新型肠道病毒空斑实验在猴轮状病毒中的应用效果观察
肠道病毒感染病例标本的处理细胞接种和观察
人肠道病毒传播方式
• > 粪-口Байду номын сангаас径传播: 唾液与粪便
• > 呼吸道传播: 空气飞沫 • > 接触传播:一般人肠道病毒在呼吸道 飞沫中可存留约一至三周，而经胃肠 道的粪便排泄可达到二至三个月以上。
6
病毒的组织培养
• 所有已知的人肠道病毒都可以在组织细胞 培养或乳鼠中繁殖； • 大部分血清型可以在1种以上的人源传代细 胞中生长； • 但是没有哪一种细胞可以支持所有的人肠 道病毒生长； • 研究至今，一些血清型（如Cox A1病毒） 只能在乳鼠中繁殖。
肠道病毒感染病例标本的处 理、细胞接种和观察
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人肠道病毒简介和分类
• • • • • • • • • • •小核糖核酸病毒科（Picornaviridae）的成员，主要 在肠道内复制, 但可感染各个系统和器官。 •单正链的无包膜RNA病毒，RNA有感染性。 •小球形病毒（~ 30 nm）， 20面体对称结构。 •衣壳有VP1-VP4四种蛋白，VP1-VP3分布在表面， VP4与内部RNA结合。 •与鼻病毒不同的是，它们在酸性环境中稳定。 •在胞浆增殖，有明显CPE，破胞释放。 •引起多种疾病：麻痹性疾病、无菌性脑膜炎、心肌 损伤、手足口病，结膜炎，皮疹等。
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实验室检测方法
• 临床怀疑：夏秋季，婴幼儿、皮疹、接触、脑膜 炎 • 实验室的检测方法包括： • 1)血清抗体的变化： 血清抗体4倍变化 • 2)病毒培养及鉴定：理想（金标准）但费时费力， 且部分肠病毒型别不易培养 • 3)组织病理切片检查 • 4)分子生物学检测，RT-PCR，RealTime PCR， 分子杂交等 • 5)快速抗原检测：芯片
• （四）疱疹液：在手足口病的实验室诊断中，从疱疹液中分离到 病毒具有很高的诊断价值，可同时采集多个疱疹作为一份标本。 先用75%的酒精对疱疹周围的皮肤进行消毒，然后用消毒针将疱 疹挑破用棉签蘸取疱疹液，迅速将棉签放入内装有3~5ml保存液 （维持液或生理盐水，推荐使用维持液）的采样管中，在靠近顶 端处折断棉签杆，旋紧管盖并密封。所采集标本4℃暂存立即 （12h内）送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存 的标本存于－70℃冰箱。 • （五）脑脊液标本：出现神经系统症状的病例，要采集脑脊液标 本，进行病原和抗体检测，从脑脊液中分离病毒也具有很高的诊 断价值。采集时间为出现神经系统症状后3天内，采集量为 1.0~2.0ml。采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，4℃暂存立 即(12h内)送达实验室，－20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存 的标本存于－70℃冰箱。 • （六）病例密切接触者的标本采集：选择典型病例所在的托幼机 构、或所在村，以新发病例密切接触者为采样对象，采集单份粪 便和血清标本。 • （七）健康对照的标本采集：选择患儿发病所在社区（村）的临 近无病例的社区（村）或托幼机构。采集5岁以下的儿童单份粪 便和血清标本。 12
猴轮状病毒的灭活、纯化及抗原性鉴定
猴 轮 状 病 毒 的灭 活 、 纯 化 及 抗 原 性 鉴 定
刘 馨， 张永 欣 ， 孙 茂 盛
摘 要 ： 目 的 探 讨 经 ０丙 内酯 灭 活 的 猴 轮 状 病 毒 Ｓ ＡＩ １的 抗 原 性 。 方 法 将 猴 轮 状 病 毒 适 应 到 ｖ ｅ ｒ ｏ细 胞 上 ， 用 Ｂ丙 内 酯灭 活 后 ， 接 种 ＭＡ１ ０ ４ 细 胞， 鉴定 灭 活 效 果 ， 经超 滤 浓 缩 、 凝胶过 滤后 ， 加 入 弗 氏 完全 佐 剂 免 疫 豚 鼠， 确 定 豚 鼠产 生 的 中和 抗 体 效 价 。结 果 利 用 Ｄ丙 内 酯 在 ４ ＂ Ｃ作 用 ２ ４ 、 ４ ８ 、 ７ ２或 ９ ６ ｈ ， 可 以有 效 的 灭 活 轮 状 病 毒 Ｓ Ａ Ｉ １ ， 通 过 凝 胶 过 滤 可得 到初 步 纯 化 的
中国医学科学院医学生物学研究所昆明650118万方数据中国人兽共患病学报cbinesejournalzoonoses3792结果21病毒的扩增猴轮状病毒sall在vero细胞上得到了有效的扩增在培养的第三d即可观察到明显的cpe图1第四d至第五d即可收获病毒
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轮状 病毒 ， 以１ － ３ ３ ｍｇ ／ ￣ 的剂 量 与 弗 氏 完全 佐 剂 混 合 免 疫 豚 鼠 后 ， 中和 抗 体 的 滴 度 为 １：１ ０ ２ ４ 。结 论 用 ｐ丙 内酯 可 以 有 效
的灭活轮状病毒。 关键 词 ： 轮状病毒 ； 灭活方法 ； 纯化； 抗 原 性 中图分类号 ： Ｒ ３ ７ ３ 文献标识 码： Ａ
ｏ ｂ ｔ ａ ｉ ｎ ｅ ｄ ａ ｆ ｔ ｅ ｒ ｐ ｕ ｒ ｉ ｆ ｉ ｃ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｂ ｙ Ｓ ｅ ｐ ｈ ａ ｒ ｏ ｓ ｅ ｃ ｈ ｒ ｏ ｍａ ｔ ｏ ｇ ｒ ａ ｐ ｈ ｙ ．ａ ｎ ｄ １ ． ３ ３ ｍｇ ｏ ｆ ｔ ｈ ｅ ｓ ｅ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ｐ ｒ ｅ ｐ ａ ｒ ａ ｔ ｉ ｏ ｎ ｗｅ ｒ ｅ ｔ ｏ ｂ ｅ ｕ ｓ ｅ ｄ ｔ ｏ ｉ ｎ ｏ ｃ ｕ ｌ ａ ｔ ｅ 共 患 病 ｏＤ 学 报 Ｃｈｉ ｎ ｅ ｓ ｅ Ｊ ｏ ｕｒ ｎ ａ ｌ ｏ ｆ Ｚｏ ＿ ｏｓ ｅ ｓ
大学微生物学考试(习题卷2)
大学微生物学考试(习题卷2)第1部分：单项选择题，共79题，每题只有一个正确答案,多选或少选均不得分。
1.[单选题]对空间灭菌可以采用的方法是A)紫外线B)高压蒸汽C)煮沸法D)烧灼法答案:A解析:2.[单选题]必须增强______,自觉维护党中央权威和集中统一领导,自觉在思想上政治上行动上同党中央保持高度一致。
( )A)政治意识、大局意识、核心意识、看齐意识B)政治意识、大局意识、权威意识、看齐意识C)政治意识、全局意识、核心意识、看齐意识D)政治意识、全局意识、权威意识、看齐意识答案:A解析:3.[单选题]把毛泽东思想确立为党的指导思想是在( )A)瓦窑堡会议B)六届七中全会C)遵义会议D)党的七大答案:D解析:4.[单选题]病毒纯化方法均是根据病毒的基本理化性质建立的,包括()A)病毒的核酸是DNA或是RNAB)病毒的主要化学组成是蛋白质C)病毒含有脂类和糖类D)病毒体积小答案:B解析:5.[单选题]大 多 数 微 生 物 的 营 养 类 型 属 于:A)光 能 自 养B)光 能 异 养C)化 能 自 养D)化 能 异 养答案:D解析:6.[单选题]不论过去、现在和将来,( )都是我们党的生命线和根本工作路线。
