHV进行快速有效的诊断，具有一定的应用价值。
关键词：锦鲤疱疹病毒；荧光定量PCR；TaqMan；一步法中图分类号：S941.41+9文献标识号：A文章编号：1001-4942（2016）07-0125-04锦鲤疱疹病毒病是由锦鲤疱疹病毒（Koi herpesvirus，KHV）引起的一种传染性疾病。
KHV能够感染锦鲤、鲤鱼和剃刀鱼，其鱼苗、幼鱼、成鱼均可感染。
锦鲤疱疹病毒病多发于春、秋季，潜伏期两周左右，鱼发病并出现症状24～48 h后开始死亡，2～4 d内死亡率可迅速达到80%～100%[1，2]。
此病首先在以色列暴发，接着美国、欧洲（如英国、德国、比利时）及亚洲一些国家均有此病发生，给锦鲤和鲤鱼养殖业造成重大经济损失[3，4]。
锦鲤疱疹病毒颗粒呈球状，有囊膜，直径约170～230 nm，其核衣壳为对称十面体，直径为100～110 nm，该病毒由31种病毒多肽组成，遗传物质为双链DNA，基因组大小约为277 kb[5，6]。
目前锦鲤疱疹病毒病的检测方法有电镜检测、ELISA、普通PCR和荧光定量PCR等[7]。
TaqMan荧光定量PCR是在PCR 扩增时在加入一对引物的同时加入一种特异性荧光探针，该探针为一段寡聚核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5′→3′外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步[8～11]。
一种检测鲤鱼水肿病毒的试剂盒和方法[发明专利]
![一种检测鲤鱼水肿病毒的试剂盒和方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/950520f5c281e53a5902ff38.png)
专利名称：一种检测鲤鱼水肿病毒的试剂盒和方法
专利类型：发明专利
发明人：黄凌远,刘天强,康岳华,黄冠军,李茂,敬小兵,阳涛申请号：CN201611155675.9
申请日：20161214
公开号：CN106399592A
公开日：
20170215
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种检测鲤鱼水肿病毒的方法和试剂盒，涉及一种鲤鱼水肿病毒的检测技术。
本发明检测鱼类致病菌的试剂盒，其包含序列如SEQ ID NO：1～2所示的引物对，扩增来自鲤鱼水肿病毒的基因。
本发明提供的检测试剂盒和检测方法可以准确、有效的检测鲤鱼水肿病毒，且敏感性高、特异性强、耗时短，检测快速，可以用于鱼病的快速检测和预测，预防鱼病的发生，提高经济效益。
申请人：通威股份有限公司
地址：610041 四川省成都市高新区二环路南四段11号
国籍：CN
代理机构：成都高远知识产权代理事务所(普通合伙)
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养殖锦鲤鲤鱼浮肿病的检测与鉴定
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0&%)年/月!北京市房山 区 某 养 殖 场 锦 鲤 幼 鱼 暴发疫 病!* " 内 Q&P 以 上 幼 鱼 死 亡!症 状 类 似 aEF 感染!但经 LMC 检测确定不 是 aEFR& 通过 电镜观察'LMC 扩增'序列 测 定 及 比 对!确 定 房 山 发 病锦鲤是由 M<F 感 染 引 起 的 鲤 鱼 浮 肿 病& 这 也 是 在中国国内首次发现鲤鱼浮肿病&由于鲤鱼浮肿病 可对养殖的锦鲤和鲤造成较高的死亡率)*!Q*!并 且 该 病病症与 aEFR 非常 类 似!临 床 上 极 易 混 淆!给 监 测及防控工作增加了难度&为此本试验将发现的病 例 及 检 测 '鉴 定 方 法 介 绍 如 下 !为 该 病 的 诊 断 防 控 提 供参考&
