毛霉的产蛋白酶发酵条件优化
实验二 霉菌产蛋白酶发酵培养基条件的确定
实验二雅致放射毛霉产蛋白酶培养基本的确定1、种子培养基(实验老师准备4个100ml种子)培养基组成:100ml:豆粕粉3g,饴糖0.5g,酵母膏0.1g,MgSO40.2g,KH2PO40.2g。
高压灭菌锅,121℃,20min灭菌。
灭菌操作完毕,将上述物品并洗耳球转入超净台,接种前20min进行紫外空气灭菌。
接种前4小时从冰箱取出1支菌种,在25℃条件下活化。
在超净台内,以无菌生理盐水洗涤菌种斜面。
孢子悬浮液以每瓶10ml的接种量,接入种子培养基。
从超净台取出接好的种子三角瓶,转入摇床,在28℃、250rpm的条件下培养14~16小时,至种子瓶内呈粘稠浆糊状为止。
2、产酶培养基确定(学生确定,每组做三瓶,250ml三角瓶中装100ml培养基)2.1培养基的配制,每班分六组,各组分别选择以下六种培养基配方:(1)基础培养基:(100ml)豆粕粉3g,蔗糖0.8g,酵母膏0.1g,MgSO4 0.36g,KH2PO4 0.12g,CaCl2 0.1g。
(第一组)(2)第二组,将基础培养基中蔗糖按成等例葡萄糖;(3)第三组,将基础培养基中蔗糖按成等例马铃薯淀粉;(4)第四组,将基础培养基中去掉酵母膏;(5)第五组,将基础培养基中去掉豆粕粉,并将酵母膏添加量增至0.5%。
(6)第六组,将基础培养基中去掉MgSO4和CaCl2。
2.2培养基灭菌高压灭菌锅,121℃,20min灭菌。
冷却至室温,将上述物品并洗耳球转入超净台,接种前20min进行紫外空气灭菌。
2.3接种冷却到室温开始接种,接种量10%,然后在在28℃、250rpm的条件下培养18小时,至发酵液颜色变深、澄清为止。
2.4蛋白酶活力测定根据各组测定酶活结果,比较确定最适培养基组成。
(1)定义:1 g固体酶粉,在一定温度和pH值条件下,1 min水解酪素产生1 ug酪氨酸为一个酶活单位,以u/g表示。
(2)原理:蛋白酶在一定温度与pH条件下,水解酪素底物,然后加入三氯乙酸终止酶反应,并使未水解的酪素沉淀除去,滤液对紫外光有吸收,可用紫外分光光度法测定。
一株产角蛋白酶菌株诱变筛选及发酵条件优化
一株产角蛋白酶菌株诱变筛选及发酵条件优化刘文龙∗㊀王兴吉㊀张志来㊀王克芬(山东隆科特酶制剂有限公司ꎬ山东省酶制剂生物发酵技术重点实验室ꎬ山东临沂㊀276400)㊀㊀摘㊀要:对实验室保藏产角蛋白酶菌A2进行NTG(亚硝基胍)诱变ꎬ从中筛选出一株酶活提高144%的突变菌株A2-453ꎬ对该突变株的发酵条件进行优化ꎮ从产酶时间㊁添加外源碳㊁氮源来研究其酶活变化ꎬ经优化后得到最佳的发酵条件是:发酵60h时酶活单位最高ꎻ最佳外源碳源是葡萄糖ꎬ最佳外源氮源是豆饼粉ꎮ经最优条件进行发酵ꎬ酶活单位提高42%ꎮ关键词:角蛋白酶ꎻ亚硝基胍ꎻ诱变ꎻ酶活ꎻ碳源ꎻ氮源MutationBreedingandFermentationConditionOptimizationofaKeratinase-ProducingStrainLiuWenlong∗㊀WangXingji㊀ZhangZhilai㊀WangKefen(ShandongLongKeteEnzymeCo.LtdꎬLinyiꎬ276400ꎬChina)Abstract:AmutantstrainA2-453with144%increaseinenzymeactivitywasscreenedoutbyNTGmutagenesisofA2whichcouldproducekeratinaseinourlaboratory.ThefermentationconditionswerecarriedoutfromenzymeproductiontimeꎬexogenouscarbonsourcesandnitrogensourcestostudytheoptimumconditionsforA2-453fermentation.Theoptimumfermentationcon ̄ditionswereasfollows:thehighestactivityofthestrainwasfoundat60hꎬthebestcarbonandni ̄trogensourcesinourstudywereglucoseandsoybeanrespectively.Theenzymeactivityunitwasincreasedby42%bytheoptimumconditions.KeyWords:KeratinaseꎻNTGꎬMutagenesisꎻEnzymeActivityꎻCarbonSourceꎻNitrogenSource基金项目:国家重点研发计划(2017YFB0308400-01-05)作者简介:刘文龙(1982-㊀)ꎬ男ꎬ工程师ꎬ硕士ꎬ研究方向为酶制剂生产与开发ꎮ㊀㊀羽毛废弃物是养殖业中一种重要副产物ꎬ其富含高浓度的蛋白质ꎮ近年来ꎬ我国养殖业和屠宰业蓬勃发展ꎬ期间产生了大量的副产物ꎬ而这些废弃物不仅造成资源的巨大浪费ꎬ而且污染环境ꎮ羽毛废弃物中各类氨基酸齐全ꎬ含必需氨基酸ꎬ特别是含硫氨基酸含量特别高ꎬ因此对这类资源加以充分利用将是蛋白饲料非常重要的补充[1]ꎮ角蛋白被定义为是纤维蛋白ꎬ又被称作硬皮蛋白ꎬ是脊椎动物表皮或表皮附属物的主要成分ꎬ如表皮残留物㊁鬃毛㊁羽毛㊁毛发㊁指甲㊁喙㊁角㊁蹄㊁羊毛等ꎮ这种蛋白对于一些常见的蛋白酶如木瓜蛋白酶㊁胰蛋白酶和胃蛋白酶等㊁以及化学试剂㊁机械压力等都具有较高的抗性[2-4]ꎮ蛋白质中的二硫键是决定角蛋白抗性和稳定性的关键因素[5]ꎮ角蛋白酶是唯一可以降解这些复杂结构蛋白的蛋白酶ꎬ因此角蛋白酶以环保友好方式进行生物转化的优势ꎬ在家禽㊁皮革工业㊁氨基酸㊁多肽以及可溶性蛋白等含角蛋白废物利用中具有重要的应用价值ꎮ角蛋白的降解已经广泛的应用于食品㊁饲料㊁化肥㊁化妆品㊁纺织和制药工业中[6]ꎮ目前已经商业化生产的角蛋白酶有Ver ̄sazyme㊁Valkerase㊁Prionzyme和PURE100ꎬ这4种商品酶都是基于BacilluslicheniformisPWD-1(KerA)菌种来源蛋白基础上发展而来的[7]ꎮ另外ꎬ在其他菌种ꎬ如假单胞菌属㊁金黄杆菌㊁溶杆菌㊁涅斯捷连科氏菌㊁考克氏菌㊁微杆菌㊁寡养单胞菌㊁沙雷氏菌㊁热菌中也有发现产角蛋白酶[4ꎬ8]ꎮ也有报道称在嗜热菌和极端菌种如ꎬ闪烁杆菌属[9]㊁梭菌属[10]㊁嗜热菌属[11]ꎬ也有角蛋白酶产生ꎮ一些较有潜力的产角蛋白酶菌种有来源于链霉菌的放线菌和嗜热链球菌也已经被发现并报道[12-16]ꎮ尽管角蛋白酶具有巨大的生物技术应用潜力ꎬ但是产量低一直是限制角蛋白酶商业化的一大障碍ꎮ提高角蛋白酶的催化效率㊁表达量以及热稳定性对于其应用于工业化生产具有相当重要的影响[17]ꎮ本文以一株实验室保存的高产角蛋白酶菌种为出发菌株进行NTG诱变ꎬ然后从中筛选出酶活单位提高的菌株突变体ꎬ并对其进行发酵条件优化以最大程度的激发其产角蛋白酶的能力ꎬ从而为其应用于工业化大规模生产提供基础ꎮ1㊀材料与方法1.1㊀实验材料1.1.1㊀菌㊀种A2菌是作者所在实验室从沂水某养殖场处采取土样获得的一株产角蛋白酶地衣芽孢杆菌菌种ꎮ1.1.2㊀试㊀剂自制羽毛粉:新鲜的鸡羽毛充分洗干净ꎬ然后沸水煮2-3hꎬ然