用两步MS-PCR结合ELISA检测HIV-1逆转录酶基因的耐药性突变

中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００６，２６（８）：４２～４６用两步ＭＳ—ＰＣＲ结合ＥＬＩＳＡ检测ＨＩＶ一１逆转录酶基因的耐药性突变术何红秋程绍辉”刘斌陈慰祖王存新”（北京工业大学生命科学与生物工程学院北京１０００２２）摘要高效抗逆转录病毒治疗法（ＨＡＡＲＴ）的推广使用有效地抑制了ＨＩＶ．１病毒的传播和艾滋病（ＡＩＤＳ）的发病率、死亡率。

近年来，ＨＩＶ一１逆转录酶基因突变所导致的耐药性已成为ＨＡＡＲＴ治疗失败的主要原因，耐药性突变的检测对于指导病人用药以及新药开发具有重要意义。

发展了一种检测ＨＩＶ一１逆转录酶基因耐药性突变的新方法。

采用两步ＭＳ—ＰＣＲ方法检测ＨＩＶ一１Ｂ亚型野生型和耐药突变型逆转录酶基因突变，检测点包括Ｍ４１Ｌ、Ｋ７０Ｒ、Ｋ１０３Ｎ、Ｙ１８１Ｃ和ｒｒ２１５，并在两步Ｍｓ—ＰｃＲ基础上，设计比野生型引物长的突变型引物，结合微孔板杂交ＥｕｓＡ呈色技术检测各点突变。

结果显示，简化的两步Ｍｓ—ＰＣＲ能保持灵敏度和特异性高的优点，ＥｕＳＡ的阳性结果与阴性结果的比值（Ｐ／Ｎ）达到要求，两步Ｍｓ－ＰｃＲ结合ＥｕＳＡ方法灵敏度高，操作简单、结果直观、成本低、相对耗时短且能进行高通量检测，使其无论在ＨＩＶ一１耐药性突变及其它的点突变检测中都具有较好的临床应用前景。

关键词两步ＭＳ—ＰＣＲＥＵＳＡＨＩＶ．１逆转录酶基因耐药性中图分类号：Ｑ９３９．４人类免疫缺陷病毒１型（ｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｄｅ６ｃｉｅｎｃｙｖｉｒｕｓｔｙｐｅ１，ＨＩＶ．１）的迅速传播引起的人类获得性免疫缺陷综合症（ａｃｑｕｉｒｅｄｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＡＩＤｓ）已经夺走了全球大约２０００万人的生命¨Ｊ。

高效抗逆转录病毒治疗法（ｈｉｇｈｌｙａｃｔｉｖｅａｎｔｉ．ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｔｈｅｒａｐｙ，ＨＡＡＲＴ）被用作治疗ＨＩＶ一１感染病人的标准疗法口。

，该方法的推广使用，对于延长感染者寿命，提高其生存质量起到了巨大作用口１。

但是ＨＩＶ．１耐药突变毒株的出现和传播，严重影响了ＨＡＡＲＴ的治疗效果Ｈｊ。

耐药性突变通常以字母、数字、字母的方式表达，第一个字母代表野生型病毒氨基酸残基，数字代表该残基在蛋白质中的位置，第二个字母代表突变型病毒氨基酸残基Ｍ１。

例如：Ｍ４１Ｌ表示病毒第４１个氨基酸残基由野生型的蛋氨酸（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ，Ｍ）突变为亮氨酸（１ｅｕｃｉｎｅ，Ｌ），文中所有突变均以该方法表示。

在大收稿日期：２００６・０４．２８修回日期：２００６ＪＤ５・１５ｔ国家自然科学基金资助项目（３０５００４２９），北京市教委基金面上项目Ｋ＾１２００５１０００５００１），北京市教委重点项目（１湿００４１０００５００２）｝｛通讯作者，电子信箱：ｃｘｗａＩｌｇ＠ｂｊｕｔ．ｅｄｕ．ｃｎ．规模使用ＨＡＡＲＴ前，我国ＨＩＶ感染者中耐药相关突变尚处于低流行状态，应当在用药过程中定期监控以减少耐药突变的产生与传播ＨＪ。

这就要求有一种操作较简单、灵敏度和特异性较高的可靠的耐药性检测方法。

ＨＩＶ－１耐药性检测方法分为基因型检测方法和表型检测方法，基因型检测具有可提供交叉耐药资料，所需的时问短（几天或几小时），技术步骤少，费用较便宜等优点，主要包括ＤＮＡ序列分析法和分子杂交分析法。