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扩 增 I@: 的 反 应 体 系$模 板 %& (B!"G>L 0(B!OVM;0 溶液1(B'%&倍 6%B 酶 缓 冲 液%&(B! I@: 引 物 各 &'Q(B!6%B 酶0'QY!加 R<LM 水 至 %&&(B&反应条件为$?) b预 变 性 *&A(?) b 变 性 *&A!(* b 退 火 *&A!/0 b 延 伸 *&A!)& 个 循 环(
随着中国渔业 发 展 和 消 费 者 的 需 求 多 样 化锦 鲤养殖业近年在中 国 迅 速 发 展但 锦 鲤 疾 病 发 生 情
锦鲤疾病之疱疹病毒病治疗方案！
锦鲤疾病之疱疹病毒病治疗方案！
这是一种令锦鲤养殖业者闻之色变的“瘟疫”，近10年来，每年给世界锦鲤产业造成过亿元的损失。
《病原》鲤疱疹病毒( KHV)，一种DNA病毒。
《症状》体表有溃疡，皮肤黏膜被破坏而失去光泽，局部皮下充血，鳍膜不同程度糜烂，末梢鳍丝裸露，鳃组织局部坏死，常见鳃部有火柴头大小的脓样坏死物，眼球下凹。
一条病鱼往往不是全部症状都有。
感染疱疹病毒病的锦鲤幼鱼外观
《流行情况》世界各地都有发生，据说最早是在以色列发现的。
水温13～29度是发生条件，在这个温度范围以外，即使携带病毒的鱼体也不会出现症状。
在我国南方，发病季节是11月至次年5月。
进口的第一代日本锦鲤容易发生，“土炮”免疫力稍强。
《预防措施》秋季末开始，经常投喂清火类中草药拌的药饵。
有效的中草药是：板蓝根三黄散、大黄粉、四黄粉。
每1~2星期投喂一天。
疱疹病毒病鱼的鳃部
《治疗方法》
(1)将水温提高到30度，用聚维酮碘泼洒，使池水药物浓度达1克／米。
(2)投喂中草药药饵，连续一星期，同时鱼塘泼洒聚维酮碘，使池水药鬯急蠹薹物浓度达1克／米3，连续泼洒3天。
(3)用浓度为1 00克／米聚维酮碘浸泡患病鱼30秒，每天一次，连用3天。
养殖锦鲤鲤鱼浮肿病的检测与鉴定
关键词 ： 鲤鱼浮肿病毒 ； 鲤鱼浮肿病 ； 锦鲤疱疹病 毒 ； 锦 鲤
中图分类号 ： ￥ ９ ４ １ ． ４ ｌ 文献标识码 ： Ａ 文章编号 ： １ ６ ７ １ － ７ ２ ３ ６ （ ２ ０ １ ７ ） ０ ２ — ０ ６ １ ３ － ０ ６
Ｔｅ ｓ ｔ ｉ ｎ ｇ ａ ｎ ｄ Ｉ ｄ ｅ ｎ ｔ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｏ ｆ Ｃａ ｒ ｐ Ｅｄ ｅ ｍａ Ｖｉ ｒ ｕ ｓ Ｄｉ ｓ ｅ ａ ｓ ｅ ｉ ｎ Ｃｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ｄ Ｋｏ ｉ ＸＵ Ｌｉ — ｐ ｕ ，ＷＡＮＧ Ｘｉ ａ ｏ — ｌ ｉ ａ ｎ ｇ ，ＺＨＡＮＧ Ｗｅ ｎ ，Ｐ ＡＮ Ｙｏ ｎ ｇ ，Ｊ Ｉ ＮＧ Ｈｏ ｎ ｇ － ｌ ｉ 。 ， ＷＡＮＧ Ｊ ｉ ｎ ｇ － ｂ ｏ ，ＷＡＮＧ Ｓ ｈ ｕ ，ＣＡＯ Ｈｕ ａ ｎ ，ＷＡＮＧ Ｐ ｅ ｎ ｇ ，ＮＡ Ｌ ｉ — ｈ ａ ｉ ， Ｊ Ｉ ＡＮＧ Ｙｕ － ｌ ｉ ｎ ２
中 国 畜牧 兽 医
２ ０ １ ７ ， ４ ４ （ ２ ） ： ６ １ ３ — ６ １ ８
Ｃｈ ｉ ｎ ａ Ａｎ ｉ ｍａ ｌ Ｈｕ ｓ ｂ ａ ｎ ｄ ｒ ｙ ＆ Ｖｅ ｔ ｅ ｒ ｉ ｎ ａ ｒ ｙ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ｅ
ｄ ｏ ｉ ：１ ０ ． １ ６ ４ ３ １ ／ ｊ ． ｃ ｎ ｋ ｉ ． １ ６ ７ １ — ７ ２ ３ ６ ． ２ ０ １ ７ ． ０ ２ ． ０ ４ ３