后用太阳晒干ꎮ晒干的羽毛粉碎得到的粉末用于做培养基成分ꎻ天蓝角蛋白㊁Tris㊁蛋白胨㊁酵母粉均购自上海生工生物工程有限公司ꎻ亚硝基胍(NTG)ꎻ其他试剂均为分析纯ꎮ1.1.3㊀培养基种子培养基(g/L):氯化钠10ꎬ酵母粉5ꎬ蛋白胨10ꎬpH7.0ꎮ平板筛选培养基(g/L):氯化钠10ꎬ酵母粉5ꎬ蛋白胨10ꎬ羽毛粉10ꎬ琼脂粉20ꎬpH7.0ꎮ发酵基础培养基(g/L):氯化钠0.5ꎬ六水氯化镁0.1ꎬ氯化钙0.06ꎬ磷酸氢二钾1.4㊁磷酸二氢钾0.7㊁羽毛粉10ꎬpH7.0ꎮ1.2㊀实验方法1.2.1㊀菌种NTG诱变将产角蛋白酶地衣芽孢杆菌菌株划线活化ꎬ37ħ培养24hꎬ挑取单克隆接种到种子培养基中ꎬ37ħ培养至对数期ꎬ然后收集菌体ꎬ8000rpm离心3minꎬ用生理盐水洗涤菌体沉淀2次ꎬ最后用生理盐水重悬菌体至浓度为106-108CFU/mLꎬ并加入NTG母液ꎬ使得最终浓度为250μg/mLꎮ然后于37ħ分别培养10-60minꎬ每隔10min取样一次ꎬ经适当稀释之后ꎬ取100μL涂布于筛选平板上ꎬ计算致死率ꎮ致死率计算公式如下:致死率=(A-B)/Bˑ100%式中A代表经NTG处理过平板上生长菌落数平均值ꎻB代表未经NTG处理过菌涂布平板生长的菌落数平均值ꎮ1.2.2㊀诱变菌筛选初筛:对致死率在70%-80%的诱变菌种库进行筛选ꎮ采用平板筛选与96孔板筛选结合的方式进行ꎮ将诱变好的菌种经特定稀释涂布在筛选平板上ꎬ37ħ培养24hꎮ根据透明圈大小及菌落形态变化挑取单克隆于装有LB液体培养基的96孔板中进行活化培养ꎬ37ħ培养24hꎮ按照2%接种量将长好的种子液转接到含有发酵培养基的96孔板中ꎬ37ħ发酵培养72hꎮ将发酵培养液进行离心处理ꎬ取上清ꎬ采用酶标仪进行酶活测定ꎬ96孔板酶活测定方法参照文献[18]ꎮ复筛:将96孔板中筛选的酶活提高幅度比较明显的突变株ꎬ转接到摇瓶进行摇瓶扩大复筛验证ꎬ摇瓶发酵条件:装液量50mL/500mLꎬ37ħꎬ240rpmꎬ培养72h后进行酶活测定ꎮ将筛选出来的高产菌传代5次ꎬ并测定角蛋白酶活力ꎬ以验证该菌种的传代稳定性ꎮ1.2.3㊀酶活测定酶活测定方法及酶活单位计算参考文献[19]1.2.4㊀发酵条件优化1.2.4.1㊀发酵时间对产酶影响发酵条件为初始发酵条件ꎬ培养基采用发酵基础培养基ꎬ37ħ分别培养12h㊁24h㊁36h㊁48h㊁60h㊁72hꎬ特定时间点取发酵液进行酶活检测ꎬ研究发酵时间对产酶的影响(实验组每组设置3个平行样)ꎮ1.2.4.2㊀外加碳源发酵条件采用1.2.4.1最佳条件ꎬ外源添加1%的葡萄糖㊁乳糖㊁蔗糖㊁淀粉㊁糊精ꎬ研究外源添加不同碳源对产酶的影响(实验组每组设置3个平行样)ꎮ1.2.4.3㊀外加氮源发酵条件采用1.2.4.2最优条件ꎬ外源添加1%的蛋白胨㊁酵母粉㊁豆饼粉㊁牛肉膏㊁硫酸铵ꎬ研究不同氮源对产酶的影响(实验组每组设置3个平行样)ꎮ2㊀结果与讨论2.1㊀A2菌种NTG诱变及筛选根据NTG作用时间与致死率关系ꎬ选择致死率在70%-80%之间的诱变菌体库进行筛选ꎬ致死率满足70%-80%之间范围内其向正突变的几率较大[20]ꎬ因此将诱变条件定为NTG浓度为250μg/mLꎬ诱变时间10minꎮ将诱变后菌种经适当稀释后涂布在筛选平板上ꎬ37ħ培养24hꎬ根据透明圈的大小及菌落形态变化选择突变体进行筛选ꎮ通过96孔板筛选ꎬ共筛选3587株突变体ꎬ酶活提高幅度大于50%以上的突变株占3ɢꎬ其中酶活提高幅度最高的突变株为A2-453酶活单位为324U/mLꎬ比对照提高了144%ꎮ图1㊀NTG处理时间与菌种致死率关系表1㊀A2-453传代稳定性验证传代数角蛋白酶活力1(U/mL)角蛋白酶活力2(U/mL)角蛋白酶活力3(U/mL)平均值(U/mL)13173283093182311338304318330133232732043253373143255328305313315从表中可以看出ꎬ高产菌A2-453产角蛋白酶活力稳定ꎬ传代5次后ꎬ酶活与对照相比相差不大ꎮ2.2㊀发酵时间对A2-453菌种产酶的影响图2㊀发酵周期对产酶的影响分别将A2和A2-453两个菌株活化后转接到发酵培养基中ꎬ每隔12h取样检测酶活单位数变化ꎮ摇瓶发酵液酶活检测发现ꎬA2-453菌种当发酵到60h时ꎬ酶活单位为316U/mLꎬ发酵至72h时ꎬ酶活单位仅为320U/mLꎬ与发酵60h相比酶活相差不大ꎮ怀疑是培养基中营养成分耗尽ꎬ代谢产物积累过多对细胞产酶造成负面影响ꎬ亦或是因为代谢产物对细胞产生反馈抑制对细胞产酶进行负调控ꎬ从而不再产酶ꎮ因此将最优发酵时间定为60hꎮ2.3㊀外加不同碳源对A2-453产酶的影响以发酵周期为60h作为发酵终点ꎬ研究外源添加不同碳源对A2-453菌种产酶的影响ꎮ结果显示ꎬ外源添加1%的葡萄糖对A2-453产酶具有促进作用ꎬ比基础培养基提高了32%左右ꎮ而其他碳源对其效果影响不明显ꎬ甚至有降低产酶的现象ꎮ葡萄糖作为速效碳源ꎬ可以促进菌体细胞的大量繁殖ꎬ从而提高整体产酶水平ꎮ而其他碳源需要先进行分解才能再被利用ꎬ大大降低了产酶的速率ꎮ图3㊀不同外源添加碳源对突变体产酶影响2.4㊀外加不同氮源对A2-453产酶的影响以2.3最优发酵条件为基础ꎬ研究外源添加1%的不同氮源对A2-453产酶的影响ꎮ结果显示ꎬ豆饼粉对于产酶具有促进作用ꎬ比对照组酶活提高了7%左右ꎬ其他几种氮源效果不是很明显ꎬ而蛋白胨㊁酵母粉反而使得产酶降低ꎬ检测发酵液pHꎬ发现比对照组高ꎬ因此怀疑可能是因为原料消耗之后ꎬ体系中pH升高导致不适宜产酶ꎮ图4㊀不同外源添加氮源对突变体产酶影响结合以上几种条件ꎬ以发酵培养基配方(g/L):氯化钠0.5ꎬ六水氯化镁0.1ꎬ氯化钙0.06ꎬ磷酸氢二钾1.4㊁磷酸二氢钾0.7㊁羽毛粉10ꎬ葡萄糖10ꎬ豆饼粉10ꎬpH7.0进行发酵验证ꎬ发酵周期为60hꎬ最终酶活单位能够达到448U/mLꎬ比未优化之前提高了42%ꎮ3㊀结㊀语NTG是目前最有效ꎬ也是应用最广泛的化学诱变剂之一[21]ꎮ对本实验室筛选的一株产角蛋白酶菌株A2作为出发菌进行NTG诱变ꎬ从中筛选出一株酶活提高144%的突变株ꎮ诱变之后的菌株表现出生长较快的生理变化ꎬ产酶大幅提高ꎮ根据菌种的特性ꎬ针对性的对其产酶时间㊁碳㊁氮源利用情况进行了发酵优化ꎮ葡萄糖㊁豆饼粉对其产酶具有较大的促进作用ꎬ根据最优条件进行发酵验证ꎬ整个酶活单位提高了42%ꎮ其他一些发酵因素的优化可能会进一步的提高该菌的产酶能力ꎮ角蛋白酶现已广泛的应用于食品㊁饲料㊁化肥㊁化妆品㊁纺织和制药工业中[6]ꎮ但是现存的商业化用酶产量低㊁催化效率低㊁稳定性差等是限制其广泛应用的主要因素ꎮ因此ꎬ对现有产酶菌种进行优化及选育㊁对蛋白进行改造以及寻找可替代的菌种来生产角蛋白酶是现在的研究热点ꎮ本文通过对A2菌进行诱变ꎬ得到一株酶活单位提高144%的突变株ꎬ并在此基础上进行发酵优化ꎬ酶活单位又提高了42%ꎬ为该酶进一步的工业化应用研究提供了基础ꎮ参考文献[1]于晓鹏ꎬ赵新强.角蛋白酶研究进展[J].中国果菜ꎬ2015ꎬ35(2):77-81.[2]COULOMBEPAꎬOMARYMB. 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大曲中毛霉产蛋白酶发酵条件的研究
1 料 与 方 法 材
11 料 .材 .