A)群众路线C)实事求是D)统一战线答案:A解析:7.[单选题]E.coli T4噬菌体的典型外形是( )。
A)球形B)蝌蚪形C)杆状D)丝状答案:B解析:8.[单选题]自2016年起,每年4月15日,是我国的( )。
A)中国航天日B)全民国家安全教育日C)国家宪法日D)国家精准扶贫日答案:B解析:9.[单选题]单纯扩散和促进扩散的主要区别是( )。
A)物质运输的浓度梯度不同B)前者不需能量,后者需要能量C)前者不需要载体,后者需要载体D)两者需要消耗能量答案:C解析:10.[单选题]微生物在以下那种自然环境中分布的数量和种类最多A)土壤B)空气C)淡水D)海水答案:A解析:11.[单选题]引起艾滋病的病毒为A)HIVB)HAVC)HBVD)HCV答案:A解析:12.[单选题]酿酒酵母菌的有性孢子是:A)卵孢子B)子囊孢子C)担孢子D)无有性孢子解析:13.[单选题]经过呼吸道传播的微生物是A)结核杆菌B)大肠杆菌C)痢疾杆菌D)破伤风杆菌答案:A解析:14.[单选题]真酵母进行有性生殖时产生( )。
3.21单磷酸阿糖腺苷治疗婴幼儿轮状病毒肠炎临床疗效观察(1)
单磷酸阿糖腺苷治疗婴幼儿轮状病毒肠炎临床疗效观察摘要研究目的：轮状病毒为双链RNA病毒，是世界范围内婴幼儿重症肠炎的主要病因，平均每年大约有200万儿童因轮状病毒感染住院、有44余万的儿童死于轮状病毒感染。
1999年，唯一被批准上市的四价恒河猴轮状病毒疫苗因服用后肠套叠的发生率增高而被迫退出市场，阻碍了该病的预防。
迫切需要积极有效的治疗方法以降低死亡率。
既往认为轮状病毒感染仅局限于胃肠道，死亡原因是脱水和酸中毒，因此治疗措施主要为静脉和口服补液，不主张用抗轮状病毒药物。
但最近研究发现轮状病毒可逃逸出胃肠道，通过血液循环到达全身组织器官，导致胃肠外感染;并在一些轮状病毒死亡患儿的胃肠外组织包括脑脊液、肝、肾等组织中检测到了轮状病毒抗原，推测病毒血症可能是导致死亡的另一重要原因;此外，重症轮状病毒肠炎患儿在症状消失后仍能长时间排毒，是重要的传染源;这些事实提示特异性抗轮状病毒治疗的必要性。
但目前尚无有效的抗轮状病毒的药物。
单磷酸阿糖腺苷韦是具有广谱抗病毒活性的核昔类化合物，可高效抑制DNA病毒，治疗婴儿巨细胞病毒相关性疾病有特异疗效、安全性高，对部分RNA 病毒有抑制作用，而对轮状病毒的作用尚不清楚。
有报道单磷酸阿糖腺苷治疗轮状病毒肠炎可提高治愈率、缩短病程。
本研究通过随机对照试验及大便轮状病毒排泌情况的动态观察以进一步证实单磷酸阿糖腺苷对轮状病毒的抑制作用。
研究方法：根据研究要求，设立轮状病毒肠炎患儿110例，病例来源于2014年9月～2015年3月我院儿科门诊及病房病人。
1.对象和分组：选择年龄在6月~2岁，病程2天以内、具有典型症状、大便轮状病毒抗原阳性的患儿共110例作为研究对象，按入院先后顺序随机分为治疗组和对照组。
治疗组予单磷酸阿糖腺苷针剂5-10mg/kg.d，加入1/2张葡萄糖盐溶液100ml中静滴，维持1小时以上，一日一次，连用3天;对照组不用任何抗病毒药物，两组其他治疗措施相同。
肠道病毒71型感染动物模型研究进展
肠道病毒71型感染动物模型研究进展赵杰;张国梁【期刊名称】《安徽医学》【年(卷),期】2012(033)009【总页数】3页(P1249-1251)【关键词】肠道病毒71型;动物模型;研究进展【作者】赵杰;张国梁【作者单位】230038,合肥,安徽中医学院中医内科学2010级;230038,合肥,安徽中医学院第一附属医院传染科【正文语种】中文手足口病是婴幼儿常见传染病，临床以手足口等部位出现疱疹、发热、咽痛等为主要表现，病原体为肠道病毒，其中人类肠道病毒71型(EV71)所引起的手足口病较易出现伴有中枢神经系统损伤的严重病例［1］。
目前临床尚无疫苗用于预防该病毒感染。
由于人类是肠道病毒唯一宿主，制约了对该病的进一步深入研究。
近年来，有些多学者开展了幼年不同种类动物的模型研究，为进一步深入开展EV71致病机制、疫苗、药物作用评价等方面提供了可能。
肠道病毒71型(enterovirus 71，EV71)是目前肠道病毒群中最晚发现的病毒，1969年首次被美国学者从患有中枢神经系统疾病的婴儿粪便中发现，但直到1974年Schmidt等［1］才将其与手足口病联系起来。
迄今为止，该病毒已在全球范围内多次引起大规模暴发流行［2－3］，对公众健康构成严重威胁，引起了社会各界的广泛关注和高度警惕。
EV71的发病机制，病毒与宿主之间的相互关系，病毒不同基因型别、变异株与致病性之间的关系，以及是否存在交叉保护作用等诸多问题目前尚无定论，制约其发展的一个最主要原因是人类是肠道病毒唯一宿主，缺乏适宜的动物模型来开展相关研究。
近年来国内外许多学者根据EV71生理特性，开展了幼年不同种类动物模型的研究，取得了一定进展，为进一步开展针对EV71各种机制研究奠定了基础，现将EV71动物模型研究概况综述如下。
1 EV71简介EV71属于小RNA病毒科(picornaviridae)肠道病毒属(enterovirus)。
病毒颗粒为20面体对称的球形结构，直径24～30 nm，无包膜和突起，对去污剂、乙醚、脱氧胆酸盐和弱酸有抵抗力。
猕猴腹泻症“轮状病毒病”油剂灭活疫研制与免疫效果观察报告
化， 即为 油 包 水 乳 剂 疫 苗 。 检验合格 后 ， 在无
月 １ ０日分 别 发 现 ３只 猴 患 病 ， 抢 １ １ ４ 胶 体 磨 经 ．．
救无 效于 １ ２月 ５ 日 至 １ １日 死 亡 。
牛 （ ｉ ｎ 、 、 兔 、 、 的分 离 小 肠 粘 膜 及 内容 物 收 集 病 毒 并 进 一 后 再 选 ２只 中年 健 康 猕 猴 各 自肌 肉 Ｂｓ ） 鹿 家 ｏ 犬 禽 浓 经 Ｌ， ２ｄ 均 株 ，其 中多 数 有 群 间抗 原 性 。轮 状 步 分 离 、 缩 ， 电镜 负染 与 真 染 切 注 射 灭 活 毒 液 ２ｍ 观 察 １ ， 健
菌 性 腹 泻 的 主要 病 原 之 一 。１ ６ ９ ８年 内容 物 ，经 电镜 负 染 观察 小 肠 内 容 分 振 荡 混 匀 ， ４Ｉ２ ， 隔 ２ｌ 置 ｃ ４ｈ 每 二 Ｉ振 ４ｈ无 ．８ 美 国、 国、 英 日本 、 大 利 亚 、 西 兰 物 ， 澳 新 明显 看 到 较 多 的轮 状 病 毒 粒 子 ， 摇 一 次 。 ２ 菌 后 ，用 ０ ３ ％ 甲
诊 为典 型轮 状病毒粒 子 时， 拟作 为制苗抗原 ， 试制猕猴 “ 状病毒病 ” 轮 油佐剂灭 活疫 苗 ， 为防治猴轮状病毒 病提
供保 障。
关键 词
猕猴
轮 状病毒
分 离鉴 定
灭 活 疫 苗
％ 轮 状 病 毒 是 各 种 幼 龄 动 物 非 细 集 病 死 猴 的肝 、 、 巴及 小 肠 和 肠 网过 滤 和 浓 缩 后 ，加 入 ２ 氯 仿 充 脾 淋
Ｐ Ｓ 生 理 盐 水 、 氯 １ ２ ２ １ 用 ９ ％ 白 油 与 ６ 司 本 Ｂ、 ． ． ． ４ ％
应用金标免疫斑点法快速诊断轮状病毒感染及临床意义
２０ ０ ０年 １月 ～２ ０ ０ １年 ２月急 性 腹
泻 婴 幼 儿 粪 便 标 本 共 １４份 。 ４ １２ 实 验 器 材 ． １２ １ 标 本 吸 管 ： ０支 ／ ， 吸 取 粪 便 浸 出液 。 ．． ４ 盒 供 １２ ２ 斑 点 反应 板 ：４ ．． ０块 、 效 成 份 ： 有 固体 抗 体 。