（ ｋ ｏ ｉ ｈ ｅ ｒ ｐ ｅ ｓ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ， ＫＨＶ） 感染 ， 但经 Ｐ Ｃ Ｒ检 测 排 除 了 ＫＨＶ 感 染 。为 进 一 步 确 定 病 原 ， 对 发 病 鱼 进 行 了临 床 症 状 观 察、 病毒分离 、 细菌分离培养 、 病 鱼组 织超 薄切 片 电 镜 观 察 和 Ｐ Ｃ Ｒ 扩 增 等 检 测 。通 过 病 鱼 组 织 超 薄 切 片 电镜 观察 ， 在肾脏内可见 ２ ０ ０ ｎ ｍ×４ ０ ０ ｎ ｍ 的 痘 病 毒 样 颗 粒 。抽 提 病 毒 核 酸 后 ， 用 已知 的鲤 鱼浮 肿病 毒 （ ｃ ａ ｒ ｐ ｅ ｄ ｅ ｍａ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ， Ｃ Ｅ Ｖ） 的 保 守 序 列 设 计 ２对 引 物 进 行 Ｐ Ｃ Ｒ扩 增 ， 扩增 出 ５ ４ ８和 １ ８ ０ ｂ ｐ片 段 ， 测 序 结 果 和 Ｇｅ ｎ Ｂ ａ ｎ ｋ公 布 的 Ｃ Ｅ Ｖ Ｈ５ ０ ４株 序 列 完 全 一 致 。根 据 发 病 鱼 临床 症 状 和实 验 室 检 测 结 果 ， 最终确定该病为 Ｃ Ｅ Ｖ 引 起 的 鲤 鱼 浮肿 病 。 这 是
锦鲤疱疹病毒感染鲤鱼的动态病理损伤及病原组织分布
锦鲤疱疹病毒感染鲤鱼的动态病理损伤及病原组织分布
锦鲤疱疹病毒感染鲤鱼的动态病理损伤及病原组织分布*
何汶璐1#，李根1#，康慧敏1，何嘉乐1，杨壮志2，阳瑞雪1，汪开毓1，耿毅1，欧阳萍1 **
【摘要】摘要：【⽬的】研究锦鲤疱疹病毒(CyHV-3)感染鲤鱼的侵染规律与动态病理损伤，为CyHV-3致病机理的研究奠定实验基础，同时为有效防控锦鲤疱疹病毒病提供参考。
【⽅法】采⽤浸泡法对鲤鱼进⾏⼈⼯感染试验，于不同时间点剖检采样，进⾏动态病理学观察和荧光定量PCR检测，选择具有代表性的外部(鳃)和内部器官(肾脏)进⾏动态病理学观察。
【结果】鳃⼩⽚呼吸上⽪细胞增⽣严重并伴有⼤量炎症细胞浸润，肾脏主要表现为间质性肾炎，肾⼩管上⽪细胞变性坏死。
试验鱼在感染前期病毒含量最⾼的是鳃组织，肠道中未检测到病毒，随着感染时间的延长，各组织内的病毒含量逐步增加。
病毒感染10 d 后，鳃、肾脏以及脑组织的病毒含量达到最⾼值，随后病毒量保持稳定。
脾脏、肝脏和肠道中病毒含量的最⾼值出现在感染第14天。
【结论】CyHV-3在鲤鱼体内先⼊侵鳃组织，随后到达肾脏、脾脏等全⾝各组织器官中。
【期刊名称】云南农业⼤学学报
【年(卷),期】2018(033)005
【总页数】7
【关键词】锦鲤疱疹病毒；鲤鱼；病理损伤；病原组织分布
修回⽇期：2018-05-06 ⽹络出版时间：2018-10-13
*基⾦项⽬：中国博⼠后科学基⾦（2015M582563）；教育部留学回国⼈员科研启动基⾦[教外司留（2015）311号]。
⽹络出版地址：http：///doc/5917835637.html
/10.12101/j.issn.1004-。
鲤浮肿病检测方法实验室间比对的结果与评价
鲤浮肿病检测方法实验室间比对的结果与评价陈孝宇;陈鑫;王津津;范引光;曾宪东;郑剑【摘要】鲤浮肿病(carp edema virus disease,CEVD)是在锦鲤中发现的一种传染性病毒病,近年来在全球传播迅速,对鲤养殖业造成严重损害.本研究设计CEV环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)引物,进行特异性实验;选取套式PCR、荧光PCR和LAMP三种检测方法,组织10家实验室进行室间比对测试:制备含CEV病毒核酸的测试样品,评价其均匀性和稳定性,通过测试结果分析方法检出限.结果显示,套式PCR的核酸样品检测限可达6.8～10 g.