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K e r S mu o,rtiaefr nainc n io ,rh g n lts y wo d ' crpoen s, me tt o dt noto o a et e o i
蛋 白酶是酶制剂工业 中最重要的工业酶之一, 由于其用途广泛, 商业价值高, 白酶一直是开发和研 蛋 究 的热 点_蛋 白酶分 动 物蛋 白酶 、 l J . 植物 蛋 白酶 、 生 物蛋 白酶 , 物 蛋 白酶生 产周 期 长价格 昂贵, 物蛋 微 动 植
L a ,in i n iL nJa g A f g e
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Absr tA e rioae rm p ca prt a n e t ae op o u e p tiae w t oi eme tt n sae tac : mu o sltd f o s eils i siv si td t rd c r en s i sl fr nai tt iw g o h d o
文章编 号 : o—5621)304—4 1 871(000—070 0
S u y o e me t t n c n iin o r ti a e t d n f r n a i o d to fp o en s o
产蛋白酶菌的筛选及产酶条件优化
陇东大学学士学位毕业论文(设计)蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化生命科学与技术学院08生物技术班作者:指导教师:蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化何泰杜旭谢丽娟,刘丽萍(陇东学院生命科学与技术学院,甘肃庆阳745000)摘要:采用陇东学院污水处理厂附近土壤、农田土壤及养殖场附近土壤作为样品,利用牛奶水解圈筛选模型从中分离筛选得到产蛋白酶能力较高的菌株whr1,初步鉴定该菌株属于芽孢杆菌。
并对其产酶条件进行优化,结果显示该菌最适培养时间为24h,最佳碳源为质量浓度1% 蔗糖,最佳氮源为质量浓度1.5%酵母膏,最适初始pH值为6.0,最适发酵温度为35℃。
关键词:菌种筛选,鉴定,蛋白酶,条件优化Protease produced the screening of the bacteria and the optimization of theenzyme production conditions(College of life science and technology, Longdong University, Qingyang 74500, Gansu, China)Abstract:The sewage treatment plant soil near east institute, soil and soil samples near farms .Using milk hydrolysis circle screening model separating screening in high ability get protease whr1 strains. Preliminary appraisal of the fungus belong to bacillus. After the optimization of the condition, the capability of whr1 was improved, the optimal condition is: The time is 24h; carbon source is sucrose 1%; nitrogen source is Yeast extract 1.5 %, the pH is 6.0; fermentation temperature is 30℃.Keyword: Screening,Identified,Protease, Conditions optimization0引言蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称,是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶[1],也是目前世界上产销量最大的商业酶,其市场占有率约占整个商品酶销售量的60%,微生物蛋白酶从微生物中提取,不受资源、环境和空间的限制,具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性[2,3]。
角蛋白酶工程菌株产酶条件的优化研究
角蛋白酶工程菌株产酶条件的优化研究角蛋白酶是一种重要的酶类蛋白,在食品、医药、皮革等领域具有广泛的应用价值。
为了提高角蛋白酶的产量和活性,角蛋白酶工程菌株的酶条件需要进行优化研究。
本文将从菌株选择、培养基组成、培养条件等方面探讨角蛋白酶工程菌株产酶条件的优化研究。
首先,选择适合的菌株是进行角蛋白酶产酶条件优化的基础。
目前常用的工程菌株有大肠杆菌(Escherichia coli)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等。
这些菌株具有较高的生长速度和较好的表达能力,但也存在着一些问题,如蛋白质形成包涵体、酶活性低等。
因此,选择适合目标酶表达和活性的菌株是十分重要的。
其次,培养基组成对角蛋白酶产酶条件的优化也起到了至关重要的作用。
培养基的主要组成包括碳源、氮源、微量元素等。
在选择碳源方面,常用的有葡萄糖、麦芽糖等,但不同碳源对菌株的生长和酶的产量有不同的影响,因此需要进行筛选和优化。
氮源的选择包括无机氮源和有机氮源,如氨基酸和蛋白质等。
微量元素的添加也对角蛋白酶的产量和活性有影响,如金属离子(如镁离子、锰离子)和维生素等。
因此,合理选择培养基组成是进行角蛋白酶产酶条件优化的关键。
最后,培养条件的优化也对角蛋白酶的产量和活性具有重要影响。
培养条件包括温度、pH值、发酵时间等方面。
温度的选择主要取决于菌株的最适生长温度,一般在菌株的最适生长温度附近进行发酵。
pH值的选择也对角蛋白酶的产量和活性有影响,一般在菌株最适生长pH值附近进行发酵。
此外,发酵时间的选择也需要根据菌株的生长速度和目标酶的表达和积累情况来进行调整。
综上所述,角蛋白酶工程菌株产酶条件的优化研究包括菌株选择、培养基组成和培养条件的优化。
通过合理选择菌株、优化培养基组成和调整培养条件,可以提高角蛋白酶的产量和活性,为其在食品、医药、皮革等领域的应用提供技术支持。
当然,由于研究深度有限,仍然需要进一步探索和优化。
蛋白酶辅助法腐乳发酵工艺优化和理化性质分析
蛋白酶辅助法腐乳发酵工艺优化和理化性质分析腐乳是我国具有民族特色的传统大豆发酵制品,因其味道鲜美,具有抗氧化和降血压等保健功能,深受消费者欢迎腐乳的发酵过程分为前发酵和后发酵[4],其中主要发生了生物化学和物理化学变化[5]。
腐乳的前发酵是培养菌系和积累酶系的过程,一般为36~48h;后发酵是酶系作用于腐乳毛坯的过程,其毛坯中毛霉分泌蛋白酶降解大豆蛋白,从而破坏凝胶结构使其质地软化并产生大量游离氨基酸等。
该过程需要较长的后熟时间,一般为3~6个月,因此制约了其在我国的工业化生产[6-7]。
近年来,针对缩短腐乳生产周期的研究较多。
其中,在后发酵阶段直接加入外源蛋白酶是一种较便捷的方法。
此外,腐乳后发酵温度也在很大程度上影响腐乳的发酵周期,而如今对酶法辅助腐乳发酵中温度影响的研究较少。
本研究通过控制酶促腐乳后发酵的温度,对腐乳发酵过程中理化性质变化进行研究,了解温度对蛋白酶辅助腐乳发酵的影响,旨在为优化酶促腐乳工艺提供一定的理论和应用依据。
1材料与方法L1材料与仪器盐卤型豆腐、食盐、白酒(均为食品级),市售;雅致放射性毛霉菌粉,安琪酵母股份有限公司;中性蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶(活性单位:1X105U,均为食品级),沧州夏盛酶生物技术有限公司;冰乙酸、无水乙酸钠、乙酰丙酮、硫酸镀、37%甲醛,阿拉丁工业公司。
