核酸适配体ppt课件
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
9
核酸适配体的化学本质与识别 机理
核酸适配体的化学本质是核酸，它与配体的结合是基于单 链核酸结构和空间构象的多样性。在靶分子存在的条件下， 它可通过链内某些互补碱基间的配对以及静电作用、氢键 作用等自身发生适应性折叠形成发卡(hairpin)、假结 (pseudoknot)、凸环(stem loop)、G2四分体(G2quartet)等稳 定的三维空间结构。这样形成的适配体结构与靶分子之间 有较大的接触面积，能与靶物质的紧密结合，具有高亲和 力和高特异性。
1992年Ellington和Szostak又用相似的方法筛选出了可以和靶分 子特异性结合的单链DNA分子，从而证明了单链DNA也可以折 叠成特殊的三维结构，并暗示DNA可能也会具有催化活性。
1Tuerk C, Gold L. 1990. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment:
RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science 249:505–10；
2 Ellington AD, Szostak JW. 1990. In vitro selection of RNA molecules that bind
specificligands. Nature 346:818–22
APTAMER
适配体
1
Aptamers
(from the Latin aptus - fit, and Greek meros - part)
核酸适配体（Nucleic Acid aptamers） 多肽适配体（Peptide aptamers）
2
什么是核酸适配体？
核酸适配体是具有稳定的二级结构，能够和靶标分子特异性结合 的，人工合成的核酸。它可以是RNA 也可以是DNA，长度一般为 25~60个核苷酸。它是一系列单链核酸分子，与长度相同的特异靶 分子相结合，特异性如同抗体一样，对可结合的配体有严格的识别 能力和高度的亲和力。核酸适配体可以结合的靶分子有小分子、蛋 白、细菌、病毒、细胞和组织等。
经过SELEX技术反复筛选的适配体能与靶分子以极高的亲 和力和特异性相结。核酸适体与靶物质亲和力极高，kd值 多在pmol/L-nmol/L之间。
10
源自文库 11
Structure of an RNA aptamer specific for biotin. The aptamer surface and backbone are shown in yellow. Biotin (spheres) fits snugly into a cavity of the RNA surface
6
自然界中Aptamer存在的证据： Riboswitches
Riboswitches: the oldest mechanism for the regulation of gene expression
核糖开关是2002年，由耶鲁大学的分子生物学家 Ronald Breaher和他的同事在受Andrew等人的研究成果 启发下发现并命名的，它是能够与代谢物或其他小分子配 体结合，通过构象变化调控目的基因转录或翻译的RNA结 构元件。
12
核酸适配体的筛选策略
核酸适配体的体外筛选是利用SELEX技术（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) ）来 完成的，SELEX是指数富集配体系统进化的简称，它的基 本原理就是就是利用分子生物学技术，构建人工合成的单 链随机寡核苷酸文库，其随机序列长度在20～100个碱基左 右．将随机寡核苷酸文库与靶分子相互作用，保留结合的 寡核苷酸配基(aptamer) ，经反复扩增、筛选数个循环，即 可使与该靶分子特异结合的寡核苷酸序列得到富集。
7
Aptamer巨大的应用前景
APTAMERS: AN EMERGING CLASS OF THERAPEUTICS（.Annu. Rev. Med. 2005. 56:555–83）
Analytical Applications of Aptamers(Andrew D. Ellington .Annual Review of Analytical Chemistry (2008). Volume 1, Jul 2008)
8
核酸适配体的第一个临床应用
2005年12月20日，美国FDA宣布批准哌加 他尼钠注射液（Macugen）用于治疗眼科 疾病新生血管型（湿性）老年黄斑病变 （Age-Related Macular Degeneration， AMD）患者的视力缓慢丧失。
Macugen是一种选择性血管内皮生产因子 （vascular endothelial growth factor， VEGF）拮抗剂。
5
生命活动的基础是什么？-Binding!
