RRSV-S5基因工程设计
基因工程技术与应用知识点
基因工程的定义：按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对遗传物质DNA直接进行体外重组操作与改造，将一种生物（供体）的基因转移到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。
基因工程的基本过程：切、接、转、增、检基因工程理论依据：a) 生物的遗传物质是DNA。
b) DNA的双螺旋结构和半保留复制机理。
c) 遗传信息的传递方式（中心法则）和三联体密码子系统的建立遗传工程：指以改变生物有机体性状为目标，采用类似工程技术手段而进行的对遗传物质的操作，以改良品质或创造新品种。
包括细胞工程和基因工程等不同的技术层次。
克隆。
指由同个祖先经过无性繁殖方式得到的一群由遗传上同一的DNA分子、细胞或个体组成的特殊生命群体。
限制性核酸内切酶。
是一类能识别双链DNA 中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。
限制性内切酶由三个基因位点所控制：hsd R---限制性内切酶，hsd M---限制性甲基化酶，hsd S---控制两个系统的表达。
Hsd S－识别特定DNA序列，Hsd M－甲基化，Hsd R－限制性内切酶功能。
命名法：例如Haemophilus influenzue）d 株中分离的第三个酶：Hin d III同裂酶:不同来源的限制酶具有相同的识别位点和切割位点。
同尾酶：来源不同、识别序列不同，但产生相同粘性末端的酶粘性末端：DNA末端一条链突出的几个核苷酸能与另一个具有突出单链的DNA末端通过互补配对粘合，这样的DNA末端，称之。
酶活性单位。
在合适的温度和缓冲液中，在50μl反应体系中，1小时内完全切割1微克DNA所需的酶量为1个酶活性单位U。
星活性：指限制性内切酶在非标准条件下，对与识别序列相似的其它序列也进行切割反应，导致出现非特异性的DNA片段的现象。
引起星活性原因：若使用buffer不当, 会有star activity，而star activity是指限制酶对所作用的DNA及序列失去专一性, 当酶辨认切割位置的能力降低，导致相似的序列或是错误的辨认序列长度也会作用，而产生错误的结果。
基因工程的基本过程
基因工程的基本过程介绍基因工程是一项重要的生物技术领域，它利用DNA重组技术，对生物体的基因信息进行修改和重新组合，实现改变生物体性状的目的。
基因工程的基本过程包括基因定位、基因克隆、基因表达和基因转导等步骤。
本文将详细介绍基因工程的基本过程。
一、基因定位基因定位是基因工程的第一步，通过确定目标基因在染色体上的位置，为后续的基因克隆提供准确的目标。
基因定位可以通过物理方法、遗传方法和分子生物学方法等多种手段来实现。
1. 物理方法物理方法主要包括荧光原位杂交（FISH）和比较基因组杂交（CGH）等。
其中，荧光原位杂交可以通过标记特定探针并与目标基因序列进行杂交，从而在染色体上检测到目标基因的位置。
比较基因组杂交可以通过将目标基因与参考基因组进行杂交，通过比较两者的杂交强度，确定目标基因在染色体上的位置。
2. 遗传方法遗传方法主要包括连锁分析和关联分析等。
连锁分析是利用基因在染色体上的连锁关系，通过研究特定遗传标记和目标基因之间的连锁程度，来确定目标基因在染色体上的位置。
关联分析则是通过研究染色体多态性和目标基因之间的关联程度，来确定目标基因与某个特定区域的关系。
3. 分子生物学方法分子生物学方法主要包括PCR、Southern blotting和DNA测序等。
PCR可以通过目标基因的序列信息，设计特定引物并进行扩增，从而实现对目标基因的定位。
Southern blotting可以通过转移DNA片段到膜上，并进行测序等。
二、基因克隆基因克隆是基因工程的关键步骤，它通过将目标基因从来源生物体中分离出来，并进行扩增，得到足够多的DNA材料用于后续的实验。
1. DNA提取DNA提取是基因克隆的第一步，它可以通过细胞裂解、溶解和沉淀等步骤将DNA从生物体中提取出来。
常用的DNA提取方法包括酚-氯仿法、盐析法和商业DNA提取试剂盒等。
2. PCR扩增PCR扩增是基因克隆的关键技术，它可以通过DNA聚合酶的作用，将目标基因序列进行扩增。
途径工程
途径工程摘要：日臻完善的DNA重组技术已经允许人们对生物体内的固有代谢途径进行倾向性和功利性的设计与修饰。