恒温培养箱,上海慧泰仪器制造有限公司;冷冻干燥机,美国Labconco公司;糖度仪,ATAGO(爱拓)中国分公司;酶标仪,美谷分子仪器(上海)有限公司;高速离心机,赛默飞世尔科技(中国)有限公司;组织研磨仪,上海净信科技。
1.2实验方法1.2.1酶促腐乳的生物酿制将盐卤型老豆腐切成约2cm×2. 5cm×2. 5cm的小块,喷洒雅致放射毛霉菌悬液至终浓度约为lX107CFU∕mL,在25七下前发酵3d后搓毛;毛坯称重后,按质量比加入10%的食盐腌制22h,制得咸坯;咸坯称重后,均匀分成11份,根据表 1 加入不同外源蛋白酶处理并装瓶,其总添加量为腐乳总蛋白的4%(质量分数);最后加入10%食用乙醇至完全浸泡咸坯后加盖密封,分别在20、30、37、5(TC下后发酵20d[8]°表1添加外源蛋白酶样品分组TablelGroupingofsampleswithexogenousprotease1.2.2腐乳的样品采集及预处理样品采集:每个酶促腐乳样品的前发酵全部天数以及后发酵1、2、3、5、10、20d中取样用于理化特性分析。
毛霉产蛋白酶的特性研究 (1)
1.3.1.2 麸皮盐水制曲 250ml的三角瓶中加入20g麸 皮及含有 0.3mol/L NaCl 的水溶液 35ml 121 高温蒸汽 灭菌 30min 趁热摇散 冷后接种 2ml 孢子含量为 3 10 6 个 / m l 菌悬液 于 2 8 恒温培养
1.3.2 蛋白酶提取方法
1.3.2.1 盐水抽提 往上述各种麸曲培养物中加入 0.3mol/L 的 NaCl 溶液 100ml 经高速组织匀浆机破碎 40 抽提 1h 3500r/min 离心 10min 测离心液中蛋白 酶活力
1.3.2.2 蒸馏水抽提 往上述各种麸曲培养物中加入加 蒸馏水 100ml 经高速组织匀浆机破碎 40 抽提 1h 3500r/min 离心 10min 测离心液中蛋白酶活力
1.3.2.3 磷酸缓冲液抽提 往上述各种麸曲培养物中加 入 pH7.5 的磷酸缓冲液 经高速组织匀浆机破碎 40 抽提 1h 3500r/min 离心 10min 测离心液中蛋白酶活 力
中性
Fi g.1
培养时间(h) 图1 不同的培养时间毛霉蛋白酶活力 Protease activity of mucor after different culture time
2.2 不同提取方法对酶活力的影响 为探讨不同的提取方法对酶活力的影响程度 本实
毛霉豆豉前发酵条件优化的研究
1 材料 与方 法
1.1材 料 与仪 器 1.1.1原 辅材 料 大豆、邵阳大 曲酒、生姜、麸皮 和土豆全 部市售 。 毛霉菌 :由湖南农业大学微生物教 研室提供 。 1.1.2主 要药品与试剂 葡 萄 糖 、 干 酪 素 、 L一酪 氨 酸 、 盐 酸 、 磷 酸 、 硼 砂 、 3, 5一二硝 基水杨酸 、酒石酸钾钠 、苯酚、亚硫酸钠、柠檬酸、 柠 檬 酸 钠 、氯 化 钠 、碘 、碘 化 钾 、可 溶 性 淀 粉 、硫 酸 铜 、硫 酸 钾 、 甲醛 等 均 为 分 析 纯 。 1.1.3主 要试 验 仪 器 722S 型 分 光 光 度 计 、 SHZ一82 气 浴 恒 温 振 荡 器 、 YXQ.SG46.280型高压蒸汽消毒器、250B 型恒温生化培养 箱、s.3C型 pH精密计、LD4—2A式医用离心机、SW—CJ—IB
收 稿 日期 :2010—02-21 基金项 目:湖南永州市一般课题 (永科发[20081)资 助。 作 者 简 介 :夏 岩 石 (1976一 ), 男 ,汉 族 ,讲 师 ,主 要 从 事 食 品营 养 与 安 全 研 究 。
标 准 型 净 化 工 作 台 。 1.2 试 验 方 法 1.2.1菌种 的制 备 菌 种 的活 化 :将 斜 面菌 种 在 无 菌 操 作 台接 种 到 PDA斜 面
1.2.2前发 酵温度对 豆豉毛坯产蛋 白酶的影响 大豆蒸熟冷却至室温 ,按 3%的接种量接种优质毛霉麸 曲 ,分 别 置 于 IO ̄C, 15℃ ,20 ̄C,25℃ ,28 ̄C,35℃条 件 培养 48h后测定毛坯的蛋 白酶活力 ,以确定适宜的前发酵温 度 。 1.2.3前 发 酵 时 间对 豆 豉 毛 坯 产 蛋 白酶 的 影 响 大豆蒸熟冷却至室温 ,按 3%的接种量接种优质毛霉麸 曲,置于 25℃条件下培养 ,24h后开始测定毛坯的蛋白酶活 力 ,每 隔 6h测 定 一 次 ,以确 定 适 宜 的前 发 酵 时 问 。 1.2.4 pH值 对 前发 酵 产 蛋 白酶 的影 响 用 pH3、pH4、pH5、pH6、pH7、pH8等 不 同 溶液 制成 孢子悬浮液进行接种 ,置 25℃条件进行培养 ,期 间用相应 的 pH溶液进行 喷洒 ,维持培养期 间的相对湿度 ,48h后测 毛坯 的蛋 白酶活力 ,确定前发酵条件的适宜 pH值。 1.2.5 NaCI浓度对 前发酵产蛋白酶 的影响 用 0M,0.2M,0.4M,0.6M,O.8M,1.0M 等不同浓度 的 NaCI溶液制成 孢子 悬浮液进行接种 ,置 25℃条件进行培 养 ,期 间 用 相 应 的 NaCI溶 液 进 行 喷 洒 ,维 持 持 培 养 问 的湿 度 ,48h后测毛坯 的蛋 白酶活 力,探讨 NaCI溶液对前发酵 产 蛋 白酶 的影 响 。
产蛋白酶菌的分离鉴定及产酶条件优化
产蛋白酶菌的分离鉴定及产酶条件优化王鼎;余淼;付洋洋;郭春华;彭忠利;高彦华【摘要】This research isolated protease-producing strain from cattle rumen,16 strains were selected by the casein hydrolysis bined HE value and protease activity,a strain(named A18)with the mighest activity of proteinase(415.82 U/mL)as the test strain.And it was identified as Aspergillusoryzae by morphological observation and 18S rDNA sequence analysis.We got the inoculation amount 4%,the optimum temperature 30 ℃,time 60 h through the single factor test.By th e response surface analysis(RSA)methods and repeated experiments,the optimal fermentation conditions were determined as follows:inoculation quantity 4%,temperature 29 ℃, time 55 h.The highest enzyme activity reached 527.57 U/mL,which increased by 22.6% than before optimization.%本试验菌源取自肉牛瘤胃液,首先用酪蛋白水解圈法初选出16株产蛋白酶菌株,综合HE值和蛋白酶活性,选出一株蛋白酶活性最高A18作为后续试验菌株,该菌株蛋白酶活为415.82 U/mL,通过形态和分子鉴定确定此菌株为米曲霉菌.单因素试验确定接种量为4%、培养温度为30℃、培养时间为60 h,通过响应面分析法及多次重复试验,得出接种量4%、温度29℃、时间55 h为其最佳产酶条件,最高酶活达527.57U/mL,比优化之前提高了22.6%.【期刊名称】《中国饲料》【年(卷),期】2018(000)007【总页数】6页(P14-19)【关键词】蛋白酶;米曲霉;优化;响应面法【作者】王鼎;余淼;付洋洋;郭春华;彭忠利;高彦华【作者单位】西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;成都大帝汉克生物科技有限公司,四川成都611130;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041;西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都610041【正文语种】中文【中图分类】S816.3蛋白酶存在于动物、植物、微生物中,属于水解酶类,约占世界酶制剂销量的60%(马俊阳等,2014)。
