基于核酸适配体的蛋白质研究新技术和新方法

项目名称：基于核酸适配体的蛋白质研究新技术和新方法首席科学家：谭蔚泓湖南大学起止年限：2011.1至2015.8依托部门：教育部二、预期目标总体目标:本项目针对当前蛋白质研究中存在的瓶颈问题，发展基于核酸适配体的蛋白质研究新技术新方法；以肝癌和食管癌为研究对象，面向我国社会发展中提高人类健康的重大需求，通过建立肝癌和食管癌相关蛋白的发现、分离分析、检测表征等新技术，探索肝癌和食管癌发生发展的分子机制，为恶性肿瘤等重大疾病早期诊断提供新技术和新方法。

通过开展多学科交叉与综合研究，形成具有原始创新的方法学突破及自主知识产权的蛋白质研究支撑平台，获得具有国际影响的重要研究成果，培养造就一支具有多学科知识和创新研究能力的研究队伍，促进我国在蛋白质研究领域达到国际领先水平。

五年预期目标：1. 阐明核酸适配体筛选过程的进化规律，建立针对蛋白质、细胞、组织等不同层次蛋白质靶标体系的高效率核酸适配体筛选技术平台，并筛选出针对肝癌和食管癌特异性标志物的核酸适配体15-30种。

2．揭示核酸适配体与蛋白质相互作用的分子机制，发展2-4种具有自主知识产权的系统研究核酸适配体分子识别的方法，为核酸适配体分子探针的设计、筛选、构/效关系和性能评价提供理论指导。

3. 发展高灵敏、高通量、高准确度的蛋白质定量检测的新原理、新方法，提出高效率、高重现性的蛋白质分离富集的新方法、新技术，研制出相应高通量、自动化的蛋白质分离及检测系统，对低丰度蛋白检测的灵敏度达到1 pg/mL及更低水平，为肿瘤的蛋白质生物标志物的发现、重大疾病的分子机制研究与早期诊断提供研究工具。

4. 建立肝癌、食管癌等恶性肿瘤体系的特征核酸适配体分子识别指纹图谱，发现4-5种特异性高的癌症标志物，并完成核酸适配体分子识别体系在癌症早期诊断中的临床意义评估, 开发具有自主知识产权的诊断系统。

5. 取得有国际影响的重要基础研究成果，提出有自主知识产权的新理论和新方法。

发表一批高水平、具有重要国际影响的学术论文。

申请并获得一批具有产业化前景的发明专利。

6. 在蛋白质研究领域培养一批具有化学与生物医学交叉学科综合知识的优秀人才队伍与中青年研究骨干。

通过项目协作，促进形成一支在核酸适配体相关领域具有国际领先水平的学术团队。

三、研究方案（一）总体思路（1）以肿瘤为研究模型，发展基于核酸适配体的蛋白质研究技术本项目从“国家中长期科学和技术发展规划纲要”中“人口与健康”等国家重大战略需求出发，以2008年度起蛋白质研究重大计划重要支持方向“蛋白质研究的新技术和新方法”——“核酸适配体识别等新技术新方法”为依据，发挥核酸适配体所具备的高特异性、高亲和力、高稳定性、便于化学修饰与功能化、易于大量低成本与可重复性合成等优势，以及可通过核酸适配体筛选发现未知蛋白标志物并获得病变体系特征分子图谱的优越性，开展核酸适配体分子识别基础研究，指导蛋白质分离与检测方法的设计与发展，建立高通量、高灵敏、高准确度的蛋白质研究新方法和新技术，为癌症早期诊断提供特异性蛋白质标志物、分子探针、分子识别传感器件，满足提升我国人民健康水平的需求。

（2）通过学科交叉，发展癌症早期诊治新方法随着核酸适配体、纳米生物探针、蛋白质组学研究方法的发展和成熟, 核酸适配体技术在恶性肿瘤等重大疾病诊治方面的应用正面临新的机遇。

利用我们在核酸适配体分子识别体系基础研究和蛋白质研究技术创新方面的优势，通过多学科交叉, 联合国内的优势单位组成跨学科的研究团队（包括化学、生物医学、蛋白质科学、纳米技术等学科），系统地开展基于核酸适配体的重大疾病蛋白质标志物发现与检测技术的基础研究，利用核酸适配体分子识别体系进行癌症等重大疾病的早期诊断，将核酸适配体分子识别体系在生物医学领域的应用潜力变成现实。