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第 ２期 ３ 讨 论
河 南 职 工 医 学 院 学 报
［ 章 编 号 ］ １０ 文 ０８—９ ７ （０２ ０ ２６ ２ ０ ）２—０ ６ １４—０ ２
第 １ ４卷
３ １ 机 会 致 病 菌 的 致 病 因素 弗 劳 地 枸 橼 酸 杆 菌 、 ． 克雷 伯 杆 菌 、 绿 假 单 胞 菌 等 ， 泛 分 布 于 自然 界 ， 铜 广
液； 试剂 Ｂ １ （０ｍ ） 有效 成份 ： 体金 标记抗 体 。 ： 瓶 １ Ｉ， 胶
１２ ４ ．． 阳 性 对 照 板 ：一 组 。
索 新 的 有 效药 物 。近 期 有 人 应 用 磷 霉 素 治 疗 革 兰 氏
阴性 菌 所 致 腹泻 疗 效 满 意 ， 有 待 总 结 临床 经 验 。 而
诊 断 轮 状 病 毒 感 染 及 临 床 意 义
王文洁 周明锦
（ 南 省 郑州 市 儿童 医 院 河 郑州 ４０５ ） ５０ ３
金标免疫 斑点 法 是采用 对 人类 轮状 病毒 敏感 、 特 异 性 较 好 的 单 克 隆 抗 体 （ Ｈ Ｖ， 要 是 外 壳 蛋 抗 Ｒ 主
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
白 ｖ ＇ 结 合 金 标 免 疫 的 技 术 。 该 法 可 检 测 粪 便 中 ｒ） ４
１２３ 试 剂 ．． 试 剂 Ａ： 瓶 （０ｍ ）有 效 成 份 ： Ｂ １ １ １ ， Ｐ Ｓ缓 冲
轮状病毒感染干扰素相关作用的研究进展
别，通过一系列信号转导事件激活转录因子 Ｉ Ｒ Ｆ ３ 、 过Ｎ Ｓ Ｐ 一 １ 蛋白 使干扰素调节因子（ Ｉ Ｒ Ｆ ） ． ３ 、 Ｉ Ｒ Ｆ 一 ５ 、 Ｉ Ｒ Ｆ － ７ Ｎ Ｆ ． ｒ ｄ ３ 和Ａ Ｐ 一 １ ， 激活的转录 因子转移至细胞核起始 退化、 抑制核转录因子（ Ｎ Ｆ ） － ｖ ｄ ３ 激活达到对抗天然免
２ Ｉ Ｉ 型Ｉ Ｆ Ｎ 及相 关作用
Ｉ Ｉ 型Ｉ Ｆ Ｎ为 Ｉ Ｆ Ｎ － 丫 ， 虽然有一定的抗病毒活性，
但 目前主要认为Ｉ Ｆ Ｎ． Ｙ 是强的免疫调节细胞因子， 主 要 由活化的 Ｔ细胞和 自然杀伤细胞产生， 它通过识
（ 下转 第 １ ３ ３ ７页）
组委员， 浙江省医学会儿科学分会常务委 员， 浙江省医学会儿科学分
Ｆ Ｎ ， 刺激基 Ｎ（ Ｉ Ｓ Ｇ ） 的转录。 Ｉ Ｆ Ｎ信 号转导 超过 ３ ５～５ ９ 万儿童死于Ｒ Ｖ感染， 几乎每个儿童 ４ 最终激活 Ｉ
Ａ Ｋ ／ Ｓ Ｔ Ａ Ｔ ， 但机体 为产生更强更特异的 岁以前都受过 Ｒ Ｖ感染。预防和控制 Ｒ Ｖ感染有赖 通路主要为Ｊ
Ｆ Ｎ信号还与 Ｐ １ ３ Ｋ途径、ＭＡ Ｐ激酶途径和 于对其发病机制的阐明， 但目 前 尚不十分清楚。Ｒ Ｖ 应答 ，Ｉ Ｋ Ｃ途径有关。Ｉ Ｆ Ｎ信号转导通路的多途径与其多 介导的免疫反应 ， 尤其是 Ｔ细胞和 Ｂ细胞相关的研 Ｐ
・ １ ３ ３ ４ ・
Ｍｏ ｄ ｅ ｍ Ｐ ｒ ａ ｃ ｔ ｉ ｃ ａ ｌ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ｉ ｎ ｅ ，Ｎ ｏ ｖ ｅ ｍ ｂ ｅ ｒ ２ ０ １ ４ ， Ｖ ｏ １ ． ２ ６ ， Ｎｏ ． １ １
可视环介导恒温扩增技术检测实验猴小肠结肠炎耶尔森菌
摘要 ：本研究在传统环介导恒温扩增反应体 系中引入羟基萘酚蓝指示剂 ，对反应体系进行 高温 一低温前处 理和添加 甜 菜碱等优化措施提高试验敏感性 ，液面覆盖矿物油降低气溶 胶污染 ，据 此建立的猴小肠结 肠炎耶 尔森 菌可视 ＬＡＭＰ检测 方 法结果判定直观明了 ，敏感度为 ６ ＣＦＵ／反应 ，无非异性 。
收 稿 日期 ：２０１７—０２—２０ 柴金项 目：同家质检总局科技计划项 目（２０１６ＩＫ０７２） 作 者 简 介 ：温 和 心 （１９７７一），男 ，兽 医 师 ，硕 士 ，从 事 动 物 检 疫 Ｊ了科 研 工 作 ，Ｅ—ｍａｉｌ：ｗｅｎｓｏｍｅｗｈｘ＠ １６３ （￣ｏｎｌ
中加 入指示 剂 ，可 以 目测反 应 结果 ，既免 除产 物 电泳 步骤 ，又减少 产物 污染 ，克服 ＬＡＭＰ技 术 易污 染 的缺 点 ，更好地发挥 ［ＡＭＰ技术 的优 势 。把 可视 ＬＡＭＰ技 术应用于小肠结 肠炎耶尔森菌 的快 速检测 ，解决 阿 小肠结肠炎 耶尔森菌检疫 ，意义重 大。
ＷＥＮ Ｈｅ．ｘｉｎ ， ，ＬＯＮＧ Ｙｉｎｇ．ｑｕａｎ ，ＪＩＡＮＧ Ｒｏｎｇ．ｈｕａ ，ＰＡＮ Ｂａｏ—ｊｉｎ ， ＬＵＯ Ｇｕａｎｇ—ｓｈｅｎｇ ，ＣＨＥＮ Ｌｉ－ｊｕｎ
（１．Ｇｕｉｇａｎｇ Ｅｎｔｒｙ—ｅｘｉｔ ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ ｂｕｒｅａｕ，Ｇｕｉｇａｎｇ ５３７１００，Ｃｈｉｎａ ；２．Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｋｅｙ Ｐｒｉｍａｔｅ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ， Ｎａｎｎｉｎｇ ５３００００，Ｃｈｉｎａ；３．Ｙｕｌｉｎ Ｅｎｔｒｙ—ｅｘｉｔ ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ ｂｕｒｅａｕ，Ｙｕｌｉｎ ５３０００２，Ｃｈｉｎａ）
４Ｏ 【ｆＪ困兽医杂志 ２０１８年（第 ５４卷）第 １期
病毒唑穴位注射治疗轮状病毒肠炎疗效观察
2 结果 2.1 血糖指标 试验组患者治疗后的空腹血糖与餐后 2 h 血糖水平均比对照组低（P<0.05），见表 1。
表 1 2 组患者治疗后血糖水平对比（x±s，mmol/L）
260
芪、泽泻、丹参、太子参与茯苓等中草药，其中，太子参具备滋阴 生津与清热凉血之功效，红花具备通利血脉与活血化瘀之功效， 丹参具备活血补血之功效。诸药配合，可起到活血化瘀与益气养 阴等作用，有助于促进糖尿病肾病患者相关症状的缓解，改善肾 功能指标。本文试验组的临床总有效率比对照组高（P<0.05），治 疗后空腹血糖与餐后 2h 血糖水平比对照组低（P<0.05），治疗后 24 h 尿蛋白定量、BUN、SCr 均低于对照组（P<0.05）。由此可见， 应用中西医结合辨证论治有助于提高糖尿病肾病的总体疗效， 且利于患者肾功能指标的改善，建议临床推广。
组别
例数
空腹血糖
餐后 2 h 血糖
试验组
37
6.51±1.37
7.01±1.14
对照组
37
7.59±2.28
8.73±1.49
t
2.470
5.577
P
0.016
0.000
2.2 肾功能指标 试验组患者治疗后 24 h 尿蛋白定量、
BUN、SCr 均低于对照组（P<0.05），见表 2。
表 2 2 组患者治疗后肾功能指标对比
1.4 评价指标 统计并比较 2 组空腹血糖与餐后 2 h 血糖水 平，24 h 尿蛋白定量、血尿素氮（BUN）、肌酐（SCr）等肾功能指标。
Cell：肠道菌对轮状病毒感染的防治
Cell：肠道菌对轮状病毒感染的防治导读10⽉10⽇，《Cell》刊发了题为《Segmented Filamentous Bacteria Prevent and Cure Rotavirus Infection（分段丝状细菌对轮状病毒感染的预防和治疗）》的新研究，指明⼀种叫做分段丝状细菌的肠道菌在轮状病毒感染中扮演着重要⾓⾊，并解释了轮状病毒在某些⼈群中引发严重致死性疾病的分⼦机制，或有助于开发轮状病毒感染的治疗和预防性新策略。