产蛋白酶菌的筛选及产酶条件优化
陇东大学学士学位毕业论文(设计)蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化生命科学与技术学院08生物技术班作者:指导教师:蛋白酶产生菌的筛选及产酶条件优化何泰杜旭谢丽娟,刘丽萍(陇东学院生命科学与技术学院,甘肃庆阳745000)摘要:采用陇东学院污水处理厂附近土壤、农田土壤及养殖场附近土壤作为样品,利用牛奶水解圈筛选模型从中分离筛选得到产蛋白酶能力较高的菌株whr1,初步鉴定该菌株属于芽孢杆菌。
并对其产酶条件进行优化,结果显示该菌最适培养时间为24h,最佳碳源为质量浓度1% 蔗糖,最佳氮源为质量浓度1.5%酵母膏,最适初始pH值为6.0,最适发酵温度为35℃。
关键词:菌种筛选,鉴定,蛋白酶,条件优化Protease produced the screening of the bacteria and the optimization of theenzyme production conditions(College of life science and technology, Longdong University, Qingyang 74500, Gansu, China)Abstract:The sewage treatment plant soil near east institute, soil and soil samples near farms .Using milk hydrolysis circle screening model separating screening in high ability get protease whr1 strains. Preliminary appraisal of the fungus belong to bacillus. After the optimization of the condition, the capability of whr1 was improved, the optimal condition is: The time is 24h; carbon source is sucrose 1%; nitrogen source is Yeast extract 1.5 %, the pH is 6.0; fermentation temperature is 30℃.Keyword: Screening,Identified,Protease, Conditions optimization0引言蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称,是一类广泛应用于皮革、毛皮、丝绸、医药、食品、酿造等方面的重要工业用酶[1],也是目前世界上产销量最大的商业酶,其市场占有率约占整个商品酶销售量的60%,微生物蛋白酶从微生物中提取,不受资源、环境和空间的限制,具有动物蛋白酶和植物蛋白酶所不可比拟的优越性[2,3]。
一种利用真菌微生物发酵生产蛋白酶k的生产工艺
一种利用真菌微生物发酵生产蛋白酶k的生
产工艺
蛋白酶K是一种广泛应用于医药、食品、化妆品等领域的重要酶类,其生产工艺也越来越受到关注。
近年来,利用真菌微生物发酵生产蛋白酶K的工艺备受青睐,下面就来介绍一下其具体生产工艺。
首先,选用高效产酶菌株。
真菌微生物发酵生产蛋白酶K的关键是选用高效产酶菌株。
目前做得较好的产酶菌株包括曲霉、木霉、产曲霉等。
其次,确定合适的发酵条件。
合理的发酵条件有利于提高蛋白酶K 的生产效率和纯度。
通常采用液态发酵,发酵条件包括温度、pH值、转速、空气流量等,最优发酵条件需根据具体情况确定。
再次,加入适量的培养基。
培养基是微生物发酵生产过程中的营养基础,合适的培养基配方可以提高蛋白酶K的产量和纯度。
培养基的成分包括碳源、氮源、矿物质和微量元素等,其中以大豆粉、麦芽粉和葡萄糖等为碳源,以酵母粉和蛋白质为氮源,再添加一些有机和无机盐类为矿物质和微量元素,能够获得较好的生产效果。
最后,进行后处理。
真菌微生物发酵生产蛋白酶K后,需要进行后处理以提高其纯度。
后处理主要包括离心、超滤、扩散等操作步骤,其目的是去除蛋白酶K中的杂质和不纯物质,同时保留其酶活性,以便应用到不同领域。
总之,利用真菌微生物发酵生产蛋白酶K的生产工艺在实践中已经被证明是一种成功的方法,具有重要的应用价值。
在生产过程中需要遵循合理的选菌、合理的发酵条件、合适的培养基配方和有效的后处理方法,才能取得最佳的生产效果,同时也必须注意工艺安全和环保等问题。
相信随着技术的不断进步和研发的深入,真菌微生物发酵生产蛋白酶K的工艺会更加完善,为各个领域的发展带来更多的机遇。
枯草芽孢杆菌产角蛋白酶条件优化
枯草芽孢杆菌产角蛋白酶条件优化大家好,今天我要和大家聊聊一个“毛茸茸”的话题——枯草芽孢杆菌产角蛋白酶条件优化。
说起角蛋白酶,大家可能会有些陌生,但它可是个厉害角色哦!这货可是可以帮助我们消化食物的酶,谁家的胃里没有它可是憋屈了。
而枯草芽孢杆菌是一个很热门的生物工程“小明星”,它可以通过发酵的方式产生角蛋白酶,天然无公害,绿色环保,真是走在了科技的前沿呢!1.1 问题背景不过,虽然这两货看起来强大无比,但是它们产生角蛋白酶的条件可不是那么简单,有点“苛刻”呢!所以我们急需对这个酶的产生条件进行优化,让这两个家伙开开心心地产酶,不要再委屈它们了!1.2 研究意义为了进一步促进生物工程领域的发展,优化枯草芽孢杆菌产角蛋白酶的条件就显得尤为重要。
如果我们能够找到最适合它们产酶的条件,不但可以提高产酶效率,还能节约资源,更环保,科技救地球啊!二、材料与方法2.1 实验材料首先我们需要准备好实验材料,包括枯草芽孢杆菌菌种、培养基、试剂等等。
得有吃的、有喝的,别到时候缺了东西,搞巧克力不给糖的尴尬局面。
2.2 实验方法然后我们要好好琢磨一下实验方法了,这个可是关键啊!我们需要通过改变生长温度、培养基成分、搅拌速度等因素,来优化角蛋白酶的产生条件。
得用点脑子,动个手脚,让它们产酶的效率更高!三、结果与讨论3.1 实验结果终于到了揭晓实验结果的时刻了!经过我们的努力,我们找到了最佳的产酶条件,让枯草芽孢杆菌和它的“好基友”角蛋白酶达到了最佳状态,产酶效率提升了不少,看起来又充满了生机!3.2 结果讨论通过对实验结果的分析和讨论,我们发现,生长温度对角蛋白酶的产生影响最大,而培养基成分和搅拌速度也起到了一定的作用。
所以在以后的研究中,我们可以更加关注这些因素,进一步提高产酶效率,让这两个“伙伴”更默契地合作!四、结论和展望通过本次研究,我们成功地优化了枯草芽孢杆菌产角蛋白酶的条件,取得了一定的成果。
尽管有许多地方还有待改进,但我们相信在未来的研究中,会有更多的收获和突破。
毛霉高产中性蛋白酶发酵培养条件的优化
中图分类号 : T S 2 0 1 . 3
Hale Waihona Puke 文献标志码 : B 文章编号 : 1 6 7 4 — 3 5 4 7 ( 2 0 1 3 ) 0 5 — 0 0 3 3 — 0 7
毛霉 高产 中性蛋 白 酶发 酵培养条件 的优化
刘 颖 ,孙冰 玉 ,刘琳琳 ,刘莹莹 ,张 光 ,石彦 国
,
i n c u b a t i o n t i me wa s 7 2 h , i n c u b a t i o n t e mp e r a t u r e w a s 3 0 o C,p H6 . 8 a n d t h e a mo u n t o f mu c o r i n o c u l a t e d s p o r e s W s a 9 % . he t n e u t r a l p r o t e a s e a c t i v i t y wa s 1 9 6 7 .3 6 U/ mL ;F o r t h e n e u t r a l p r o t e a s e p r o d u c t i o n o f
mu c o r i n o c u l a t e d s p o r e s wa s 7 % wi t h p r o t e a s e a c t i v i t y o f 1 8 9 6 . 5 3 U / mL .