利用DNA重组技术对生物细胞内固有代谢途径进行改造设计的尝试即第三代基因工程---途径工程。
关键词：途径工程概念内容意义生命诞生、发育、生长、病变、衰老乃至死亡的整个过程均由基因控制，因此，在活的生物细胞内通过基因操作，局部设计、改造和更新固有的代谢途径，就能达到认识生命，改造生命和优化生命之目的，这是第三代基因工程--途径工程研究的基本内容。
1 途径工程的基本概念1.1途径工程的基本定义途径工程（Pathway Engineering）是一门利用分子生物学原理系统分析细胞代谢网络、并通过DNA重组技术合理设计细胞代谢途径及遗传修饰、进而完成细胞特性改造的应用性学科。
途径工程以DNA重组技术作为一种操作平台，将细胞生物学、分子生物学、分子反应动力学和生物工程学原理的模块，按照人们的意愿组装成一个崭新的整体，并使之最终体现在生物细胞代谢网络的功利性改造中。
因此从某种意义上来说，途径工程是一种分子系统工程。
1.2途径工程的基本过程途径工程通过定向改变细胞内代谢途径的分布及代谢流重构代谢网络，进而提高代谢物的产量；外源基因的准确导入及其编码蛋白的稳定表达，可以拓展细胞内现有代谢途径的延伸路线，以获得新的生物活性物质或者优良的遗传特性。
为达到上述目标，途径工程操作至少应包括下列三大基本过程1.2.1靶点设计首先，根据化学动力学和计量学原理定量测定网络中的代谢流分布；其次，在代谢流分析的基础上调查其控制状态、机制和影响因素；最后，根据代谢流分布和控制的分析结果确定途径操作的合理靶点。
1.2.2基因操作利用途径工程战略修饰改造细胞代谢网络的核心是在分子水平上对靶基因或基因簇进行遗传操作，其中最典型的形式包括基因或基因簇的克隆、表达、修饰、敲除、调控以及重组基因在目标细胞染色体DNA上的稳定整合。
1.2.3效果分析很多初步的研究结果显示，一次性的途径工程设计和操作往往不能达到实际生产所要求的产量、速率或浓度。
RRSV-S10基因的克隆表达共40页文档
基因下载
(2) RRSV-S10-ORF的获取
(3)表达质粒pTXB1 MCS的分析
限制性内切酶 Nhe1 Not 1 EcoR 1 Xho 1 Sap 1
缓冲溶液 M H+BSA+TritonX-100 H H NEB buffer 4
反应温度 37 oC 37 oC 37 oC 37 oC 25 oC
RRSV-S10基因的克隆表达
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6、黄金时代是在我们的前面，而不在 我们的 后面。
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7、心急吃不了热汤圆。
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8、你可以很有个性，但某为失败找借口 (蹩脚 的工人 总是说 工具不 好)。
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10、只要下定决心克服恐惧，便几乎 能克服 任何恐 惧。因 为，请 记住， 除了在 脑海中 ，恐惧 无处藏 身。-- 戴尔． 卡耐基 。
实验设计
• 1. 酶切位点的选择 • 2.载体的酶切方案 • 3.引物的设计 • 4.RT-PCR程序的设计 • 5.基因的酶切方案 • 6.克隆的筛选方案 • 7.蛋白功能研究方案
1.酶切位点的选择
• (1)RRSV-S10基因的下载 • (2) RRSV-S10-ORF的获取 • (3) 表达质粒pTXB1 MCS的分析 • (4) RRSV-S10-ORF酶谱的分析
所以，载体酶切方案为： H buf, 37oC, Xho 1酶切2 hours以上；再加EcoR 1 酶切过夜
3.引物设计
• P+:(EcoR 1 ) • 5’GGAATTCATGCCTTTCGTGCAATTC 3’
P+引物验证
P-( Xho I): 5’CCGCTCGAGCTCTGCGTCATCACCAAAG3’
P-引物分 析和验证
番茄红素基因工程研究进展
番茄红素基因工程研究进展
马勇;徐方旭;刘诗扬;冯叙桥
【期刊名称】《食品研究与开发》
【年(卷),期】2013(034)003
【摘要】综述了番茄红素生物合成途径、关键酶及其基因调控以及番茄红素微生物和植物基因工程,并对番茄红素基因工程的发展方向进行了展望,为进一步研究基因工程技术在生产番茄红素中的应用提供科学的研究基础.