（二）技术路线：（1）核酸适配体筛选方法研究：构建大容量（1013至1015）的DNA和RNA分子文库，通过对核苷的2’位修饰或对磷酸骨架进行硫代修饰等，改善文库的生物稳定性。

优化筛选条件与流程。

对于已知的几种肝癌和食道癌相关蛋白质（如AFP、PIVKA-II、P53 Ab），采用体外表达纯化的蛋白质直接进行筛选，通过系统优化筛选压力，获得特异性高和亲和力强的核酸适配体；同时为了发现未知蛋白质标志物，以肝癌和食道癌细胞、癌组织作为正筛选靶标，甄别对应非癌细胞系、癌旁组织等做阴性对照进行反向筛选，优化筛选条件与流程。

对筛选出的核酸适配体进行测序、二级结构模拟分析、序列裁减，并表征其与靶标结合的亲和力和特异性。

通过针对大量不同样本的系统筛选，发现核酸适配体筛选过程中的进化规律，建立高效、快速、标准化的筛选方法。

（2）核酸适配体分子识别基础的研究：利用光谱技术、质谱技术、多维核磁共振和单分子探针技术揭示核酸适配体与靶蛋白质分子相互作用的构/效关系，深入研究生物分子识别规律。

通过化学计算、分子模拟和分子设计，进行适配体与靶分子对接分析与自适应识别研究，建立相关理论模型，并利用这些模型和机制评估、设计新的核酸适配体分子探针，为建立基于核酸适配体的蛋白质研究新方法提供理论依据与指导。

通过荧光标记与蛋白表达水平的同步检测，鉴定不同蛋白质靶标交叉识别与同一蛋白质靶标重复识别的核酸适配体分子识别模式，初步筛选出具有分子指纹价值的核酸适配体探针。

运用化学计量学与生物信息学方法，建立不同病变体系的核酸适配体特征分子识别图谱的数学模型，通过大量样品进行核酸适配体特征分子识别图谱的评价与优化，通过特征提取算法进一步精简模型的描述变量，最终确定具有重大疾病个性化诊断价值的核酸适配体。

（3）基于核酸适配体的蛋白质定量检测方法研究：基于上述筛选出来针对特定蛋白质分子的核酸适配体及其分子识别特性，设计构象互变型与链置换型荧光分子探针，发展均相、高通量的蛋白质定量检测新方法。

结合纳米生物技术和核酸适配体分子识别特性，制备多种灵敏、简便、经济的核酸适配体分子探针，考察探针对靶分子或靶细胞的识别能力，研究其相互作用的动力学过程，发展改善探针靶向识别性能的方法，并建立纳米探针凝集等蛋白质定量检测新原理。

综合运用各种纳米组装手段，结合核酸适配体化学修饰与功能化方法，开展自组装、原位沉积、物理插入、化学修饰等传感界面固定化方法研究，发展表面密度与取向可控的核酸适配体探针的固定化技术。

以微纳米技术为基础，研究制作基于核酸适配体的微纳米传感器、微阵列的方法。

探讨传感界面体系探针分子的负载量与仿生分子识别能力的关系，探索提高仿生分子识别体系纳米传感器、微传感器、微阵列和微芯片系统的重现性与稳定性的方法，抑制复杂生物体系中的交叉干扰现象。

在此基础上，研制压电、阻抗、表面等离子共振等无标记型高灵敏、高通量、高精度蛋白质定量检测新方法。

（4）基于核酸适配体的蛋白质分离与富集方法研究：对筛选出的肝癌与食道癌相关低丰度蛋白的核酸适配体进行生物素、巯基、氨基等化学修饰，利用表面修饰亲合素、羧基或环氧基的固相基质、纳米金等固定核酸适配体，研究固相表面修饰核酸适配体的密度，通过理论与实验分析其理论容量。

通过盐浓度、pH、温度，变性剂等条件的调节，考察核酸适配体对蛋白的吸附、洗脱条件以及分离基质的再生方法，提高蛋白质富集与去除的重现性，由此建立批间误差小、分离容量高的蛋白质富集与去除技术。