如果我们都能找出一个有相当强亲和性和特异性的RNA序列，那 我们就向证明"RNA起源说"迈出了一步。
1990年，两个研究组几乎同时用T4 DNA polymerase与几种有 机染料做靶分别筛选出了特异性结合的RNA分子，并把这种 RNA叫做aptamer。
13
SELEX筛选流程
首先，确立筛选方法。根据不同的配体选择具有不同特性 的适配体并以此确定具体的适配体筛选方法；
其次，建立筛选文库。人工建立一个约含有1015个不同寡 核苷酸的随机序列库，随机序列的两端为固定序列，是之 后PCR循环中要用的，如果是筛选RNA-aptamer，要在5´ 端引物中加上一段T7启动子，以便识别转录过程中所需要 的T7 RNA聚合酶，把靶分子加入到该库中，充分结合后， 将与靶分子结合的寡核苷酸序列分离出来。
3
核酸适配体概念的提出
1989年，悉尼·奥尔特曼、托马斯·切赫因为对RNA的催化 作用的研究共同获得诺贝尔化学奖。
4
支持RNA为生命起源假说的可能证据：
如果我们能找到完全或者主要依赖RNA进行生命活动的生 物；
如果在现存生物的基因组里找到负责基本生命活动的功能 性RNA的"痕迹"；
如果我们能够从随机RNA序列库中筛选到能够完成基本生 命活动的RNA序列。
核酸适配体的化学本质与识别 机理
核酸适配体的化学本质是核酸，它与配体的结合是基于单 链核酸结构和空间构象的多样性。在靶分子存在的条件下， 它可通过链内某些互补碱基间的配对以及静电作用、氢键 作用等自身发生适应性折叠形成发卡(hairpin)、假结 (pseudoknot)、凸环(stem loop)、G2四分体(G2quartet)等稳 定的三维空间结构。这样形成的适配体结构与靶分子之间 有较大的接触面积，能与靶物质的紧密结合，具有高亲和 力和高特异性。
1992年Ellington和Szostak又用相似的方法筛选出了可以和靶分 子特异性结合的单链DNA分子，从而证明了单链DNA也可以折 叠成特殊的三维结构，并暗示DNA可能也会具有催化活性。
1Tuerk C, Gold L. 1990. Systematic evolution of ligands by exponential enrichment:
RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase. Science 249:505–10；
2 Ellington AD, Szostak JW. 1990. In vitro selection of RNA molecules that bind
specificligands. Nature 346:818–22
APTAMER
适配体
1
Aptamers
(from the Latin aptus - fit, and Greek meros - part)
核酸适配体（Nucleic Acid aptamers） 多肽适配体（Peptide aptamers）
2
什么是核酸适配体？
核酸适配体是具有稳定的二级结构，能够和靶标分子特异性结合 的，人工合成的核酸。它可以是RNA 也可以是DNA，长度一般为 25~60个核苷酸。它是一系列单链核酸分子，与长度相同的特异靶 分子相结合，特异性如同抗体一样，对可结合的配体有严格的识别 能力和高度的亲和力。核酸适配体可以结合的靶分子有小分子、蛋 白、细菌、病毒、细胞和组织等。
经过SELEX技术反复筛选的适配体能与靶分子以极高的亲 和力和特异性相结。核酸适体与靶物质亲和力极高，kd值 多在pmol/L-nmol/L之间。
10
源自文库 11
Structure of an RNA aptamer specific for biotin. The aptamer surface and backbone are shown in yellow. Biotin (spheres) fits snugly into a cavity of the RNA surface
6
自然界中Aptamer存在的证据： Riboswitches
Riboswitches: the oldest mechanism for the regulation of gene expression
核糖开关是2002年，由耶鲁大学的分子生物学家 Ronald Breaher和他的同事在受Andrew等人的研究成果 启发下发现并命名的，它是能够与代谢物或其他小分子配 体结合，通过构象变化调控目的基因转录或翻译的RNA结 构元件。
12
核酸适配体的筛选策略
核酸适配体的体外筛选是利用SELEX技术（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment) ）来 完成的，SELEX是指数富集配体系统进化的简称，它的基 本原理就是就是利用分子生物学技术，构建人工合成的单 链随机寡核苷酸文库，其随机序列长度在20～100个碱基左 右．将随机寡核苷酸文库与靶分子相互作用，保留结合的 寡核苷酸配基(aptamer) ，经反复扩增、筛选数个循环，即 可使与该靶分子特异结合的寡核苷酸序列得到富集。
7
Aptamer巨大的应用前景
APTAMERS: AN EMERGING CLASS OF THERAPEUTICS（.Annu. Rev. Med. 2005. 56:555–83）
Analytical Applications of Aptamers(Andrew D. Ellington .Annual Review of Analytical Chemistry (2008). Volume 1, Jul 2008)
8
核酸适配体的第一个临床应用
2005年12月20日，美国FDA宣布批准哌加 他尼钠注射液（Macugen）用于治疗眼科 疾病新生血管型（湿性）老年黄斑病变 （Age-Related Macular Degeneration， AMD）患者的视力缓慢丧失。
Macugen是一种选择性血管内皮生产因子 （vascular endothelial growth factor， VEGF）拮抗剂。
5
生命活动的基础是什么？-Binding!
如果我们都能找出一个有相当强亲和性和特异性的RNA序列，那 我们就向证明"RNA起源说"迈出了一步。
1990年，两个研究组几乎同时用T4 DNA polymerase与几种有 机染料做靶分别筛选出了特异性结合的RNA分子，并把这种 RNA叫做aptamer。
13
SELEX筛选流程
首先，确立筛选方法。根据不同的配体选择具有不同特性 的适配体并以此确定具体的适配体筛选方法；
其次，建立筛选文库。人工建立一个约含有1015个不同寡 核苷酸的随机序列库，随机序列的两端为固定序列，是之 后PCR循环中要用的，如果是筛选RNA-aptamer，要在5´ 端引物中加上一段T7启动子，以便识别转录过程中所需要 的T7 RNA聚合酶，把靶分子加入到该库中，充分结合后， 将与靶分子结合的寡核苷酸序列分离出来。
3
核酸适配体概念的提出
1989年，悉尼·奥尔特曼、托马斯·切赫因为对RNA的催化 作用的研究共同获得诺贝尔化学奖。
4
支持RNA为生命起源假说的可能证据：
如果我们能找到完全或者主要依赖RNA进行生命活动的生 物；
如果在现存生物的基因组里找到负责基本生命活动的功能 性RNA的"痕迹"；
如果我们能够从随机RNA序列库中筛选到能够完成基本生 命活动的RNA序列。