【总页数】4页(P107-110)
【作者】马勇;徐方旭;刘诗扬;冯叙桥
【作者单位】渤海大学化学化工与食品安全学院,辽宁锦州121000;沈阳农业大学食品学院,辽宁沈阳110866;沈阳药科大学后勤管理处,辽宁沈阳110016;渤海大学化学化工与食品安全学院,辽宁锦州121000;沈阳农业大学食品学院,辽宁沈阳11086
【正文语种】中文
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基因工程探索性综合性实验一 龙须菜中半乳糖-1-磷酸尿苷酰转
China Vietnam Japan Brazil Thailand Chile New Zealand Brazil Caribbean United States of America Vietnam Caribbean
实验过程要求同前
实验原理
根据NCBI数据库登录的红藻基因序列，采 用rDNA转录间隔区ITS1和ITS2进行亲源关 系的研究。
heteroclada heteroclada howei lemaneiformis lemaneiformis lemaneiformis longa pacifica parvispora salicornia salicornia spp.
Philippines Vietnam Peru Japan Mexico Peru Italy Canada United States of America Thailand Vietnam Burma
红藻 2.5 g；CTAB缓冲液5 ml ； 酚/氯仿/ 异戊醇抽提液 2ml ；10T/1E 1ml ； 10T/0.1E 1ml；3M醋酸钠溶液 1ml 变性 液 20 ml；中和液 40ml；转移液 100ml； 洗膜液I 10 ml；洗膜液II 10ml；缓冲液I 100ml；缓冲液II 20ml；缓冲液III 20 ml； 显色液 10ml；缓冲液IV 30ml
核糖体蛋白S5的医学研究进展
核糖体蛋白S5的医学研究进展
伍文星;张俊平
【期刊名称】《解放军医学杂志》
【年(卷),期】2011(36)4
【摘要】@@ 核糖体是细胞内一种核糖核蛋白颗粒,主要由rRNA和蛋白质构成,其基本功能是按照mRNA的指令将氨基酸合成蛋白质多肽链.目前在真核细胞中发现的核糖体蛋白(ribosomalprotein,RP)有80多种,广泛分布于各种组织中.
【总页数】3页(P418-420)
【作者】伍文星;张俊平
【作者单位】200433,上海,第二军医大学药学院生化药学教研室;200433,上海,第二军医大学药学院生化药学教研室
【正文语种】中文
【中图分类】R349.7
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高中生物基因工程知识点框架
高中生物基因工程知识点框架高中生物基因工程知识基因工程概念：按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
基本原理：让目的基因在受体细胞内稳定且高效的表达。
理论基础：DNA是生物遗传物质的发现，DNA双螺旋结构，遗传信息传递方式核心：构建重组DNA分子(一)基本工具(技术基础)1.限制性核酸内切酶(1)来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的(不切割自身DNA的原因：原核生物中无该限制酶的识别序列或其已被修饰)(2)功能：识别和切割DNA分子内一小段特殊的脱氧核苷酸序列(偶数碱基对回文序列)特异性表现：识别特定片段、切割该片段中的特定位点、形成一种末端Cf —G↓GATCC— & —↓GATC—(3)结果：DNA片段末端形成末端碱基互补的黏性末端或平末端2.DNA连接酶(1)功能：连接具有末端碱基互补的2个DNA片段，形成重组DNA分子Cf DNA聚合酶：只能将单个脱氧核苷酸逐个添加到已有的脱氧核苷酸链之后，需模板DNA，连接磷酸二酯键3.载体(1)条件：①能在受体细胞中稳定保存并大量复制，基本不影响受体细胞正常生命活动②一至多个限制酶酶切位点(必须在所需标记基因外)，供外源DNA片段插入③标记基因，便于筛选含有重组DNA分子的受体细胞——往往需要根据需求改造天然载体。
(2)功能：①作为运载工具将目的基因转移到受体细胞内——载体选质粒的原因：具有环状结构，能够携带目的基因②利用它在受体细胞内对目的基因进行大量复制和转录/表达(3)质粒(最常用的载体)一种能够自主复制，在细菌(或酵母菌)中独立于染色体之外存在的双链环状DNA分子(4)其它载体：噬菌体、动植物病毒(二)基因工程的应用1.动植物基因、细胞工程：优点①所需时间短②克服远缘杂交不亲和的缺陷(对应传统缺点)2.基因工程药物：首次是生长素释放抑制激素，然后胰岛素(E.coli产酶原)、干扰素等干扰素：我国第一个基因重组新药。
基因工程抗体研究进展及其临床应用
基因工程抗体研究进展及其临床应用
王平; 吕小英; 范守城
【期刊名称】《《重庆三峡学院学报》》
【年(卷),期】2010(26)3
【摘要】基因工程抗体是继多克隆抗体和单克隆抗体之后的第三代抗体.近年来随着生物工程技术的发展,许多基因工程抗体陆续问世,本文详细介绍了基因工程抗体的研究进展,概述了基因工程抗体在临床方面的明显优势和应用潜力.