Ke y wo r ds : Mu c o r ; Cul t u r e c o n di t i o n s ; Op t i mi z a t i o n ; Ne u t r a l p r o t e a s e a c t i v i t y
( 哈 尔滨商业大 学食品工程学b % / 黑龙江省普通高等 学校食品科 学与工程重点实验 室,哈 尔滨 1 5 0 0 7 6 )
毛霉蛋白酶的研究
Proteases produced by Mucor
JIN Cheng
(The Editorial Board of Microbiology China, Beijing 100101, China)
Keywords:Mucor, Protease
参 考 文 献
[1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] 陈九武, 杨军. 发酵豆制品的保健功能[J]. 大豆通报, 1998(4): 25. 荆谷, 冯静, 孔健, 等. 微生物金属蛋白酶的研究进展[J]. 生物工程进展, 2002, 22(1): 61−63. 李幼筠. 中国腐乳的现代研究[J]. 中国酿造, 2006, 154(1): 4−7. 林亲录, 赵谋明, 邓靖, 等. 毛霉产蛋白酶的特性研究[J]. 食品科学, 2005, 26(5): 44−47. 郑晓婷, 赵新淮. 毛霉的产蛋白酶发酵条件优化[J]. 微生物学通报, 2009, 36(2): 193−197. 张娜, 赵新淮. 蛋白酶微胶囊制备工艺及在干酪成熟中的应用[J]. 农业机械学报, 2010, 41(2):151−156. 张娜, 赵新淮. Evaluation on the proteolysis of a surface Mucor-ripened cheese during ripening[J]. 食品科学, 2010, 31(15): 149−158. 张娜, 郭庆启, 赵新淮. 表面毛霉成熟干酪制备工艺优化[J]. 食品工业科技, 2010, 31(1): 210−212.
微生物学通报
Microbiology China
tongbao@
JAN 20, 2011, 38(1): 138 © 2011 by Institute of Microbiology, CAS
产蛋白酶菌 Planomicrobium sp.L-2发酵条件的优化
产蛋白酶菌 Planomicrobium sp.L-2发酵条件的优化金玉兰;王玉荣【摘要】通过优化从长蛸胃肠道筛选得到的产蛋白酶菌 Planomicrobium sp.L-2菌株的发酵条件,提高其产蛋白酶的活力。
采用单因素实验研究发酵培养基的最佳碳源、氮源以及最佳发酵条件,采用 Box-Behnken 设计方法进行响应面实验设计,进一步优化培养基组成。
结果表明,最佳培养基组成及发酵条件为:可溶性淀粉0.73%、蛋白胨0.68%、酵母膏0.15%、磷酸高铁0.01%、海水,培养基初始pH 值8.0,接种量8%,发酵温度25℃,发酵时间3.5 d。
优化后,所产蛋白酶的最高酶活力为1457 U·mL-1,比优化前提高约2倍。
%A protease-producing strain Planomicrobium sp.L-2 was isolated and identified from gastrointes-tinal tract of Octopus variabilis .To increase the yield of proteases in Planomicrobium sp.L-2,the optimal fer-mentation conditions for producing protease,including carbon source,nitrogensource,fermentation time,fer-mentation temperature,initial pH value of medium,and inoculum amount were studied by single factor experi-ments.On the base of that,response surface analysis was applied to optimize the compositions of fermentation medium of Planomicrobium sp.L-2 for producing protease.The optimal medium was composed of soluble starch 0.73%,peptone 0.68%,yeast extract 0.15%,FePO4 0.01% in sea water with the initial pH value of 8.0.And then the medium with 8% inoculum amount was cultured at 25 ℃ for 3.5 d.Under these optimal conditions,the activity of proteases produced by Planomicrobium sp.L-2was high up to 1 457 U·mL-1 ,which was approxi-mately 2 times higher than that of the original condition.【期刊名称】《化学与生物工程》【年(卷),期】2014(000)011【总页数】6页(P34-39)【关键词】蛋白酶;Planomicrobium sp.L-2;发酵条件;Box-Behnken 设计【作者】金玉兰;王玉荣【作者单位】青岛农业大学化学与药学院,山东青岛 266109;青岛农业大学化学与药学院,山东青岛 266109【正文语种】中文【中图分类】Q814蛋白酶广泛存在于动物和人的消化道中,对蛋白质的消化吸收起着非常重要的作用[1]。
产角蛋白酶菌株的筛选及发酵条件优化
w h i c h p r o d u c t k e r a t i n a s e . B y e x a m i n i n g H C v a l u e ( t h e r a t i o o f h y d r o l y s i s s p o t d i a me t e r t o c o l o n y d i a m e t e r ) a n d d e g r a d a t i o n r a t e
me t h o d o f s i g l e —f a c t o r e x p e r i me n t s . t h e o p t i ea r l f e r me n t a t i o n c o n d i t i o n o f C J P E 2 0 9 w a s d e t e r mi n e d a s f o l l o ws —f e r me n t a t i o n
便 ,丛呵 氓
S d e n c e a n d T  ̄ c &o t o g 7 Fo o d I n d u s t r y
生
三 程
产 角蛋 白酶 菌 株 的筛 选
及 发 酵 条 件 优 化
蒋 彪, 王常 高 , 杜 馨, 林建国, 蔡 俊 ( 湖 北工 业大 学发 酵工程 教 育部 重 点 实验 室 , 5 - - 业 发 酵湖北 省协 同创 新 中心 , 湖 北武 汉 4 3 0 0 6 8 )
J I ANG Bi a o, W ANG Ch a n g - g a o, DU Xi n, LI N J i a n - g u o, CAI J u n
( K e y L a b o r a t o r y o f F e r m e n t a t i o n E n g i n e e r i n g ( M i n i s t r y o f E d u c a t i o n ) , H u b e i P r o v i n c i a l C o o p e r a t i v e I n n o v a t i o n C e n t e r o f
角蛋白酶工程菌株产酶条件的优化研究
角蛋白酶工程菌株产酶条件的优化研究角蛋白酶是一种重要的酶类,广泛应用于食品、制药、皮肤护理等领域。
角蛋白酶工程菌株产酶条件的优化是提高酶产量和活性的关键。
本文将从培养基成分、培养条件、酶诱导物、温度和pH值等方面,探讨角蛋白酶工程菌株产酶条件的优化研究。
首先,培养基成分对角蛋白酶产酶起着重要的影响。