该研究的主要发现包括：1. 某些⼩⿏群体对轮状病毒感染能产⽣⾃发抗性；2. 粪便微⽣物移植可以转移对轮状病毒感染的这种抗性；3. 抗性源于分段丝状细菌，它介导了对轮状病毒感染的保护作⽤；4. 分段丝状细菌能够增加上⽪细胞周转，从⽽起到阻碍轮状病毒感染及相关腹泻的作⽤。
研究名称：S e g m e nt e d F i l a m e nt ous B a c t e r i a P r e v e nt a nd Cur eR ot a v i r us I nfe c t i on期刊：Cell发表时间：2019年10⽉10⽇IF：36.216doi:10.1016/j.cell.2019.09.02⽇前，美国佐治亚州⽴⼤学Andrew T. Gewirtz课题组在10⽉10⽇的《Cell》上发表了题为《Segmented Filamentous Bacteria Prevent and Cure Rotavirus Infection（分段丝状细菌对轮状病毒感染的预防和治疗）》⼀⽂，指明肠道菌群能够对轮状病毒感染及相关腹泻起到保护作⽤，且这种作⽤独⽴于免疫细胞；通过移植富含分段丝状细菌（Segmented Filamentous Bacteria,sfb）的肠道微⽣物群甚⾄能够让⼩⿏达到“百毒不侵”的状态，对多种肠道病毒产⽣抗性。
意外的发现说起来，这⼀研究结果完全是偶然所得。
肠道病毒71型感染动物模型的应用与局限
肠道病毒71型感染动物模型的应用与局限吴月明;朱耐伟;朱勇喆【摘要】Enterovirus 71 (EV71) is a major pathogen of hand ,foot and mouth disease which is known as a neglected tropical infectious disease .EV71 is responsible for several outbreaks in the Asia‐Pacific Region over the past 15 years . Since the effective control of poliovirus , EV71 has been regarded as the most important neurotropic enterovirus and its severe neurological complications threaten the children’s health . Appropriate animal models of EV71 infection are essential to understand the neuropathology and to facilitate the development of effective vaccines and drugs .In this paper ,we review the characteristics ,applications and limitations of three major kinds of established animal models ,including non‐human primate models , mouse‐adaptation models and transgenic mouse models .%肠道病毒71型（enterovirus 71，EV71）是一种被忽视的热带传染病———手足口病的主要病原体之一，过去15年在亚太地区引起了多次手足口病暴发。
胃肠安丸抗轮状病毒作用的体外试验
胃肠安丸抗轮状病毒作用的体外试验张婧;周洪经;李晓眠【摘要】Objective: To study the anti-rotavirus activity of Weichang'an pill in vitro. Methods: The anti-rotavirus activity of Weichang'an pill was tested at the cellular level by the CPE and MTF methods; Serum containing Weichang' an pill of anti-rotavirus effects in different times and drug's metabolites were observed. Results: Weichang'an pill had the effect on prevention, treatment and directly inactivation of rotavirus. The maximum inhibition rates were 67.05％, 67.02％ and 71.24％, respectively(P＜0.05 ). Also, the inhibit ration of rotavirus increased with the raise of the concentration of drugs. 45～65 rain after drug was given, the concentration of drug in serum was the highest, and the effect of anti-rotavirus was obvious. Conclusion: Weichang' an pill has the ability of anti-rotavirus effects in vitro.%目的:研究胃肠安丸体外抗轮状病毒作用.方法:利用病毒致细胞病变作用终点稀释法和噻唑蓝比色分析法在细胞水平上检验胃肠安丸的抗轮状病毒作用;观察不同时间段的含药血清抑制轮状病毒情况及药物在体内代谢情况.结果:胃肠安丸有预防、治疗和直接灭活轮状病毒感染的作用,最高抑制率分别为67.05%、67.02%和71.24%(P＜0.05).同时在TC0范围以下,药物浓度与病毒抑制率呈正相关.在给药后45～65 min之间,药物在血清中浓度最高,其含药血清具有明显的抗轮状病毒作用.结论:胃肠安丸具有良好的体外抗轮状病毒作用.【期刊名称】《天津医科大学学报》【年(卷),期】2011(017)002【总页数】4页(P177-180)【关键词】胃肠安丸;轮状病毒;血清药理学【作者】张婧;周洪经;李晓眠【作者单位】天津医科大学微生物学教研室,天津300070;天津医科大学微生物学教研室,天津300070;天津医科大学微生物学教研室,天津300070【正文语种】中文【中图分类】R373轮状病毒(rotavirus,RV)属呼肠孤病毒科，是婴幼儿急性感染性腹泻的主要病原体，占婴幼儿腹泻的50%[1]。
M13噬菌体空斑实验
M13噬菌体空斑实验一、实验目的：1、了解M13噬菌体载体的一般结构、性质及感染特征。
2、学习并掌握M13噬菌体载体的空斑纯化技术。
二、实验原理：一个M13噬菌体的病毒颗粒感染一个细菌后形成一个噬菌斑。