【总页数】4页(P124-127)
【作者】王平; 吕小英; 范守城
【作者单位】重庆市畜牧科学院重庆 402460; 重庆市生产力促进中心重庆401147
【正文语种】中文
【中图分类】Q78
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人教版高中生物课堂笔记--生物选修3
生物选修三知识点之答禄夫天创作专题1 基因工程基因工程的概念基因工程是指依照人们的愿望,进行严格的设计,通过体外DNA重组和转基因技术,赋予生物以新的遗传特性,缔造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产物.基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的,又叫做DNA重组技术.（一）基因工程的基本工具1.“分子手术刀”——限制性核酸内切酶（限制酶）（1）来源：主要是从原核生物中分离纯化出来的.（2）功能：能够识别双链DNA分子的某种特定的核苷酸序列,而且使每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开,因此具有专一性.（3）结果：经限制酶切割发生的DNA片段末端通常有两种形式：黏性末端和平末端.2.“分子缝合针”——DNA连接酶(1)两种DNA连接酶（E·coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶）的比力：①相同点：都缝合磷酸二酯键.②区别：E·coliDNA连接酶来源于T4噬菌体,只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端,但连接平末真个之间的效率较低. (2)与DNA聚合酶作用的异同:DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端,形成磷酸二酯键.DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端,形成磷酸二酯键.3.“分子运输车”——载体（1）载体具备的条件：①能在受体细胞中复制并稳定保管.②具有一至多个限制酶切点,供外源DNA片段拔出.③具有标识表记标帜基因,供重组DNA的鉴定和选择.（2）最经常使用的载体是质粒,它是一种裸露的、结构简单的、自力于细菌染色体之外,并具有自我复制能力的双链环状DNA分子.（3）其它载体：噬菌体的衍生物、动植物病毒(二)基因工程的基本把持法式目的基因的获取第一步：目的基因是指：1.编码卵白质的结构基因.2.原核基因采用直接分离获得,真核基因是人工合成.人工合成目的基因的经常使用方法有反转录法_和化学合成法_.3.PCR技术扩增目的基因（1）原理：DNA双链复制（2）过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链；第二步：冷却到55～60℃,引物结合到互补DNA链；第三步：加热至70～75℃,热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成.第二步：基因表达载体的构建1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在,而且可以遗传至下一代,使目的基因能够表达和发挥作用.2.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标识表记标帜基因（1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段,位于基因的首端,是RNA聚合酶识别和结合的部位,能驱动基因转录出mRNA,最终获得所需的卵白质.（2）终止子：也是一段有特殊结构的DNA片段,位于基因的尾端.（3）标识表记标帜基因的作用：是为了鉴定受体细胞中是否含有目的基因,从而将含有目的基因的细胞筛选出来.经常使用的标识表记标帜基因是抗生素基因.第三步：将目的基因导入受体细胞_1.转化的概念：是目的基因进入受体细胞内,而且在受体细胞内维持稳定和表达的过程.2.经常使用的转化方法：将目的基因导入植物细胞：采纳最多的方法是农杆菌转化法,其次还有基因枪法和花粉管通道法等.将目的基因导入植物细胞：最经常使用的方法是显微注射技术.此方法的受体细胞多是受精卵.