常见的培养基成分包括碳源、氮源、无机盐和添加剂等。
碳源的选择是影响菌株产酶的关键因素之一。
大部分角蛋白酶工程菌株对简单碳源如葡萄糖、果糖和麦芽糖具有较高的利用率。
氮源对菌株生长和酶产量也有显著影响。
常用的氮源包括氨基酸、尿素和酵母粉等。
无机盐和添加剂的加入可以满足菌株生长的微量营养需求,例如磷酸盐、镁盐和微量元素等。
其次,培养条件对角蛋白酶产酶也有重要影响。
温度是一个关键因素,常见的菌株产酶温度适宜范围为35-40摄氏度。
在菌株产酶初期,培养温度较低有利于菌株生长,而在后期,提高温度可以增强角蛋白酶的产量。
pH值是另一个重要因素,菌株产酶的适宜pH范围通常在7-8之间。
过高或过低的pH值都会影响菌株的生长和酶活性。
酶诱导物也是优化角蛋白酶产酶条件的关键因素之一。
常用的酶诱导物包括激素、金属离子和特定的诱导剂等。
激素能够通过激活转录因子的作用而促进酶的产生。
金属离子如钙离子和锌离子可以作为酶的辅因子参与酶的活化和稳定作用。
特定的诱导剂能够诱导菌株产生更高产量的角蛋白酶。
选择适当的酶诱导物能够提高酶产量和活性。
最后,温度和pH值是影响角蛋白酶产酶的重要条件。
温度的选择要考虑到菌株生长的最适温度,过高或过低的温度都会影响菌株的生长和酶活性。
在角蛋白酶产酶的过程中,温度的变化可以影响到酶的合成速率和空间结构。
而pH值的变化也会影响到酶的酸碱性质和稳定性。
因此,在角蛋白酶产酶过程中要选择适宜的温度和pH值条件。
综上所述,角蛋白酶工程菌株产酶条件的优化研究包括培养基成分的优化、培养条件的优化、酶诱导物的选择和温度、pH值的调节。
毛霉ZG-2菌株产蛋白酶条件优化
毛霉ZG-2菌株产蛋白酶条件优化巩晓芳;张宗舟;薛林贵;张红光;李琳;赵燕【摘要】对毛霉ZG-2菌株的产蛋白酶条件进行优化,以便于生抽大曲的大规模生产.结果表明,在大豆粉40%、麸皮60%、加水100%(V/m)、温度40℃条件下,制成的大曲蛋白酶活性最高,其中酸性蛋白酶酶活2 314 U/g、中性蛋白酶酶活4 602 U/g、碱性蛋白酶酶活1 352 U/g;加120 g/L食盐水溶液进行稀醪发酵60 d,原料蛋白质转化率最高,达79.3%.【期刊名称】《河南农业科学》【年(卷),期】2013(042)004【总页数】4页(P164-167)【关键词】蛋白酶;毛霉ZG-2;稀醪发酵【作者】巩晓芳;张宗舟;薛林贵;张红光;李琳;赵燕【作者单位】兰州交通大学化学与生物工程学院,甘肃兰州730070;天水师范学院生命科学与化学学院,甘肃天水741001;兰州交通大学化学与生物工程学院,甘肃兰州730070;兰州交通大学化学与生物工程学院,甘肃兰州730070;兰州交通大学化学与生物工程学院,甘肃兰州730070;兰州交通大学化学与生物工程学院,甘肃兰州730070【正文语种】中文【中图分类】TS201.25酱类是开门七件事之一,在中国人日常生活中具有重要的作用。
随着生活水平的不断提高,人们对酱类的质量要求也越来越高。
随着科学的发展,酱类的发酵技术也在不断提高,先后经历了大曲高盐稀醪发酵、无盐固态发酵、低盐固态发酵、低盐固态混菌共酵。
几十年来,研究人员一直追求蛋白酶活性的提高、原料转化率的提高、多菌共酵[1]、多酶互作[2]、产品色香味体具佳[3]。
太空育种是当前开发和培育新的优良菌种的有效研究方法之一[4-5],从神舟6号飞船搭载的大曲中,筛选出8个优良的毛霉属菌株,其蛋白酶活性远高于出发菌株,将蛋白酶活性较高的毛霉ZG-2菌株,与曲霉属的米曲霉相配套,进行了生抽生产的中试,取得了良好的结果[6-7],其产品的色、香、味、体经过模糊综合评价均达到较满意的水平,各项质量指标均高于国家标准,原料转化率也有所提高。
毛霉的产蛋白酶发酵条件优化
* 通讯作者: : zhaoxh@ 收稿日期:2008-07-08; 接受日期:2
2009, Vol.36, No.2
生产蛋白酶的优良方法[4]。用于食品加工的蛋白酶 可以由多种菌种生产, 其中, 我国传统发酵豆制品 毛豆腐制作所用毛霉具有分泌蛋白酶、肽酶及其它 酶系的功能, 能进行蛋白质的降解[5], 所产蛋白酶 的酶系丰富, 酶活力高, 在各种调味品以及大豆多 肽的制作过程中起着重要的作用。林亲录等曾研究 分离于自然发酵腐乳的毛霉, 结果表明该毛霉在麸 曲固态培养 72 h 时蛋白酶活力最高, 并且培养 24 h 后翻曲 1 次能显著提高酶活力, 中性蛋白酶酶活达 到 459.7 U/g 干曲[6]。侯美珍等则研究了曲种培养时 间、培养温度及培养基成分对腐乳毛霉产蛋白酶的 影响, 发现酸性蛋白酶产量最大, 而碱性蛋白酶的 量最小, 在 25°C 左右恒温培养 36 h~48 h, 酶活 600 U/g 以上[7]。不过, 国内对毛霉产蛋白酶发酵条 件的优化研究报道较少。
图 2 不同的氮源对酶活力的影响 Fig. 2 The effects of nitrogen sources on protease activity produced by strain M2
郑晓婷等: 毛霉的产蛋白酶发酵条件优化
195
添加大豆分离蛋白(SPI)的培养基中蛋白酶活力 最高, 余下其次是蛋白胨和牛肉膏。添加硝酸钠和 硝酸铵的培养基中蛋白酶活力较低。表明大豆分离 蛋白等有机氮源更有利于 M2 菌株产蛋白酶。 2.2.2 碳源种类:在基础培养基中分别添加浓度为 1%的不同碳源, 它们对蛋白酶活力的影响见图 3。
图 3 不同的碳源对酶活力的影响 Fig. 3 The effects of carbon sources on protease activity produced by strain M2
淀粉酶和蛋白酶产生菌产酶发酵条件的优化
淀粉酶和蛋白酶产生菌产酶发酵条件的优化1 材料与方法1.1 材料1.1.1菌种:枯草芽孢杆菌菌( Bacillus subtilis)1.1.2 培养基1.1.2.1 淀粉酶种子培养基:蛋白胨1%(5g),牛肉膏0.3%-0.5%(1.5g),NaCl 0.5%(2.5g),可溶性淀粉0.2%(1g)(也有0.5%,1%,2%),琼脂2%(10g),加自来水约500mL,加热溶解,调pH 7.0,加自来水定容至500mL。
分装于5个250mL三角瓶中,每瓶100mL(50mL移液管吸取或量筒精确量取),8层纱布封口后,0.1 M Pa灭菌20min。
1.1.2.2 淀粉酶摇瓶发酵培养基:玉米粉2.0 %(40g),黄豆饼粉1.5 %(30g),CaCl2 0.02 %(0.4g),MgSO4 0.02 %(0.4g),NaCl 0.25 %(5g),K2HPO4 0.2 %(4g),柠檬酸钠0.2%(4g),硫酸铵0.075 %(1.5g),Na2HPO40.2 %(4g),加自来水约2000mL,煮30min后4层纱布过滤后,滤液加自来水定容至2000mL(略多几十毫升,怕装不了40瓶),调pH值7. 0。
分装于40个150mL三角瓶中,每瓶50 mL(50mL移液管吸取或量筒精确量取),8层纱布封口后,0.1 M Pa灭菌20min。
(注:40瓶够做时间和温度的,PH另配2000ml)1.1.2.3 蛋白酶种子培养基:葡萄糖0.05%,NaCl 0.5%,K2HPO40.05%,KH2PO4 0.05%,干酪素1%,加自来水约500mL,加热溶解,调pH 7.0,加自来水定容至500mL。
分装于5个250三角瓶中,每瓶100mL(50mL移液管吸取或量筒精确量取),8层纱布封口后,0.1 M Pa灭菌20min。
具体配置:酪蛋白(即干酪素)先用0.2N NaOH溶解,倒入热水中加热搅拌至完全溶解;再加入其他药品,继续加热至完全融化;适量1N HCl调pH。
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保持基础培养基其它组成不变, 依次改变培养 基的氮源、碳源和无机盐种类, 等量接种 M2 菌液, 28°C、150 r/min 摇床培养 48 h, 测定发酵液中蛋白 酶活力。
图 3 不同的碳源对酶活力的影响 Fig. 3 The effects of carbon sources on protease activity produced by strain M2
结果显示, M2 菌株对碳源的利用广泛, 其中葡 萄糖较其他碳源更有利于 M2 菌株产蛋白酶, 可能 是葡萄糖对于蛋白酶的合成有诱导作用; 其他氮源 不利于蛋白酶产生, 可能是它们的分解代谢物对蛋 白酶有阻遏作用[11]。 2.2.3 无机盐:在基础培养基中分别添加浓度为 0.2%的不同无机盐, 以不添加无机盐为对照, 无机 盐对蛋白酶活力的影响见图 4。