从感染细菌释放出来的子代病毒颗粒感染临近细菌，后者又可释放下一代病毒颗粒；如果细菌在半固体培养基上生长，自带病毒颗粒的扩散受到一定限制，诸如M13等丝状噬菌体并不裂解细菌，但可以使细菌生长速度降低至原来的1/2，在上层琼脂中生长的菌台的背景下，生长缓慢细菌形成了一个不断扩大到肉眼可见的噬菌斑。
三、材料与试剂：1、M13噬菌体2、ER2738菌种3、LB培养基四、实验步骤1.1、取5ml LB液体培养基于10ml的试管中，加入5ul 四环素（20mg/ml），将大肠杆菌接入，37℃震荡（80-100rpm）培养过夜（12h）2.将2ml的ER2738培养液转入20ml的LB培养基中（1:10稀释），继续37℃震荡（80-100rpm）培养4.5h（不宜过快，否则，细菌性毛被破坏，噬菌体无法导入），即成为感受态细胞3.培养细菌时将水浴锅打开，43℃预热，并将LB 平板置于37℃预热备用4.用装有LB培养基的EP管10倍稀释噬菌体，理想的稀释范围：扩增过的噬菌体108-1010倍稀释，未扩增过的104-105倍稀释5.将顶层琼脂用微波炉或者电磁炉沸水融化，置于水浴锅中保温待用6.当大肠杆菌达到对数成长期，取大肠杆菌ER2738感受态细胞200ul于EP管中7.加入10ul-100 ul（或者一定体积）一定稀释度的噬菌体溶液，快速混合，室温孵育1-5min8.将感染过的大肠杆菌的培养液倒入43℃顶层琼脂中，用vortex迅速混匀，立刻在预热的LB培养基上倒平板，迅速摇晃平板使顶层琼脂均匀展开并铺满表面9.室温静置5min左右使平板冷却凝固，将培养皿倒置37℃培养过夜10.第二天观察平板，对培养皿中的噬菌斑进行计数，计算约含有10-100个数量级的平板噬菌斑的具体数目（y），计算噬菌体效价（pfu/ml）噬菌体效价=y*10x+2puf/ml分子生物学作业1、什么是细菌的转化？2、在哪些生物中，RNA是唯一的遗传物质？3、与单个氨基酸对应的碱基序列叫什么？4、DNA的复制是全保留还是半保留的？5、在半保留复制中，在第一、第二和第三轮复制中，分别有多少含有一条亲代链和一条子代链的双连DNA分子？。
1株新型肠道病毒的生物学特性鉴定
1株新型肠道病毒的生物学特性鉴定胡燕;侯俊;沈宏辉;白冰珂;王志杰;于晓方;貌盼勇【期刊名称】《传染病信息》【年(卷),期】2009(022)003【摘要】目的从1例急性肝炎患儿粪便标本中分离到1株新型肠道病毒,鉴定其牛物学特性.方法采用细胞培养、动物试验、中和试验、电子显微镜观察和分子牛物学等技术进行鉴定.结果该病毒对乙醚不敏感,在pH 3.0及37℃60 min条件下稳定,56℃30 min可以被灭活;能在A549和RD细胞中稳定传代,并致细胞病变;不能被已有肠道病毒免疫血清中和;小白鼠乳鼠对该病毒不敏感;电子显微镜下可见27～30 nm的肠道病毒样颗粒;部分核苷酸序列分析表明,病毒VP1区核苷酸序列与肠道病毒89型的同源性为87%,与其他病毒无有意义的间源性.结论该病毒的生物学特性与肠道病毒相似,但其抗原性和核苷酸序列等与已知肠道病毒有较大差异,可能属于肠道病毒89型的1个新亚型.【总页数】3页(P140-142)【作者】胡燕;侯俊;沈宏辉;白冰珂;王志杰;于晓方;貌盼勇【作者单位】解放军传染病研究所,北京,100039;解放军传染病研究所,北京,100039;解放军传染病研究所,北京,100039;解放军传染病研究所,北京,100039;解放军传染病研究所,北京,100039;霍普金斯大学公共卫生学院分子微生物与免疫学系,巴尔的摩,MD21205;解放军传染病研究所,北京,100039【正文语种】中文【中图分类】R373.2【相关文献】1.肠道病毒EV71新型VLPs疫苗的制备及鉴定 [J], 董轲;王希;龙敏;王琳;张惠中2.新分离呼吸道肠道病毒生物学特性和S4片段的序列测定 [J], 朱虹;苏裕心;宋立华;何君;黄如统;貌盼勇;端青3.2013年贵州省急性弛缓性麻痹病例中非脊髓灰质炎肠道病毒的鉴定分析 [J], 王宇;任刚;王寅寅;苏飞;唐小敏;叶绪芳4.一株牛肠道病毒的分离与鉴定 [J], 宋文凤;向文杰;林俊;李德栋;陈瑞红;朱远茂;薛飞5.一株新型杀鲑气单胞菌烈性类T4噬菌体Asfd-1的分离鉴定和生物学特性分析[J], 周燕;袁盛建;严庭玮;马迎飞因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
噬斑形成法检测EV71
应用空斑形成法检测五种不同细胞对肠道病毒71型的敏感性杨子峰, 秦笙, 莫自耀, 关文达, 王玉涛杨子峰, 秦笙, 莫自耀, 关文达, 王玉涛, 呼吸疾病国家重点实验室(广州医学院)·广州医学院第一附属医院广东省广州市 510230杨子峰, 助理研究员, 主要从事临床病毒学与抗病毒药物的研究. 广州市重大科技基金资助项目, No. 2007Z1-E0111作者贡献分布: 杨子峰, 秦笙, 莫自耀, 关文达及王玉涛对此文所做贡献均等; 此课题由杨子峰和秦笙设计; 研究过程由杨子峰与秦笙独立完成; 研究所用试剂及分析工具由莫自耀提供; 数据分析由杨子峰, 秦笙, 关文达及王玉涛完成; 本论文写作由杨子峰, 莫自耀及秦笙完成.通讯作者: 莫自耀, 510230, 广东省广州市, 呼吸疾病国家重点实验室(广州医学院)·广州医学院第一附属医院. moziyao@ 收稿日期: 2008-12-26 修回日期: 2009-01-24接受日期: 2009-02-09 在线出版日期: 2009-02-28Detection of five different cells'sensitivities to enterovirus 71using plaque forming assayZi-Feng Yang, Sheng Qin, Zi-Yao Mo, Wen-Da Guan,Yu-Tao WangZi-Feng Yang, Sheng Qin, Zi-Yao Mo, Wen-Da Guan,Yu-Tao Wang, State Key Laboratory of Respiratory Disease (Guangzhou Medical University), Guangzhou Instituteof Respiratory Disease, Guangzhou 510230, Guangdong Province, ChinaSupported by: the Major Programs of Guangzhou Sciences, No. 2007Z1-E0111Correspondence to: Zi-Yao Mo, State Key Laboratoryof Respiratory Disease (Guangzhou Medical University), Guangzhou Institute of Respiratory Disease, Guangzhou 510230, Guangdong Province, China. moziyao@ Received: 2008-12-26 Revised: 2009-01-24Accepted: 2009-02-09 Published online: 2009-02-28 AbstractAIM: To establish the plaque assay for thequantitative detection of enterovirus 71 (EV71)and to