摘要

摘要
一．立项的依据和意义
生物表面活性剂是微生物或植物在一定条件下培养时，在其代谢过程中分泌出的具有一定表面活性的代谢产物，如糖脂､多糖脂､脂肽或中性类脂衍生物等。

它们不仅具有化学表面活性剂具有的各种表面性能,而且还拥有下列优点:①选择性广,对环境友好;②庞大而复杂的化学结构使得表面活性和乳化能力更强;③分子结构类型多样,具有许多特殊的官能团,专一性强;④原料在自然界广泛存在且价廉;⑤发酵生产是典型的“绿色”工艺等。

生物表面活性剂作用十分广泛，在环保，药物、食品、化妆品、个人卫生用品及其他领域都有十分重要的意义。

但是其的产生菌数量少，种类单一，且产量有待提高。

生物产生的生物表面活性剂包括许多不同的种类。

依据他们的化学组成和微生物来源可分为糖脂、脂肽和脂蛋白、脂肪酸和磷脂、聚合物和全胞表面本身等五大类。

其中糖脂和脂肽最为重要。

糖脂类生物表面活性剂数量最大，种类最多。

分子结构庞大、复杂，除具有降低表面张力、稳定乳化液和增加泡沫、生物相容性好、无毒、能生物降解、无污染，专一性和良好的选择性等优点外，某些糖脂类生物表面活性剂还具有良好的抗菌性能，良好的化学稳定性，耐强碱、强酸，有多种多样的药理作用和免疫功能等。

脂肽类生物表面活性剂除了具有较强的表面活性外，部分还具有抗病毒、抗肿瘤、抗凝血、消炎等生物活性。

因此，我们此次论文主要以糖脂类和脂肽类的生物表面活性剂的筛选与优化为课题。

二．国内外研究现状及发展动态分析
早在20世纪40年代，Zobell在研究硫酸盐还原细菌从沙粒中释放原油的机制时就指出，微生物产生表面活性剂是细菌驱油的主要机制之一。

1949年利用假单胞菌生产生物表面活性剂鼠李糖脂。

1955年Hasking发现黑粉菌在葡糖糖培养上可产生赤藓糖醇、甘露糖和高级脂肪酸酯化的糖脂。

1957年，捷克的Dostalek和Spumy把脱硫弧菌（Desulfovibrio）和假单胞菌同糖蜜一起注入油层，原油产量提高。

他们认为，可能是细菌产生的表面活性物质，改变了岩石-油-水三相系统的界面张力所致。

1979年Belsky从乙酸不动杆菌的发酵液中
分离出由杂多糖和脂肪酸构成的脂多糖。

20世纪70年代后期，研究发现可以利用生物合成法生产生物表聚甘油脂肪酸酯。

1996年张念湘用硅胶吸附糖和脂肪酶，在有机溶剂中与乙酸酐酰化合成糖脂。

在糖脂中，人们最熟悉的是槐糖脂和鼠李糖脂。

槐糖脂主要由酵母产生，Mager等人采用球拟酵母发酵豆油得到的槐糖脂是一种性能优越的乳化剂，常用于配制洗发香波，具有去头屑功效。

鼠李糖脂具有较高的分散、乳化、发泡和渗透能力，Jarvis和Johnson第一次报导了用绿脓假单胞菌产生含鼠李糖的糖脂。

60年代后，石油业开始发展，微生物对烃类物质的乳化机制引起关注。

对提取的微生物表面活性剂集中于结构、性能、生物合成及调控的研究。

1968年，Arima等首次从枯草芽胞杆菌发酵液中发现表面活性素（Surfactin），该化合物具有较强的表面活性，属于脂肽类表面活性剂。

1997年Nakayama等利用重组枯草杆菌生产一种新型的Surfactin。

2001年V e e n a n a d i g等将枯草杆菌FE-2接种在以小麦糠为原料的30L的生物反应器中，得到一种能分散有机磷杀虫剂Fenthion的生物表面活性剂。

近年来，随着研究的不断深入，出现了一些新型生物表面活性剂，如蔗糖酯是一种新型的多元醇型非离子表面活性剂。

赵裕蓉等将解烃棒状杆菌接种在以蔗糖为唯一碳源的培养基上能够产生蔗糖酯，并对其进行了定性定量检测。

目前，英国、加拿大和日本等国家的研究人员对生物表面活性剂进行了大量的基础研究和应用开发，研制了一些新型表面活性剂，极大地拓宽了表面活性剂的应用领域。

国内对生物表面活性剂的研究较晚，大多数处于实验研究阶段，主要针对生物表面活性产生菌的筛选和培养条件的优化方面进行研究和探索。

现在生物表面活性剂产生菌主要有铜绿假单胞菌、红串红球菌、枯草芽孢杆菌、短芽孢杆菌、裂烃棒杆菌、热带假丝酵母等。

三．研究的目的、内容及方案
(一)研究目的
生物表面活性剂具有广泛的市场前景。

由于生物表面活性剂是某些微生物的次级代谢产物，具有低毒、易于生物降解、能在极限条件下起作用、具有环境友
好等特性，自入市以来受到各个领域的广泛关注，在石油开采、药物、食品、化妆品、个人卫生用品、环境保护及其他工业领域展示了独特的应用前景。

本研究通过对糖脂类和脂肽类生物表面活性剂产生菌的筛选和优化的研究，选出高产生物表面活性剂的菌株，并研究其最适生长条件，以促进生物表面活性剂在各个方面的利用。

（二）研究内容
1.通过筛选选出产生生物表面活性剂的菌株
生物表面活性剂产生菌菌种决定了生产生物表面活性剂的量，如何在众多微生物中快速有效的筛选出高产生物表面活性剂的菌株是实验的重点。