将目的基因导入微生物细胞：原核生物作为受体细胞的原因是繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少,最经常使用的原核细胞是年夜肠杆菌 ,其转化方法是：先用 Ca2+ 处置细胞,使其成为感受态细胞,再将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下增进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程.3.重组细胞导入受体细胞后,筛选含有基因表达载体受体细胞的依据是标识表记标帜基因是否表达.第四步：目的基因的检测和表达1.首先要检测转基因生物的染色体DNA上是否拔出了目的基因,方法是采纳 DNA分子杂交技术.2.其次还要检测目的基因是否转录出了mRNA,方法是采纳用标识表记标帜的目的基因作探针与 mRNA杂交.3.最后检测目的基因是否翻译成卵白质,方法是从转基因生物中提取卵白质,用相应的抗体进行抗原－抗体杂交.4.有时还需进行个体生物学水平的鉴定.如转基因抗虫植物是否呈现抗虫性状.（三）基因工程的应用1.植物基因工程：抗虫、抗病、抗逆转基因植物,利用转基因改良植物的品质.2.植物基因工程：提高植物生长速度、改善畜产物品质、用转基因植物生产药物.3.基因治疗：把正常的外源基因导入病人体内,使该基因表达产物发挥作用.（四）卵白质工程的概念卵白质工程是指以卵白质分子的结构规律及其生物功能的关系作为基础,通过基因修饰或基因合成,对现有卵白质进行改造,或制造一种新的卵白质,以满足人类的生产和生活的需求.（基因工程在原则上只能生产自然界已存在的卵白质）转录翻译专题2 细胞工程（一）植物细胞工程1.理论基础（原理）：细胞全能性全能性表达的难易水平：受精卵＞生殖细胞＞干细胞＞体细胞；植物细胞＞植物细胞2.植物组织培养技术（1）过程：离体的植物器官、组织或细胞―→愈伤组织―→试管苗―→植物体（2）用途：微型繁殖、作物脱毒、制造人工种子、单倍体育种、细胞产物的工厂化生产.（3）位置：是培育转基因植物、植物体细胞杂交培育植物新品种的最后一道工序.3.植物体细胞杂交技术（1）过程：（2）诱导融合的方法：物理法包括离心、振动、电安慰等.化学法一般是用聚乙二醇（PEG）作为诱导剂.（3）意义：克服了远缘杂交不亲和的障碍.（二）植物细胞工程1. 植物细胞培养（1）概念：植物细胞培养就是从植物机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和繁殖.（2）植物细胞培养的流程：取植物组织块（植物胚胎或幼龄植物的器官或组织）→剪碎→用胰卵白酶或胶原卵白酶处置分散成单个细胞→制成细胞悬液→转入培养瓶中进行原代培养→贴满瓶壁的细胞重新用胰卵白酶或胶原卵白酶处置分散成单个细胞继续传代培养.（3）细胞贴壁和接触抑制：悬液中分散的细胞很快就贴附在瓶壁上,称为细胞贴壁.细胞数目不竭增多,当贴壁细胞分裂生长到概况相互抑制时,细胞就会停止分裂增殖,这种现象称为细胞的接触抑制.（4）植物细胞培养需要满足以下条件①无菌、无毒的环境：培养液应进行无菌处置.通常还要在培养液中添加一定量的抗生素,以防培养过程中的污染.另外,应按期更换培养液,防止代谢产物积累对细胞自身造成危害.②营养：合成培养基成份：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素等.通常需加入血清、血浆等天然成份.③温度：适宜温度：哺乳植物多是36.5℃＋0.5℃；p H：7.2～7.4.④气体环境：95%空气＋5%CO2.O2是细胞代谢所必需的,CO2的主要作用是维持培养液的pH.（5）植物细胞培养技术的应用：制备病毒疫苗、制备单克隆抗体、检测有毒物质、培养医学研究的各种细胞.2.植物体细胞核移植技术和克隆植物（1）哺乳植物核移植可以分为胚胎细胞核移植（比力容易）和体细胞核移植（比力难）.（2）选用去核卵(母)细胞的原因：卵(母)细胞比力年夜,容易把持；卵(母)细胞细胞质多,营养丰富.（3）体细胞核移植的年夜致过程是：（右图）核移植胚胎移植（4）体细胞核移植技术的应用：①加速家畜遗传改良进程,增进良畜群繁育；②呵护濒危物种,增年夜存活数量；③生产珍贵的医用卵白；④作为异种移植的供体；⑤用于组织器官的移植等.（5）体细胞核移植技术存在的问题：克隆植物存在着健康问题、暗示出遗传和生理缺陷等.3.植物细胞融合（1）植物细胞融合也称细胞杂交,是指两个或多个植物细胞结合形成一个细胞的过程.