compare sensitivity of buffalo greenmonkey (BGM) cells, vero E6 cells, MRC-5 cells,A549 and HEp-2 cells to it.METHODS: BGM cells and vero cells weretransinfected with EV-71. Then the plates werecovered with three kinds of overlay medium(i: 0.6% Agarose, ii: 1% methycellulose, iii: 1.2% Avicellulose) and incubated for 3 to 4 days.The plaques were stained, and the number ofplaques was counted. The supernatants wereharvested at 24-96 hours after infection forplaque assay, and this technique was used tomeasure the five cell lines simultaneously.RESULTS: The plaques appeared as clear cycles(range 0.5 to 1 mm) in BGM and vero E6 cellscovered with 1% methycellulose and 1.2% avicellulose, whereas EV71 produced the pinpointplaques covered with 0.6% agarose. The titer of virus ranged from 1.65×109 pfu/L to 2.87×109 pfu/L. CONCLUSION: The techniques may benefit thequantitative detection of EV71. Furthermore, itindicates that BGM cells and vero E6 cells constitutea valuable and sensitive cell line system forenterovirus 71.Key Words: Enterovirus 71; Plaque forming assay;Cell; Quantitative detectionYang ZF, Qin S, Mo ZY, Guan WD, Wang YT. Detectionof five different cells' sensitivities to enterovirus 71 usingplaque forming assay. Shijie Huaren Xiaohua Zazhi 2009; 17(6): 573-577摘要目的: 建立肠道病毒71型(EV71)的空班形成方法, 并比较BGM、VeroE6、MRC-5、HEp-2及A549五种细胞对EV71病毒的敏感性.方法: 将不同稀释浓度的EV71病毒接种到五种细胞, 分别覆盖三种不同的培养物, 孵育一定时间后固定染色, 比较出斑效果; 以新建空斑形成法测定五种细胞感染EV71 24-96 h后培养液滴度, 计算空班形成单位(pfu).结果: 在五种细胞中, BGM和VeroE6覆盖琼脂糖凝胶的EV71可形成针尖样空班; 覆盖1%甲基纤维素的EV71可形成直径大约1 mm圆形或类圆形空班, 形成空斑单位最多, 病毒滴度分别达2.87×109 pfu/L和1.65×109 pfu/L; 覆盖1.2%艾维素的EV71在BGM细胞中可形成直径大约0.5 mm类圆形空斑, 在VeroE6细胞中形成针尖样空斑; 其他细胞均形成针尖样空斑.结论: 空斑形成方法可对肠道病毒进行定量®■背景资料肠道病毒71型是1969年首次从加利福尼亚患者的中枢神经系统疾病的婴儿粪便中分离出来的. EV71已在世界范围内引起十多次爆发和流行. 因此EV71感染和流行是值得长期密切关注的问题. 加强和完善其诊断方法, 特别是准确定量的方法, 将有助于开展EV71病毒的诊治、药物以及疫苗等研究. ■同行评议者赵平, 副教授, 中国人民解放军第二军医大学微生物学教研室检测, BGM及VeroE6细胞为EV71的敏感细胞.关键词: 肠道病毒71型; 空斑形成试验; 细胞; 定量测定杨子峰, 秦笙, 莫自耀, 关文达, 王玉涛. 应用空斑形成法检测五种不同细胞对肠道病毒71型的敏感性. 世界华人消化杂志2009; 17(6): 573-577/1009-3079/17/573.asp0 引言肠道病毒71型(enterovirus71, EV71)是小RNA病毒科肠道病毒属(enteovirus)成员, 其感染主要引起患者的手足口病(hand-foot-and mouth disease,HFMD)[1]. 近年来, EV71病毒的流行在亚太地区呈上升趋势[2], 尤其是2008年我国安徽阜阳EV71疫情的爆发及蔓延[3], 再度引起医学界的高度重视. 关于肠道病毒定量检测, 传统的病毒滴定方法主要是通过观察被病毒感染细胞产生的细胞病变或血凝滴度进行定量检测, 但这类方法易因实验者的技术水平和经验的差异造成判断的主观性. 检测病毒核酸的实时定量PCR方法有快速、敏感的优点, 但不能提示病毒感染力[2].空斑形成试验是对病毒感染力精确定量的有效方法, 本研究针对EV71病毒建立空班形成试验方法, 用于比较不同细胞对EV71的敏感性, 为临床实验室选择合适诊断细胞系组合提供依据.1 材料和方法1.1 材料琼脂糖(Ox o i d)、二乙基氨基乙基(DEAE, GE公司), 小牛血清(TBD公司), 甲基纤维素(carboxymethylcellulose sodium salt, Sigma 公司), 艾维素(Avicel, FMC公司), 结晶紫(Crystal viol e t, 天津市大茂化学试剂厂), 24孔细胞培养板(Cornnig公司). 细胞株: BGM、VeroE6、MRC-5、A549、HEp-2为本室保存细胞株, 细胞为本室保存. 病毒株: 肠道病毒71型广州株(EVGZ06), 自临床患者样品分离, 以MRC-5细胞传代扩增.1.2 方法1.2.1 空斑试验: 用常规制备的BGM、VeroE6、MRC-5、HEp-2和A549五种细胞接种10倍系列稀释的病毒, 吸附1-2 h后, 五种细胞分别覆盖三种不同的培养物1.5 mL/孔, 置34℃、50 mL/LCO2条件下培养3 d. 以福尔马林缓冲结晶紫溶液(0.1%)固定和染色, 计算空班形成单位(PFU). 培养物配方: (1)6 g/L琼脂糖覆盖物: 总量22.6 mL, MEM(2×)10 mL, 无菌纯水3.4 mL, 小牛血清0.4 mL, 1% DEAE 0.2 mL, 20 g/L琼脂糖6 mL. (2)10 g/L甲基纤维素覆盖物: 总量20 mL, 称取1 g甲基纤维素粉高压灭菌后, 加入MEM(1×)19.6 mL和小牛血清0.4 mL, 混匀备用. (3)1.2% Avicel: 2.4% Avicel与MEM(2×)等体积混合. (4)MEM(2 ×): 总量500 mL, 称取9.4 g MEM粉末溶解于无菌纯水462 mL过滤除菌, 另补加终浓度0.6 g/L谷胺酰氨, 100 U/L青霉素, 100 μg/L链霉素, 7% NaHCO3, 0.02 mol/L HEPES, 0.4% BSA. 