６。

基于ＲＴ—ＰｃＲ扩增后的ＤＮＡ测序方法被称为ＨＩＶ耐药性临床检测中的黄金标准ｏ７Ｉ，该方法准确性高，但对野生型和突变型混和毒株检测时灵敏度较低…，受到亚型特异性的限制Ⅲ，而且成本较高‘９１。

其它的基因型检测法包括基因芯片技术受到灵敏度较低的限制¨…。

突变分离的ＰＣＲ（ｍｕｔａｇｅｎｉｃａｌｌｙ—ｓｅｐａｒａｔｅｄＰＣＲ，ＭＳ．ＰＣＲ）¨川是一种基于ＰＣＲ的点突变检测方法，该方法特异性较高，应用于ＨＩＶ．１耐药性突变检测，取得了较好的结果［７’９＇““３Ｉ。

本研究以Ｍｓ．ＰＣＲ方法为出发２００６，２６（８）何红秋等：用两步Ｍｓ—ＰＣＲ结合ＥＬＩｓＡ检测ＨＩｖ一１逆转录酶基因的耐药性突变４３点，发展并研究了两步ＭＳ－ＰｃＲ方法的特异性和灵敏度，在此基础上，改变传统Ｍｓ－ＰｃＲ中引物设计，使突变型引物长于野生型引物，基于突变型引物中多出的片段设计寡核苷酸探针，运用核酸杂交和酶联免疫吸附实验（ＥｕｓＡ）检测耐药性突变。

１材料和方法１．１材料阳ｃ－１００ＰｅｌｔｉｅｒＴｈｅ瑚ａｌｃｙｃｌｅｒＰｃＲ仪，５５０型酶标仪（美国伯乐生命医学产品有限公司，Ｂｉｏ—Ｒａｄ）；ＣｏｖａＬｉｎｋＮＨＭｏｄｕｌｅ酶标板（丹麦Ｎｕｎｃ公司）；ＤＹＹ－７ｃ电泳仪（北京六一仪器厂）。

ｚＢ－２４２２碱磷酶标记链亲和素（北京中杉金桥生物技术有限公司）；ＴａｑＤＮＡ聚合酶（北京天为时代科技有限公司）；聚蔗糖Ｆｉｃｏｌｌ４００、ＢＳＡ、ＰＶＰ４０、鲑鱼精ＤＮＡ、Ｐ．ＮＰＰ等购自北京欣经科生物技术有限公司；ｌ－甲基咪唑（１一ｍｅｔｈｙｌｉｍｉｄａｚｏｌｅ）、ｌ－ｅｔｈｙｌ．３（３－ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎ叩ｒｏｐｙｌ）一ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ（ＥＤＣ）购自百灵威化学技术有限公司。

含ＨＩＶ－１Ｂ亚型毒株基因的质粒（野生型标准株和Ｍ４１Ｌ、Ｋ７０Ｒ、Ｋ１０３Ｎ、Ｙ１８１ｃ、Ｔ２１５Ｆ耐药变异株）由本实验室保存。

ＰＢｓ—Ｔ（ＰＢｓ—Ｏ．１％Ｔｗｅｅｎ２０），杂交液（０．２５９／ＬＦｉｃｏｌｌ４００，０．２５９／ＬＢＳＡ，０．２５９／ＬＰＶＰ，０．０６２５９／Ｌ鲑鱼精ＤＮＡ，６×ｓｓｃ），ＤＮＡ变性缓冲液（１．５ｍｏＬ／ＬＮａＣｌ，０．５啪Ｌ／ＬＮａｏＨ），显色底物［６．７ｍ咖Ｌ／ＬＰ－ＮＰＰ，０．１咖Ｌ／ＬＮａ２Ｃ０３（ｐＨ９．５），２姗０Ｌ／ＬＭｇＣｌ２］，封闭液（０．５％ＰＶＰ４０，０．２５％Ｆｉｃｏｕ４００，０．５％ＢｓＡ）由实验室配制。

１．２方法Ｍｓ—ＰｃＲ包括３轮ＰｃＲ反应，第１轮用ｌ对引物，后两轮均使用３个引物：根据模板链设计的１对Ｍｓ—ＰｃＲ引物和根据互补链设计的公用引物，Ｍｓ—ＰｃＲ引物３’末端的碱基互异，分别与相应模板配对，Ｍｓ－ＰＣＲ引物的３’端２～４位各引入１个突变，且引入位点互不相同，则第二轮ＰｃＲ产物３’的４个碱基有３个位点各异，第３轮Ｍｓ—ＰｃＲ引物不变只改变公用引物，引物和模板的错配由单碱基增至三碱基，提高特异性。