【期刊名称】《淡水渔业》【年(卷),期】2019(049)002【总页数】5页(P71-75)【关键词】鲤浮肿病病毒;环介导等温扩增;实验室间比对;检出限【作者】陈孝宇;陈鑫;王津津;范引光;曾宪东;郑剑【作者单位】武汉海关,武汉 430050;武汉海关,武汉 430050;深圳海关,深圳518045;安徽医科大学公共卫生学院,合肥 230032;武汉海关,武汉 430050;武汉海关,武汉 430050【正文语种】中文【中图分类】S941.4鲤浮肿病毒(carp edema virus)于1974年在日本新泻的一个锦鲤养殖场首次发现，自2009年开始，在英国、法国、德国、波兰等欧洲国家，陆续发生了鲤科鱼类因感染CEV而爆发性死亡[1-3]。
在亚洲的印度和韩国也相继出现鲤浮肿病感染病例报道[4，5]。
2014年7月，在北京房山某养殖场发现鲤浮肿病临床症状疑似病例，经电镜观察和PCR产物测序及比对，确诊该病是由CEV感染引起的鲤鱼浮肿病[6]。
感染CEV的发病鱼身体浮肿，表现出强烈的嗜睡症状，浮于水面或沉入池底，器官水平可见鳃损害、凹眼、皮肤损害等症状，因此该病又被命名为锦鲤昏睡症(koi sleepy disease， KSD)，该病发病水温范围广，7～25 ℃均有报道。
实时定量方法与酶联免疫吸附试验方法对疱疹病毒的检验效果对比分析
实时定量方法与酶联免疫吸附试验方法对疱疹病毒的检验效果对比分析张全温;冯云【期刊名称】《中国现代药物应用》【年(卷),期】2012(006)015【摘要】目的探讨实时定量方法(PCR)与酶联免疫吸附试验(ELISA)方法对疱疹病毒的检验效果,并做出对比分析.方法选取我院2008年6月至2011年3月来皮肤性病门诊确诊的患者190例,其中单纯疱疹病毒感染患者140例分为观察组,分别采用实时定量方法和酶联免疫吸附试验方法对患者的血液以及分泌物、疱液进行检测,得出两种方法的结果阳性检查率.结果 140例患者分泌物、疱液中检测出的阳性率实时定量方法为87.2%,ELISA为44.8%,在血液标本中检测出的阳性率PCR为30.4%,ELISA为59.5%.对照组为50例,属于非疱疹病毒感染患者.结论 PCR在分泌物中检测出的结果比ELISA的检测率更高,PCR更具临床使用价值,不仅节省了时间,为疱疹病毒的诊断赢得了治愈的良好时机,其特异性好、敏感性强的优势值得在临床上广泛使用.另外需要注意的是,PCR不适合在血液中检测.【总页数】2页(P40-41)【作者】张全温;冯云【作者单位】454001,焦作市第二人民医院检验科;454001,焦作市第二人民医院检验科【正文语种】中文【相关文献】1.不同检验方法用于梅毒不同时期的敏感性和特异性的临床检验效果对比分析 [J], 黄海云;蔡召忠;徐小英2.实时定量方法与酶联免疫吸附试验方法对疱疹病毒的检验效果对照 [J], 骆海涛3.单纯疱疹病毒2型ICP4基因荧光实时定量PCR检测方法的建立 [J], 刘继峰;关翠萍;唐旭;徐田红;许爱娥4.实时定量荧光PCR检测人疱疹病毒6型方法的建立 [J], 廖维维;叶琇锦;何静松;5.酶联免疫吸附试验间接法检测水痘带状疱疹病毒IgG抗体方法的建立及应用 [J], 郑官增;朱智勇因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910275066.4
(22)申请日 2019.04.08
(66)本国优先权数据
201810886680.X 2018.08.06 CN
(71)申请人 北京市水产技术推广站
地址 102600 北京市大兴区北京经济开发
区科创十四街99号1幢
(72)发明人 张文 徐立蒲 吕晓楠
(74)专利代理机构 天津合正知识产权代理有限
公司 12229
代理人 吕琦
(51)Int.Cl.