按下列公式计算空斑形成单位: 空斑形成单位(pfu/L) = [每孔平均空斑数/每孔病毒接种量(mL)]×病毒稀释度.1.2.2 用空斑试验检测EV71在BGM、VeroE6、MRC-5、HEp-2和A549细胞上不同增殖时间的滴度: 常规接种五种细胞于24孔培养板, 待细胞形成单层后, 分别接种MOI = 0.01的病毒各3孔, 取感染后24、48、72、96 h四个时间点的上清液做空斑形成试验, 计算空斑形成单位.2 结果2.1 空斑试验的建立在BGM和Vero E6两种细胞, 覆盖琼脂糖凝胶的EV71形成针尖样空班; 覆盖10 g/L甲基纤维素的EV71形成直径大约1 mm 圆形或类圆形空班; 覆盖Avicel的EV71在BGM 细胞中可形成直径大约0.5 mm类圆形空斑, 在Vero E6细胞中形成针尖样空斑, 其他细胞均形成针尖样空斑(图1).2.2 检测EV71在BGM、Ve roE6、MRC-5、HEp-2和A549细胞上不同增殖时间的病毒滴度结果 EV71病毒在不同细胞不同增殖时间所产生的滴度: BGM>VeroE6>MRC-5>HEp-2>A549,其中病毒在BGM和VeroE6细胞上产量均高于其他3种细胞.2.3 EV71在BGM、VERO、MRC-5、A549和HEp-2出现CPE的特征与时间 EV71在BGM、VeroE6细胞, 感染后第2天即迅速出现典型的肠道病毒CPE: 细胞变圆、坏死、脱落, 最终整个单层细胞被破坏(图2-3); MRC-5、A549和HEp-2 细胞接种后4-5 d出现细胞变圆、坏死、脱落等CPE, 出现CPE的时间落后于上述两种细胞, 且不易与老化细胞辨别.3 讨论EV71是1969年首次从加利福尼亚患者的中枢神经系统疾病的婴儿粪便中分离出来的[4]. EV71已在世界范围内引起十多次爆发和流行, 我国台湾地区也曾发生EV71感染大爆发[5], 特别是■研发前沿肠道病毒在自然界广泛存在且型别众多, 一病多原、一原多症是肠道病毒感染的重要特征. 在EV7 1 流行期间,虽然可通过血清中和试验和核酸扩增测序等手段进行鉴定分型, 但对于常规条件一般的临床实验室,病毒分离培养仍然是十分实用和重要的诊断办法.杨子峰, 等. 应用空斑形成法检测五种不同细胞对肠道病毒71型的敏感性 5752008-05我国安徽爆发的EV71[3], 严重危害人民群众的生命安全, 因此EV71感染和流行是值得长期密切关注的问题. 加强和完善其诊断方法, 特别是准确定量的方法, 将有助于开展EV71病毒的诊治、药物以及疫苗等研究.病毒空斑(又叫蚀斑)如同噬菌体的蚀斑[7],在细胞培养中是一种较精确地测定病毒感染力的方法. 每个空班由单个具有感染性病毒颗粒复制形成, 所以病毒空斑实验既检测了病毒的感染性也测定了病毒的滴度, 这一特点是分子生物学手段不能比拟的. 本研究将琼脂糖、甲基纤维素以及艾维素三种材料用于覆盖不同细胞, 为建立EV71病毒空斑试验选择最佳覆盖材料. 结果发现, 病毒在不同细胞不同材料下形成空斑效果差异较大, 最佳的是Vero E6细胞覆盖含10 g/L甲基纤维素营养物, 形成十分清晰的类圆形空斑. 本研究建立的EV71空斑形成法体系, 操作简单, 结果易于观察, 试验周期较短, 十分适用于EV71病毒的定量检测.肠道病毒在自然界广泛存在且型别众多, 一病多原、一原多症是肠道病毒感染的重要特征. 在EV71流行期间, 虽然可通过血清中和试验和核酸扩增测序等手段进行鉴定分型, 但对于常规条件一般的临床实验室, 病毒分离培养仍然是十分实用和重要的诊断办法. 分离肠道病毒所选用的细胞系一般都为人源或猴源细胞[6], 他们都具有肠道病毒受体, 可不同程度地支持肠道病毒的体外复制. 如, 脊髓灰质炎病毒在猴肾细胞和HEp-2细胞产生CPE[8], 而埃可病毒只对A549、MRC-5和猴肾细胞敏感[9], 柯萨其病毒B组病毒和A组中的少数型别(7、9、16等)能在猴肾细胞中生长, 人胚肺成纤维细胞株对柯萨其A组和B 组病毒敏感性也存在差异[10]. 明确EV71病毒敏感的宿主细胞, 不仅可以为临床实验室挑选合适细胞系提供可靠信息, 也对抗病毒药物和预防性疫苗的筛选有重要意义.本研究根据以往实验经验、细胞的普遍性和获得的难易程度三个原则选择了BGM、■创新盘点本研究根据以往实验经验、细胞的普遍性和获得的难易程度三个原则选择了BGM、VeroE6、HEp-2、MRC-5和A549 5种细胞,比较其对EV71的敏感性, 结果显示BGM和VeroE6细胞的敏感性最好,出现细胞病变最快, 病毒产量也最高.A B CD E F图 1 BGM细胞和VeroE6细胞在不同覆盖物下形成的空斑. A-C: BGM; D-F: VeroE6; A, D: 0.6% Agar; B, E: 10 g/L甲基纤维素; C, F: 1.2% Avicel.4003503002502001501005024 h P.I 48 h P.I 72 h P.I 96 h P.IPFU/mL (×104)感染后不同时间BGMVeroE6MRC-5HEp-2A549图 2 空斑形成法测定不同时间收获液的病毒滴度.576 ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R 世界华人消化杂志 2009年2月28日第17卷第6期VeroE6、HEp-2、MRC-5和A549 5种细胞, 比较其对EV71的敏感性, 结果显示BGM和VeroE6细胞的敏感性最好, 出现细胞病变最快, 病毒产量也最高. EV71感染BGM、VeroE6细胞后第2天即迅速出现典型的肠道病毒CPE, 因此感染后48-72h病毒产量最高, 之后上清液中细胞碎片、脱落细胞过早出现, 有可能影响病毒高峰的持续时间. 而MRC-5敏感性虽然也不低, 但由于在体外传代数有限, 在临床实验室应用受到一定限制,A549和HEp-2虽然也有病毒增殖, 但由于滴度低且不易出现典型CPE, 仅可用于抗原检测.总之, 我们建立了用于测定肠道病毒EV71型病毒的空斑形成技术, 成功应用于五种细胞对EV71型病毒敏感性比较的研究, 筛选出BGM、VeroE6细胞为EV71的敏感细胞, 为临床实验室挑选合适细胞系提供了可靠信息. 肠道病毒空班形成技术的应用能迅速准确计数出不同标本中的病毒空斑数, 将有利于疫苗效价滴定、抗病毒药物筛选等研究.致谢: 感谢陈敬贤教授为本研究提供的帮助.4 参考文献1 Hsiung GD, Wang JR. Enterovirus infections with special reference to enterovirus 71. J Microbiol Immunol Infect 2000; 33: 1-82 陈宗波. 人类肠道病毒71型感染的研究进展. 中华儿科杂志 2005; 43: 428-4303 中华人民共和国卫生部新闻办公室. 卫生部公布2008 年5月全国突发公共卫生事件信息. 