野生型引物较突变型引物长２０ｍｅｒ，ＰｃＲ扩增片段在３％的琼脂糖凝胶电泳中得以区别＂・１１］。

１．２．１引物设计根据ＮｃＢＩ数据库中中国ＨＩＶ一１的ｇａｇ－ｐｏｌ基因序列进行比对，设计公用引物和杂交探针如表１和Ｍｓ—ＰｃＲ引物如表２，简并代码：Ｍ＝（Ａ／ｃ），Ｗ＝（Ａ／Ｔ），Ｒ＝（Ａ／Ｇ），Ｙ＝（Ｃ／Ｔ），Ｋ＝（Ｇ／Ｔ），Ｎ＝（Ａ／Ｇ／ｃ／Ｔ）。

（５，ｂｉｏｔｉｎ＝５’生物素标记，５’Ｐ＝５’磷酸化标记）。

表１各点突变检测的公用引物和杂交探针序列Ｔａｂｌｅ１Ｃ咖ｍｏｎｐｒｉｍｅ璐ａｎｄｈｙｂｒｉｄｐｍｂｅ∞ｑｕｅｎｃｅｆｏｒｐ咖ｔｍｕｔａ６蚰ｄｅｔｅｃｔｉｏ哪表２ＭＳ－ＰＣＲ检测ＨＩＶ－１Ｒｒ基因突变的等位基因特异性引物及与公用引物ＰＣＲ扩增片段长度Ｔａｂｌｅ２ＡＵｅｌｅ－ｓｐｅｃｍｃｐｒｉｍｅ聪ｕｓｅｄｆｏｒＭＳ－ＰＣＲｄｅｔｅｃｔｉｃ吣ｏｆ删ｔａ廿。

璐ｉｎＨⅣ一１ＲｒａｎｄｔｈｅＰＣＲｐｒｏｄｕｃｔｆｈ静吡ｅｎｔｌ蚰ｇｔｈｗｉｔｈ咖珈吣ｎｐｒｉｍｅ璐ＭＳ・ＰＣＲｐｒｉｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅＦ阳目ｍｅｎｔｌｅｎｇ：ｔｌｌ４１Ｗ５’７ＩＴＲＴＡＴＧＧＡＴｒＫＴＣＡＧＧＣＣＣＡＡＡＡＴＩ’ＧＷＡＡＴ兀’ＩＹＣＣ７ＩＴＣＣＴｒＹＴＡＣＡＴ３’４１Ｍ５’ＴＩＴＩＴＧＷＡＡＴＩＴＩＹＣＣＴＴＣＣＴＩＴＹＣＡＧ３’７０Ｗ５’Ｇ７兀’ｃＮＣＴＧＡＡＴＩ℃ＴＡＣＴＡＡＴｒＩ＇Ｉ．ＣＴＣＣＡＧＴ３’７０Ｍ５’ＲＴＮＴＴＧＡＧｌｌ℃ＴＹＴＴＡＴＴＡＲＴＧＴＣＮＣＴＧＡＡＴＴＣＴＡＣＴＡＡ７ｒＴｒＴＣ７Ｉ℃ＡＡＴＣ３’１０３Ｗ５’ＴＣＭＣＣＣＡＣＡＴＣＹＡＧＴＡＹＴＧＴＴＲＣ７ｒＧＡＴＧＴＴ３’１０３Ｍ５’ＡＧＧＧＡＡＣＴＧＡＡＡＡＡＴＡＴＧＣＡＧＡＭＣＣＣＡＣＡ７Ｉ℃ＹＡＧＴＡＹＴＧＴｒＲＣＴＧＡＧＴＩ’Ｇ３’１８ｌＷ５’ＴＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＡＴＣＣＡＧＡＭＡＴＡＧＷＴＡＴＡＴＡ３’１８１Ｍ５’ＡＣＡＡＡＡＡＴＣＴＴＡＧＡＧＣＣＹＴＴＡＴＧＡＡＡＡＣＡＡＡＡＴＣＣＡＧＡＭＡＴＡＧＷＴＡＧＣＴＧ３’２１５Ｗ５’ＡＧＡＣＡＡＣＡＴＣＴＧＴＫＧＡＧＧＴＧＧＧＧＡＣ７Ｉ’ＧＡＣ３’２１５Ｍ５’ＡＧＡＡＣＡＡＡＡＡＴＡＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＡＡＣＡＡＣＡＴＣＴＧＴＫＧＡＧＧＴＧＧＧＧＡＣＧＴＩＴ３’２０１ｂｐ１７９ｂｐ２６８ｂｐ２９９ｂｐ２９１ｂｐ３１ｌｂｐ２００ｂｐ２２０ｂｐ１５７ｂｐ１７８ｂｐ４４中国生物工程杂志ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＶｏｌ－２６Ｎｏ．８２００６１．２．２两步ＭＳ．ＰＣＲ检测耐药性突变简化的Ｍｓ－ＰｃＲ由两步组成，第一轮使用引物Ｐ。