融合后形成的具有原来两个或多个细胞遗传信息的单核细胞,称为杂交细胞.（2）植物细胞融合与植物原生质体融合的原理基秘闻同,诱导植物细胞融合的方法与植物原生质体融合的方法类似,经常使用的诱导因素有聚乙二醇、灭活的病毒、电安慰等.（3）植物细胞融合的意义：克服了远缘杂交的不亲和性,成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物新品种培育的重要手段.（1）抗体：一个B淋巴细胞只分泌一种特异性抗体.从血清中分离出的抗体产量低、纯度低、特异性差.（2）单克隆抗体的制备过程：简易、快速的优点.②用于治疗疾病和运载药物：主要用于治疗癌症治疗,可制成“生物导弹”,也有少量用于治疗其它疾病.专题3 胚胎工程（一）植物胚胎发育的基本过程1、胚胎工程是指对植物早期胚胎或配子所进行的多种显微把持和处置技术,如胚胎移植、体外受精、胚胎分割、胚胎干细胞培养等技术.经过处置后获得的胚胎,还需移植到雌性植物体内生产后代,以满足人类的各种需求.2、植物胚胎发育的基本过程（1）受精场所是母体的输卵管上段.（2）卵裂期：特点：细胞有丝分裂,细胞数量不竭增加,但胚胎的总体体积其实不增加,或略有减小.（3）桑椹胚：特点：胚胎细胞数目到达32个左右时,胚胎形成致密的细胞团,形似桑椹.是全能细胞.（4）囊胚：特点：细胞开始呈现分化（该时期细胞的全能性仍比力高）.聚集在胚胎一端个体较年夜的细胞称为内细胞团,将来发育成胎儿的各种组织.中间的空腔称为囊胚腔.（5）原肠胚：特点：有了三胚层的分化,具有囊胚腔和原肠腔.（二）胚胎干细胞1、哺乳植物的胚胎干细胞简称ES或EK细胞,来源于早期胚胎或从原始性腺中分离出来.2、具有胚胎细胞的特性,在形态上暗示为体积小,细胞核年夜,核仁明显；在功能上,具有发育的全能性,可分化为成年植物体内任何一种组织细胞.另外,在体外培养的条件下,可以增殖而不发生分化,可进行冷冻保管,也可进行遗传改造.3、胚胎干细胞的主要用途是：①可用于研究哺乳植物个体发生和发育规律；②是在体外条件下研究细胞分化的理想资料,在培养液中加入分化诱导因子,如牛黄酸等化学物质时,就可以诱导ES细胞向分歧类型的组织细胞分化,这为揭示细胞分化和细胞凋亡的机理提供了有效的手段；③可以用于治疗人类的某些顽疾,如帕金森综合症、少年糖尿病等；④利用可以被诱导分化形成新的组织细胞的特性,移植ES细胞可使坏死或退化的部位得以修复并恢复正常功能；⑤随着组织工程技术的发展,通过ES细胞体外诱导分化,定向培育出人造组织器官,用于器官移植,解决供体器官缺乏和器官移植后免疫排斥的问题.（三）胚胎工程的应用1.体外受精和胚胎的早期培养(1)卵母细胞的收集和培养：主要方法：用促性腺激素处置,使其排出更多的卵子,然后,从输卵管中冲取卵子,直接与获能的精子在体外受精.第二种方法：从刚屠宰母畜的卵巢中收集卵母细胞；第三种方法是借助超声波探测仪、腹腔镜等直接从活体植物的卵巢中吸取卵母细胞.收集的卵母细胞,都要在体外经人工培养成熟后,才华与获能的精子受精.(2) 精子的收集和获能：在体外受精前,要对精子进行获能处置.(3) 受精：获能的精子和培养成熟的卵细胞在获能溶液或专用的受精溶液中完成受精过程.(4)胚胎的早期培养：精子与卵子在体外受精后,应将受精卵移入发育培养液中继续培养,以检查受精状况和受精卵的发育能力.培养液成份较复杂,除一些无机盐和有机盐外,还需添加维生素、激素、氨基酸、核苷酸等营养成份,以及血清等物质.当胚胎发育到适宜的阶段时,可将其取出向受体移植或冷冻保管.分歧植物胚胎移植的时间分歧.(牛、羊一般要培育到桑椹胚或囊胚阶段才华进行移植,小鼠、家兔等实验植物可在更早的阶段移植,人的体外受精胚胎可在8~16个细胞阶段移植.)2.胚胎移植(1)胚胎移植是指将雌性植物的早期胚胎,或者通过体外受精及其它方式获得的胚胎,移植到同种的、生理状态相同的其它雌性植物的体内,使之继续发育为新个体的技术.其中提供胚胎的个体称为“供体”,接受胚胎的个体称为“受体”.（供体为优良品种,作为受体的雌性植物应为罕见或存量年夜的品种.）位置：如转基因、核移植,或体外受精等任何一项胚胎工程技术所生产的胚胎,都必需经过胚胎移植技术才华获得后代,是胚胎工程的最后一道“工序”.(2) 胚胎移植的意义：年夜年夜缩短了供体自己的繁殖周期,充沛发挥雌性优良个体的繁殖能力.(3) 生理学基础：①植物发情排卵后,同种植物的供、受体生殖器官的生理变动是相同的.