对于样品中高丰度蛋白质的去除，也将考察二氧化硅分离基质的制备，进一步提高高丰度蛋白质去除的容量与操作的简便性。

建立用于蛋白质分离与富集的微流控芯片技术，通过光刻法制备PDMS微流控芯片，通过在芯片上固定的核酸适配体与样品混合物的循环流动进行低丰度蛋白质的富集捕获。

此外，通过筛选磷酸化、泛素化与糖基化等翻译后修饰基团的核酸适配体，建立翻译后修饰蛋白质组的捕获与富集方法。

（5）恶性肿瘤等重大疾病蛋白质标志物发现与验证方法研究：从食管癌、肝癌的诊断入手，以12种食管鳞癌细胞系组成的细胞群、肝癌和食管癌病人的肿瘤组织标本等为正筛靶标，以正常细胞、癌旁组织为反筛样本，筛选特异性核酸适配体。

通过考察核酸适配体对大量食管癌、肝癌的细胞、组织及血清识别行为，系统评价所获得的核酸适配体对恶性肿瘤的特异性。

对于充分验证的特异性核酸适配体，将其修饰于微流控芯片或微珠表面，并连续与癌细胞或组织裂解产物进行温育以捕获对应的蛋白质标志物。

洗脱捕获的蛋白质采用生物质谱技术进行鉴定，甄别相应的蛋白质标志物。

对甄别出的蛋白质标志物，构建相关质粒，在细胞水平及动物模型中改变其表达，观察其表达改变后对细胞生长及动物模型存活的影响，探讨标志物分子在肿瘤发生中的作用，并以此发现与验证癌症发生、发展过程中的新型功能标志物及其表达与变化模式。

此外，以核酸适配体探针结合分子成像与流式细胞分析技术，研究相关标志物在病变体系的分布、定位、及动态变化情况，进行标志物的直观量化评估。

（6）恶性肿瘤等重大疾病早期诊断方法与发生发展分子机制研究：利用项目所筛选的肝癌、食管癌核酸适配体，通过对大量早期肿瘤患者、健康对照人群进行血清样本检测，探讨核酸适配体作为恶性肿瘤早期诊断指标的价值。

利用不同亚型和分期的食管癌、肝癌病理标本检测核酸适配体识别图谱在肿瘤分型诊断中的临床意义。

结合纳米生物技术，建立纳米金、量子点、多孔纳米材料、碳纳米管和磁性纳米粒子等纳米材料界面核酸适配体的可控固定化方案，由此构建电、光、磁等功能化纳米核酸适配体探针，建立基于这些分子探针的单个癌细胞的检测方法和对病变组织的高灵敏成像方法，以期用于肿瘤早期诊断。

利用生物探针和纳米生物传感器，开发基于液相芯片系统和金标-膜载体配合的核酸适配体快速诊断试剂和设备。

通过质谱技术和蛋白质序列比对、结构功能预测以及树状分类分析等生物信息学手段分析与核酸适配体结合的蛋白质的结构和功能，研究肿瘤发生发展的机理。

（三）创新点与特色本项目立足于项目组在化学、生物医学、蛋白质科学、纳米技术等方面良好的研究基础，结合项目组成员在核酸适配体、蛋白质研究和纳米生物领域取得的重要进展，尤其是核酸适配体的细胞筛选法和基于核酸适配体的蛋白质分离与检测方面的丰富积累，系统开展基于核酸适配体的蛋白质研究新技术与新方法的基础研究，具有以下多方面的创新性：1、核酸适配体筛选新方法方面：提出蛋白质分子、细胞、组织等多层次靶标的核酸适配体筛选与表征技术，通过核酸适配体的筛选实现正、负样品蛋白质组的成分差减，与传统的针对单一靶标的一次性筛选有本质的区别。

本项目在大量筛选肿瘤相关核酸适配体的同时，系统地研究与阐明核酸适配体筛选过程中的进化规律，从而建立高效、快速、标准化的筛选方法。

这些新筛选方法将成为疾病诊断、分子机制研究与疾病标志物发现、鉴定的新的重要资源。

2、蛋白质定量检测新方法方面：利用核酸适配体易于修饰与标记的特性，将核酸适配体转化为人工设计的多功能化生物分子探针。