中华人民共和国卫生部官方网站, 2008-06-12; cited 2008-12-26;1(1): 24 screens. URL: .cn/publicfiles/business/htmlfiles/mohbgt/s3582/200806/36296.htm4 Schmidt NJ, Lennette EH, Ho HH. An apparently new enterovirus isolated from patients with disease of the central nervous system. J Infect Dis 1974; 129: 304-3095 Komatsu H, Shimizu Y, Takeuchi Y, IshikoH, Takada H. Outbreak of severe neurologicinvolvement associated with Enterovirus 71infection. Pediatr Neurol 1999; 20: 17-236 David MK, Peter MH. Fields Virology. 5th ed. Philadelphia USA: Lippincott Williams and■应用要点本研究结果发现,病毒在不同细胞不同材料下形成空斑效果差异较大, 最佳的是VeroE6细胞覆盖含10g/L甲基纤维素营养物, 形成十分清晰的类圆形空斑. 本研究建立的EV71空斑形成法体系, 操作简单,结果易于观察, 试验周期较短, 十分适用于EV71病毒的定量检测.图 3 EV71在不同细胞的CPE(Day2 P.I 100×). A: 正常BGM细胞; B: EV71的CPE(BGM); C: 正常VeroE6细胞; D: EV71的CPE(VeroE6); E: 正常MRC-5细胞; F: EV71的CPE(MRC-5).A BC DE F__。
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１ ０ ３ ８・
热带医学杂志
２ ０ １ ５ 年８ 月第 １ ５ 卷第 ８ 期
Ｊ Ｔ ｒ ｏ ｐ Ｍ ｅ ｄ ， Ａ ｕ ｇ ． ２ ｏ １ ５ ＇ Ｖ ｏ １ ． １ ５ ， Ｎ ｏ ． ８
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实 验研 究 论 著 ・
新 型肠道病 毒空斑 实验 在猴 轮状 病毒 中的 应用效果 观察
形态 不规则 。 空斑实 验可重复性 达到 ９ ０ ％以上 。 结论 关键 词 ：轮状 病毒 ： 新型 空斑实验 ； 微 晶纤维 素
中图分类 号 ： Ｒ ３ ７ ３ 文献标识码 ： Ａ
新 型病毒 空斑实验 可 以用 于猴病毒 Ｓ ＡＩ ｌ感染细 胞模型 。 相
比传 统空斑 实验可重 复性大大 提高 ， 操作 也极为简 便 ， 为抗人 轮状病毒 药物 的筛选奠定 了基础 。
ｖ ｉ ｓ ｉ ｂ ｌ ｅ ｔ ｏ ｔ ｈ ｅ ｎ ａ ｋ ｅ ｄ ｅ ｙ ｅ ｓ ａ ｔ ｄ ａ ｙ ４ － ５， ａ ｎ ｄ ｔ ｈ ｅ ｒ ｅ ｐ ｅ ａ ｔ ａ ｂ ｉ ｌ ｉ ｔ ｙ ｃ ｏ ｕ ｌ ｄ ｒ ｅ ａ ｃ ｈ ａ ｂ ｏ ｖ ｅ ９ ０ ％ ．Ｃｏ ｎ ｃ ｌ ｕ ｓ ｉ ｏ ｎ Ｎｅ ｗ ｐ ｌ ａ ｑ ｕ ｅ ａ ｓ ｓ ａ ｙ ｃ ａ ｎ
ｂ ｅ ｕ ｓ ｅ ｄ ｉ ｎ Ｓ Ａ１ １ ／ＭＡ１ ０ ４ ｍｏ ｄ ｅ １ ．Ｃ ｏ ｍｐ ａ ｒ ｅ ｄ ｗ ｉ ｔ ｈ ｔ ｒ ａ ｄ ｉ ｔ ｉ ｏ ｎ ａ ｌ ｐ ｌ ａ ｑ ｕ ｅ ａ ｓ ｓ ａ ｙ ，ｉ ｔ ｓ ｒ ｅ ｐ ｅ ａ ｔ ａ ｂ ｉ ｌ ｉ ｔ ｙ ａ ｎ ｄ ｓ ｉ ｍｐ ｌ ｉ ｃ ｉ ｔ ｙ ｗｉ ｌ ｌ ｃ ｏ ｎ ｔ ｒ ｉ ｂ ｕ ｔ ｅ ｔ ｏ ｔ ｈ ｅ ｓ ｃ ｒ ｅ ｅ ｎ ｉ ｎ ｇ ｏ ｆ ａ ｎ ｔ ｉ ｖ ｉ ｒ ａ ｌ ｄ ｕｇ ｒ ｓ ｏｒ ｆ ｈ ｕ ｍａ ｎ ｒ ｏ ｔ ａ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ｉ ｎ ｆ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ． Ｋｅ ｙ ｗｏ ｒ ｓ ：ｒ ｄ ｏ ｔ ａ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ；ｎ ｅ ｗ ｐ ｌ ａ ｑ ｕ ｅ ａ ｓ ｓ ａ ｙ；ｍｉ ｅ ｒ ｏ ｃ ｒ ｙ ｓ ｔ ｌｌ ａ ｉ ｎ ｅ
ＹＩ Ｎ Ｙｉ ｎ ｇ — ｘ ｉ ａ ｎ，ＫＵ ＡＮＧ Ｙａ — ｓ ｈ ｕ，ＸＵ Ｙｉ
（ Ｇ ｕ ａ ｎ ｇ ｚ ｈ ｏ ｕ Ｗｏ ｍ ｅ ｎ ａ ｎ ｄ Ｃ ｈ ｉ ｌ ｄ ｒ ｅ ｎ ＂ ｓ Ｍｅ ｄ ｉ ｃ ａ ｌ Ｃ ｅ ｎ ｔ ｅ ｒ ， Ｇ ｕ ａ ｎ ｇ ｚ ｈ ｏ ｕ ，Ｇ ｕ ａ ｎ ｇ ｄ ｏ ｎ ｇ ５ １ ０ ６ ２ ３ ，Ｃ ｉ ｈ ｎ ａ ）
文章 编号 ： １ ６ ７ ２ ． ３ ６ １ ９ （ ２ ０ １ ５ ） ０ ８ — １ ０ ３ ８ — ０ ３
Ｔｈ ｅ ｅ ｆｅ ｃ ｔ ｏ ｆ ａ ｎｅ ｗ ｐ ｌ ａ ｑ ｕｅ ａ ｓ ｓ ａ ｙ ｆ ｏ ｒ ｅ ｎ ｔ ｅ ｒ ｏ ｖ ｉ ｒ ｕｓ ｏ ｎ ａ ｓ ｉ ｍｉ ａ ｎ ｒ ｏ ｔ ａ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ
胞模 型。观察空斑 形成 的大小 ， 形成 时间及 实验的可重 复性 。结果
型病 毒空 斑实 验方法 可较 快地 形成 肉眼可识 别 的空斑 ， 在空 斑可 数 的稀 释度 ， 大 多数 空斑 能 分开 ， 其 大小基 本 一
致， 少数 空斑融合成 相对较 大空斑 。 覆盖 层添加胰 酶对孔 板形成 时间无影 响 ， 但胰酶 浓度过 高 （ ＞ ５ Ｉ ￣ ｇ ／ ｍ １ ） 导致 空斑
Ａ ｂ ｓ ｔ ｒ ａ ｃ ｔ ： Ｏｂ ｊ ｅ ｃ ｔ ｉ ｖ ｅ Ｔ ｏ ｅ ｖ ａ ｌ ｕ ａ ｔ ｅ ａ ｎ ｅ ｗ ｐ ｌ ａ ｑ ｕ ｅ ａ ｓ ｓ ａ ｙ ｆ ｏ ｒ ｅ ｎ ｔ ｅ ｒ ｏ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ｏ ｎ ａ ｓ ｉ ｍ ｉ ａ ｎ ｒ ｏ ｔ ａ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ － ｃ ｅ ｌ ｌ ｉ ｎ ｆ ｅ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ｍｏ ｄ ｅ ｌ ， ａ ｎ ｄ
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尹应先 ， 旷雅 舒 ， 徐 翼
（ 广州 市妇女儿 童 医疗 中心 ，广 东 广州 ５ １ ０ ６ ２ ３ ）
摘要 ： 目的 观 察用 于肠道病 毒 的新 型病 毒空斑 型 轮状病 毒空 斑一 实
验方法 。 方法
将 成功应 用于 Ｅ Ｖ ７ １ ／ Ｖ ｅ ｒ ｏ 细胞 模型 的新 型空斑 实验方法 ， 稍加改进 ， 用于 Ｓ Ａ １ １ ／ Ｍ Ａ１ ０ ４病 毒感染 细 在Ｓ Ａ１ １ ／ ＭＡ１ ０ ４病毒细胞 感染模 型上 ， 应用 新