这就为供体的胚胎移入受体提供了相同的生理环境.②早期胚胎在一按时间内处于游离状态.这就为胚胎的收集提供了可能.③受体对移入子宫的外来胚胎不发生免疫排斥反应.这为胚胎在受体的存活提供了可能.④供体胚胎可与受体子宫建立正常的生理和组织联系,但供体胚胎的遗传特性在孕育过程中不受影响.(4) 基本法式主要包括：①对供、受体的选择和处置.选择遗传特性和生产性能优秀的供体,有健康的体质和正常繁殖能力的受体,供体和受体是同一物种.并用激素进行同期发情处置,用促性腺激素对供体母牛做超数排卵处置.②配种或人工授精.③对胚胎的收集、检查、培养或保管.配种或输精后第7天,用特制的冲卵装置,把供体母牛子宫内的胚胎冲刷出来(也叫冲卵).对胚胎进行质量检查,此时的胚胎应发育到桑椹或胚囊胚阶段.直接向受体移植或放入－196℃的液氮中保管.④对胚胎进行移植.⑤移植后的检查.对受体母牛进行是否妊娠的检查.3.胚胎分割(1)概念：是指采纳机械方法将早期胚胎切割2等份、4等份等,经移植获得同卵双胎或多胎的技术.(2)意义：来自同一胚胎的后代具有相同的遗传物质,属于无性繁殖.(3)资料：发育良好,形态正常的桑椹胚或囊胚.（桑椹胚至囊胚的发育过程中,细胞开始分化,但其全能性仍很高,也可用于胚胎分割.）(4)把持过程：对囊胚阶段的胚胎分割时,要将内细胞团均等分割,否则会影响分割后胚胎的恢复和进一步发育.专题4 生物技术的平安性和伦理问题（一）转基因生物的平安性争论：(1)基因生物与食物平安：反方观点：反对“实质性同等”、呈现滞后效应、呈现新的过敏原、营养成份改变正方观点：有平安性评价、科学家负责的态度、无实例无证据(2)转基因生物与生物平安：对生物多样性的影响反方观点：扩散到种植区之外酿成野生种类、成为入侵外来物种、重组出有害的病原体、成为超级杂草、有可能造成“基因污染”正方观点：生命力有限、存在生殖隔离、花粉传布距离有限、花粉存活时间有限(3)转基因生物与环境平安：对生态系统稳定性的影响反方观点：打破物种界限、二次污染、重组出有害的病原微生物、毒卵白等可能通过食物链进入人体正方观点：不改变生物原有的分类位置、减少农药使用、呵护农田土壤环境（二）生物技术的伦理问题(1)克隆人：两种分歧观点,大都人持否定态度.否定的理由：克隆人严重违反了人类伦理品德,是克隆技术的滥用；克隆人冲击了现有的婚姻、家庭和两性关系等传统的伦理品德观念；克隆人是在人为的制造在心理上和社会位置上都不健全的人.肯定的理由：技术性问题可以通过胚胎分级、基因诊断和染色体检查等方法解决.不成熟的技术也只有通过实践才华使之成熟.中国政府的态度：禁止生殖性克隆,不反对治疗性克隆.四不原则：不赞成、不允许、不支持、不接受任何生殖性克隆人的实验.(2)试管婴儿：两种目的试管婴儿的区别两种.分歧观点,大都人持认可态度.否定的理由：把试管婴儿看成人体零配件工厂,是对生命的不尊重；早期生命也有活下去的权利,抛弃或杀死过剩胚胎,无异于“谋杀”.肯定的理由：解决了不育问题,提供骨髓中造血干细胞救治患者最好、最快捷的方法,提供骨髓造血干细胞其实不会对试管婴儿造成损伤.(3)基因身份证：否定的理由：个人基因资讯的泄漏造成基因歧视,势必造成遗传学失业年夜军、造成个人婚姻困难、人际关系疏远等严重后果.肯定的理由：通过基因检测可以及早采用预防办法,适时进行治疗,到达挽救患者生命的目的.（三）生物武器(1)种类：致病菌、病毒、生化毒剂,以及经过基因重组的致病菌.(2)散布方式：吸入、误食、接触带菌物品、被带菌昆虫叮咬等.(3)特点：致病力强、大都具沾染性、沾染途径多、污染面广、有潜伏期、不容易被发现、危害时间长等.(4)禁止生物武器公约及中国政府的态度不发展、不生产、不贮存生物武器,并反对生物武器及其技术和设备的扩散.专题5 生态工程1．生态原理2．生态工程实例分析3.受损生态环境的重要作用的同时,不要忘记年夜自然固有的强年夜的生态恢复力量；更不能误认为只要有了生态工程,就可以走发达国家“先污染、破坏,后治理”的老路.附页：1.离体的植物器官、组织或细胞―（脱分化）→愈伤组织―（再分化）→试管苗―→植物体2.除去细胞壁的酶：纤维素酶和果胶酶.3.植物培养基中的激素：细胞分裂素和生长素,当生长素的含量高于细胞分裂素时,主要诱导植物细胞脱分化和根原基的形成；当细胞分裂素的含量高于生长素时,主要诱导植物细胞再分化和芽原基的形成.4.各培养基成份比力：5.体细胞核移植用去核的卵母细胞的原因：①体积年夜,易把持②营养多※③激发细胞核的全能性.6.