C12Q 1/70(2006.01)
C12Q 1/686(2018.01)
C12N 15/11(2006.01)
(54)发明名称
鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光
定量检测方法
(57)摘要
本发明公开了一种鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹
病毒双重实时荧光定量PCR检测方法，该方法包
括以下步骤：第一、合成引物与TaqMan探针：根据
CEV P4a基因序列，对引物序列进行优化，
上游引物第1个碱基改为简并碱基W，下游引物第1个碱
基改为简并碱基R；根据KHV ORF7基因保守序列，
设计1对特异性引物和1条TaqMan探针；分别使用
FAM和VIC作为探针报告基团，BHQ1作为探针淬灭
基团；第二、确定反应体系及条件：采用20μL反
应体系，2×Probe PCR Master Mix 10μL，上、
下游引物和探针引物终浓度在0.2μmol/L～0.8
μmol/L之间，QN ROX参考染料0.1μL，模板2.5
μL，DEPC水补足20μL；反应程序为：95℃预变性
2min，1个循环；95℃5s，50～60℃退火31s，40个
循环。
权利要求书1页 说明书7页序列表1页 附图4页CN 109897918 A 2019.06.18
C N 109897918
A
权 利 要 求 书1/1页CN 109897918 A
1.一种鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一、合成引物与TaqMan探针：
根据CEV P4a基因序列，对引物序列进行优化，上游引物第1个碱基改为简并碱基W，下游引物第1个碱基改为简并碱基R；根据KHV ORF7基因保守序列，设计1对特异性引物和1条TaqMan探针；分别使用FAM和VIC作为探针报告基团，BHQ1作为探针淬灭基团；
第二、确定反应体系及条件：
采用20μL反应体系，2×Probe PCR Master Mix 10μL，上、下游引物和探针引物终浓度在0.2μmol/L～0.8μmol/L之间，QN ROX参考染料0.1μL，模板2.5μL，DEPC水补足20μL；反应程序为：95℃预变性2min，1个循环；95℃5s，50～60℃退火31s，40个循环。
2.如权利要求1所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，反应体系确定为：2×Probe PCR Master Mix 10μL，CEV上、下游引物终浓度0.6μmol/L，探针终浓度0.3mol/L，KHV上、下游引物终浓度0.4μmol/L，探针终浓度0.2μmol/L，QN ROX参考染料0.1μL；模板2.5μL，DEPC水补足20μL；反应程序为：95℃预变性2min，1个循环；95℃5s，56℃退火31s，40个循环。
3.如权利要求2所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，根据C E V P4a基因序列对引物序列进行优化后的C E V-R序列为RATTCCTCAAGGAGTTDCAGTAAA。
4.如权利要求3所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，根据C E V P4a基因序列对引物序列进行优化后的C E V-F序列为WGTTTTGTAKATTGTAGCATTTCC。
5.如权利要求4所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，探针CEV-Probe序列为FAM-AGAGTTTGTTTCTTGCCATACAAACT-BHQ1。
6.如权利要求2所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，根据KHV ORF7基因保守序列设计的引物KHV-R序列为CACGGATCTTCTATGCTACA。
7.如权利要求6所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，根据KHV ORF7基因保守序列设计的引物KHV-F序列为TTGTTGTGCGTTGATGTTC。
8.如权利要求7所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，探针KHV-Probe序列为VIC-CTTGACGGCACTCGTCGAGCCGTAGCCC-BHQ1。
9.如权利要求1所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法对CEV和KHV 的灵敏度为15copies/μL。
10.如权利要求1所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述的鲤浮肿病毒和锦鲤疱疹病毒双重实时荧光定量PCR检测方法与单重实时荧光定量PCR扩增所获得的Ct值的变异系数小于3％。
2。