（５’ＧＴＡＣＡＧＴＡＴＴＡＧ７Ｉ＇ＡＧＧＡＣＣＹＡＣＡＣＣＴＧＴＣ３’）和Ｐ２（５’ＧＡＴＡＴＧＴｃｃＡ７兀ＢＧｃｃＴＴＧＣｃ３’）各０．１仙ｍｏＬ／Ｌ扩增条件：４ｍｉｎ９４℃，９×（１ｍｉｎ９４ｃｃ，１ｍｉｎ５８℃，１ｍｉｎ７２℃），５ｍｉｎ７２℃。

第二轮使用ＭＳ．ＰＣＲ引物野生型（ｗ）０．０５斗ｍｏＬ／Ｌ，突变型（Ｍ）０．１斗ｍｏＬ／Ｌ，公用引物０．０５斗ｍｏＬ／Ｌ，扩增条件：４ｍｉｎ９４℃，３５×（１ｍｉｎ９４℃，１ｍｉｎ５５℃，１ｍｉｎ７２℃），１０ｍｉｎ７２℃，３％琼脂糖凝胶电泳检测ＰｃＲ产物。

１．２．３微孔板杂交．ＥＵＳＡ呈色检测突变杂交探针溶于１０ｍｍｏＬ／Ｌ预冷的１．甲基咪唑（ｐＨ７．０）至终浓度６斗ｇ／斗ｌ，取７５灿ｌ加入酶标孔中，与２５肛ｌ０．２ｍｏＬ／ＬＥＤＣ混匀，５０℃水浴５ｈ。

５０℃ＮａＯＨ－ｓＤｓ洗液２００斗ｌ洗板３次。

加入２００¨ｌ封闭液后包被的ＣｏｖａＬｉｎｋＮＨ板在４℃下可以保存数月仍能使用。

取Ｍｓ．ＰｃＲ扩增产物１５斗１，加入等量ＤＮＡ变性缓冲液，室温５ｍｉｎ，取２５山加入微孔板，加入１００斗ｌ杂交液，３７℃ｌｈ，ＰＢｓ－Ｔ洗涤３次，加入１００汕ｌ碱性磷酸酶标记的亲和素（ＰＢｓ１／１０００稀释），３７“１１ｈ，ＰＢｓ－Ｔ洗板３次，２００斗ｌ显色底物避光显色３０ｍｉｎ，０．１ｍｏＬ／ＬＮａＯＨ终止，酶标仪测定Ａ加，。

２结果Ｍ４１Ｌ、Ｋ７０Ｒ、Ｋ１０３Ｎ、Ｙ１８１Ｃ和他１５Ｆ的ＭＳ—ＰＣＲ检测均使用Ｍｓ．ＰｃＲ引物，无论野生型或是突变型，长引物在ＰｃＲ体系中浓度为０．０５仙ｍｏＬ／Ｌ而短引物为Ｏ．１斗ｍｏＬ／Ｌ，每个点均选取野生型（ＷＴ）模板、混合模板（ｗｒ／ＭＴ＝１９：１，９：１，２：１，１：１）、突变型（ＭＴ）模板进行扩增，从检测结果可以看到（图１）：只有一种模板（野生型或突变型）存在时，其扩增产物只有一条与之对应的特异带，两种模板按照一定比例混合时，检测极限一般能达到１０％，即ｗｒ／ＭＴ＝９：ｌ，如图２中Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ的泳道３，与文献报道的结果一致＂１，因此可以认为，简化的两步Ｍｓ．ＰｃＲ方法能够达到较好的特异性和灵敏度。