我们此次研究先设计筛选培养基，将各菌株分离纯化，然后通过排油圈筛选法，表面张力法，及傅里叶红外光谱筛选法，液滴坍塌法从大量菌株中选育出产生生物表面活性剂能力较高的菌株。

2.生物表面活性剂菌株发酵条件优化
采用单因素影响实验的方法对各菌株的发酵条件进行优化，筛选出适合工业生产的培养基，对于影响生物表面活性剂生产的碳源、氮源、温度、pH、装液量等环境因素进行优化。

（三）研究方案
（1）初筛：
1）从油田土壤中，去其表层大约5cm的土层，取其下层土壤，将样品放入无菌袋内备用。

2）取2g土样在无菌条件下置于含有玻璃珠的盛有100ml正十二烷富集培养基的250mL三角瓶中，120r/min摇床震荡培养2h后，静止30-60min，移取5ml上清液到含有100ml正十二烷富集培养基的250ml三角瓶中。

将三角瓶置于震荡培养箱30℃，120r/min震荡培,5d。

再取5ml富集液接入相同的正十二烷富集培养基中，以同样的条件进行两次转接培养。

3）取1）中的培养液做适当稀释，取适当稀释度的菌悬液在斜面培养基上进行平板涂布分离。

4）取生长较好的不同形态的菌落用稀释涂平板法纯化，如此反复几次获得纯培养。

（2）复筛：
A.排油圈的测定：
排油圈是检测生物表面活性剂较为常用的一种方法，其具体筛选步骤是：
a.将分离的微生物进行培养；
b.在一个玻璃皿（D=9cm）中加入蒸馏水，然后加入适量的液体石蜡；
c.待液体石蜡均匀分布于水面上后，在其表面加入培养液，如果产生排油圈则证明培养液中存在生物表面活性剂，反之，则证明该培养液中无生物表面活性剂。

此方法是对生物表面活性剂的产生进行定性和定量的最佳方法，该方法操作简单，所测得的实验数据准确可靠，可根据排油圈直径数据来计算生物表面活性剂的产量和培养液的表面张力，利用这种方法将大大简化对生物表面活性剂条件的优化试验。

但此方法各批次实验之间由于油膜厚度不同，导致结果可比性差，研究发现排油圈直径不仅与生物表面活性剂浓度有关，还与油膜厚度有关。

由于水和石蜡都是透明液体，不容易观察排油圈，另外据研究表明使用石蜡作为油性物质考察排油圈时对生物表面活性剂的量要求很高，即需要大量的发酵液样品，并且排油的效果不明显。

为避免以上的两个缺点，采用正十二烷替代石蜡，并在正十二烷中加入适当苏丹红。

B.表面张力测定法：
采用表面张力仪于室温下用环法测定表面张力。

本次试验拟定通过测定发酵液表面张力而确定是否有生物表面活性剂的存在。

因为若发酵液中含有生物表面活性剂，则发酵液表面张力必然显著降低。

表面张力测定仪的工作原理是将高频感应微小位移自动平衡测量系统应用到扭力天平中去，即作用到铂环上的力发生改变时，与铂环所连接的平衡杆在两个涡流探头中产生位移，使两个涡流探头中产生的电感量发生变化，由此引起差动变压器失去平衡，随之电路中差动放大器的输入信号也失去平衡，经放大器放大后输出随铂环受力变化而变化的电信号，此信号送到微机处理机中进行处理，仪器自动计算出被测实验的实际张力。

C.液滴坍塌法：
液滴坍塌法是一种快速、灵敏的筛选方法而且还可以定量分析微生物所产生的表面活性剂。

它是利用含有表面活性剂的液滴不能在油层表面形成稳定的液珠，溶液中不含表面活性剂的液滴不能在油水界面上液珠形态进行筛选的。

表面活性剂液滴稳定性与溶液的表面张力有关，但与其乳化活性无关。

测定是在一个有96个微槽的微孔板上进行，每个微槽内都覆盖一层油，然后加入5微升的样品液滴，一分钟后观察，可以通过液滴的聚集、轻微分散或完全散开来判断表面活性物质的量。

此种方法需要很少的样品量，能够测量较大的有效浓度范围，且不需要特殊的设备。

（3）用特征显色法鉴别糖脂类和脂肽类
薄层层析法：
薄层层析是一种简便、快捷、微量的层析方法。

一般将柱层析用的吸附剂撒布到平面如玻璃上，形成一薄层进行层析时即称薄层层析。

其特点是操作简便，设备简单，不需要特殊设备，分离效果较好，时间较短，一块板可以同时分离许多样品。

其中，糖脂的显色剂为苯酚-硫酸试剂，糖脂显棕色斑点；脂肽的显色剂为0.5％茚三酮溶液，脂肽显红色。

（4）菌株发酵条件优化
A.碳源：
培养基中原碳源为正十二烷，在无菌的条件下，将正十二烷分别改为葡萄糖、植物油、可溶性淀粉、乳糖，用量与正十二烷相同。

震荡培养120h后，分别测其表面张力并比较。

B.氮源：
培养基中原氮源为氮源酵母粉。

将酵母粉换为尿素、牛肉膏、氯化铵、硝酸，用量与原酵母粉的量相同，配成培养基。

在相同条件下，震荡培养120h后，分别测其表面张力并比较。

C.pH：
将配制好的培养基的pH分别调成3、4、5、6、7、8、9、10。

然后将培养后的菌株震荡培养120h后，用分光光度计测量各培养液在600nm处的吸光值。

D.装液量：
将配制好的培养基分装至300mL的三角瓶中，每个三角瓶的分装量分别为30mL、50mL、80mL、100mL、120mL。

将培养后的菌液分别震荡培养120h后测量各培养液的张力。