精子的发生：从初情期开始,细胞核→头部,高尔基体→顶体,线粒体→线粒体鞘,中心体→尾7.卵子的发生：在胚胎性别分化后,卵巢内的卵母细胞通过有丝分裂增加其数量.排卵：马排出低级卵母细胞,绵羊,牛等排出次级卵母细胞.8.判断卵子受精的标识表记标帜：在卵黄膜和透明带的间隙看到两个极体.9.受精：场所：输卵管准备：精子获能（体外受精时,使用一定浓度的肝素或者钙离子载体A23187溶液）,卵子在受精前也要经历类似精子获能的过程. 受精阶段：获能精子与卵子相遇,首先发生顶体反应,释放的顶体酶可直接溶解卵丘细胞质之间的物质,并在透明带融出一条通道,当精子与卵黄膜接触时,与卵黄膜融合,精子入卵.10.防止多精入卵的两道屏障：透明带反应、卵黄膜封闭作用11.牛的体外受精技术最高.12.胚胎移植最重要意义：胚胎移植可充沛发挥雌性优良个体的繁殖潜力.13.使用性激素使受体和供体母牛进行同期处置,使用促性腺激素增进供体母牛超数排卵.。
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RRSV-S5 导入PTXB1基因工程设计实验设计：一、酶切位点的选择二、载体的酶切方案三、引物的设计四、RT-PCR的程序的设计五、基因的酶切方案六、克隆的筛选方案前言RRSV属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)水稻病毒属(Oryzavirus)。
RRSV的基因组由10个dsRNA组成，根据它们在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率，依次命名为S1一S10，其大小为1．2～3．9 kb。
一：RRSV-S5序列获取：登陆NCBI查找RRSV-S5序列如下所示：LOCUS NC_003759 2682 bp ds-RNA linear VRL 10-JUL-2008DEFINITION Rice ragged stunt virus segment 5, complete sequence.Waterhouse,P.M.TITLE Direct SubmissionORIGIN1 gataaaactc tcgaagcaaa cacattcccc cacgcgacca ccgtaaaacc aatggacaag61 ttcgctgaga tcagaaagag acttaaacag aaacacaatg aatggcttca acagacagca121 gcagagagaa ttgagcaaga cgcaggaatt aagatgacgg ctcgtacaat tcaaggactg181 agaatcacca ggaactcaaa gaacgacgag tcaagcctcc acgttgattc cgcaacagac241 ttggaaatgg atgttactgg cgcgagcaaa tttgagtcga agaaagagac gtttgactat301 agacctaaca ccagctcgag tcggatcgtt cttaccccaa agtcaaatga ttgtaaaacg361 gagaagaagt tggtcagcgg agacgatgtc acggaaatca gtcgtccaac atcaagtagc421 gctgtcgaga tatctgagct gccagaggta tgtgttaaag ttgtgttttc tcagccatgt481 gatgtcagtc ggtacccatc ggacgcaaca aaagtgagaa taacaaaatg tgatcatgcc541 aattggagag gatggcgatc gtttttgcac gctttaggca tatgtaaccg cgagatacaa601 gacagtttct tagaacaggc ggcatcgggt tgttctgcac atgttaagga tgtggttact661 gcgtttgata gaggtgagaa tttggagcta ctgtgtgcaa 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MCS的分析(4)质粒的抽提：Protocal:(5)RRSV-S5-ORF酶谱分析:根据RRSV-S4-ORF酶谱的分析，有EcoRI，NheI ，NotI和SapI可用选用EcoRI和NheI两个限制性内切酶。