* 通讯作者: : zhaoxh@ 收稿日期:2008-07-08; 接受日期:2008-09-09
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微生物学通报
2009, Vol.36, No.2
生产蛋白酶的优良方法[4]。用于食品加工的蛋白酶 可以由多种菌种生产, 其中, 我国传统发酵豆制品 毛豆腐制作所用毛霉具有分泌蛋白酶、肽酶及其它 酶系的功能, 能进行蛋白质的降解[5], 所产蛋白酶 的酶系丰富, 酶活力高, 在各种调味品以及大豆多 肽的制作过程中起着重要的作用。林亲录等曾研究 分离于自然发酵腐乳的毛霉, 结果表明该毛霉在麸 曲固态培养 72 h 时蛋白酶活力最高, 并且培养 24 h 后翻曲 1 次能显著提高酶活力, 中性蛋白酶酶活达 到 459.7 U/g 干曲[6]。侯美珍等则研究了曲种培养时 间、培养温度及培养基成分对腐乳毛霉产蛋白酶的 影响, 发现酸性蛋白酶产量最大, 而碱性蛋白酶的 量最小, 在 25°C 左右恒温培养 36 h~48 h, 酶活 600 U/g 以上[7]。不过, 国内对毛霉产蛋白酶发酵条 件的优化研究报道较少。
因素 Factors
大豆分离蛋白 (g/L) Soybean protein isolate (SPI)
葡萄糖(g/L) Glucose
氯化镁(g/L) MgCl2 磷酸二氢钾 (g/L) KH2PO4 氯化钙 (g/L) CaCl2
表 1 因素水平表 Table 1 Factors and levels of uniformity design
28°C、150 r/min 的振荡培养箱中培养, 每隔 12 h 测 定发酵液的蛋白酶活力, 结果见图 1。
图 1 菌株的酶活力曲线 Fig. 1 Protease activity produced by strain M2 in liquid culture
M2 菌株所产蛋白酶的酶活力在 48 h 达到最大, 之后呈下降。所以选择培养 48 h 来测定蛋白酶活力。 2.2 M2 菌株产酶培养条件的确定 2.2.1 氮源种类:基础培养基中分别添加浓度为 2% 的不同氮源, 它们对蛋白酶活力的影响见图 2。
无机盐的种类对蛋白酶活力的影响很大。磷酸 二氢钾和氯化钙可显著提高酶活力。钙离子可能是 该酶合成的诱导剂, 镁离子是生物代谢途径中多种 酶的激活剂。因此, 优化培养基中的无机盐应有磷 酸二氢钾、氯化钙和氯化镁。这与一些研究报道相 似[12,13]。 2.2.4 培养基的优化:在确定氮源、碳源和无机盐
图 2 不同的氮源对酶活力的影响 Fig. 2 The effects of nitrogen sources on protease activity produced by strain M2
郑晓婷等: 毛霉的产蛋白酶发酵条件优化
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添加大豆分离蛋白(SPI)的培养基中蛋白酶活力 最高, 余下其次是蛋白胨和牛肉膏。添加硝酸钠和 硝酸铵的培养基中蛋白酶活力较低。表明大豆分离 蛋白等有机氮源更有利于 M2 菌株产蛋白酶。 2.2.2 碳源种类:在基础培养基中分别添加浓度为 1%的不同碳源, 它们对蛋白酶活力的影响见图 3。
在工业用酶当中, 蛋白酶是用量最大、应用最 广的一种, 约占整个酶制剂产量的 60%以上, 广泛 应用于食品、饲料、纺织和洗涤等领域[3]。食品生 产用蛋白酶分为动物蛋白酶、植物蛋白酶、微生物 蛋白酶, 其中微生物具有资源广泛、生长繁殖快和 培养方法简单等优点, 所以, 采用发酵工程技术生 产蛋白酶, 原料便宜, 不受土地和季节的限制, 是
生物量(g/L)=3.109+2.945X1-2.765X2+4.842X3+ 2.423X4-1.544X5-1.724X12+2.638X1X2-0.583X222.94X3X1
(式中 X1、X2、X3、X4、X5 分别为大豆分离蛋 白、葡萄糖、氯化镁、磷酸二氢钾、氯化钙的添 加量)
根据回归方程得到优化的产酶培养基条件:大 豆分离蛋白 17 g/L、葡萄糖 14 g/L、氯化镁 2 g/L、 磷酸二氢钾 2 g/L、氯化钙 6 g/L。采用优化的培养 基得到的蛋白酶活力可达到 3.88 U/mL。 2.2.5 培 养 温 度 对 蛋 白 酶 活 力 的 影 响 : 分 别 在 24°C、28°C、32°C 和 36°C 下进行培养, 测定发酵 液蛋白酶活力, 结果如图 5。在 28°C 培养产生的蛋 白酶活力较高, 可能是由于温度升高有利于生长代 谢和蛋白酶的产生; 温度继续升高而酶活力降低, 可能是因为温度上升导致酶失活速度加快, 以及菌 体易衰老而影响正常的生长和代谢。
利用已经确定的硫酸铵饱和度对发酵液进行盐 析以沉淀蛋白酶, 然后对盐析物进行脱盐、浓缩。 提纯的蛋白酶样品和低分子量标准蛋白进行 SDS-PAGE 分析[10]。标准蛋白分子质量范围 14.4 kD ~97.4 kD。
2 结果与讨论
2.1 M2 菌株酶活力曲线的测定 在 100 mL 的发酵培养基中接种 M2 菌株, 在
摘 要: 从发酵豆制品中分离出 1 株产蛋白酶性质优良的毛霉 M2, 并研究 M2 菌株的产蛋白酶条 件。研究优化得出该毛霉菌株的产酶培养基条件为:氮源为大豆分离蛋白, 碳源为葡萄糖, 无机 盐为磷酸二氢钾、氯化钙和氯化镁; 它的适宜的产酶发酵条件为:培养温度为 28°C, 接种量为 2%, 300 mL 三角瓶的装液量为 100 mL, 初始 pH 为 5, 摇床转速为 150 r/min, 培养时间为 48 h; 发酵 液蛋白酶酶活力可达 4.35 U/mL。凝胶电泳法测定出毛霉所分泌蛋白酶的分子量为 36.4 kD。 关键词: 毛霉, 蛋白酶, 发酵条件
Keywords: Mucor, Protease, Fermentation condition
发酵豆制品在我国已有几千年的历史。一些研 究结果发现, 发酵豆制品不仅味美、营养丰富, 而且 具有降低胆固醇、降血压、抗氧化等多种保健功 能[1]。毛豆腐是我国特有的一种大豆发酵食品, 它是 豆腐经自然发酵制成, 利用微生物的发酵来改变大 豆蛋白的质地与风味, 以独特的工艺、细腻的品质、 丰富的营养及鲜香可口的风味深受消费者喜爱[2]。
Optimization of Fermentation Conditions for Proteases Produced by Mucor
ZHENG Xiao-Ting ZHAO Xin-Huai*
(Key Laboratory of Dairy Science, Ministry of Education, Northeast Agricultural University, Harbin, Heilongjiang 150030, China)
本研究从自然发酵生产的毛豆腐中分离得到 1 株毛霉 M2, 并且对它的产蛋白酶培养基组成和培 养条件进行优化, 确定该菌株的适宜产酶条件。同 时, 对所产生的蛋白酶分子质量进行 SDS-PAGE 分 析。研究结果将对该菌株以及所产蛋白酶在生产中 的实际应用, 具有重要的意义。
1 材料和方法
1.1 实验菌种 毛霉(Mucor), 从自然发酵生产的毛豆腐中分离
5000 r/min 离心 20 min, 收集上清液即得粗酶液[9]。 1.6 粗酶液的硫酸铵分级沉淀
除去菌丝和不溶杂质后的发酵液, 加入不同量 的硫酸铵, 4°C 放置 12 h, 离心后分析上清液中残留的 蛋白酶活力, 确定沉淀蛋白酶所需的硫酸铵饱和度。 1.7 蛋白酶活力测定
Folin-酚法(中华人民共和国专业标准蛋白酶活 力测定法 ZBX 66030-1987)。 1.8 蛋白酶分子量的测定
确定最佳氮源、碳源和无机盐后, 选取均匀设 计表 U10(1010), 对它们进行均匀设计实验[8]。 1.4 产酶培养条件的确定
分别从培养温度、培养基初始 pH、接种量、摇 瓶培养基装液量和摇床转速等进行单因素试验。 1.5 粗酶液的制备
培养 48 h 的发酵液用 60 目筛网滤去菌体,
/wswxtbcn
图 4 不同无机盐对酶活力的影响 Fig. 4 The effects of inorganic salts on protease activity produced by strain M2
种类的培养基的基础上, 采用 U10(1010) 均匀设计实 验对它们的配比进行了优化研究(表 1)。对实验结果 (表 2)采用回归分析进行分析、优化处理, 得到如下 的回归方程:
微生物学通报 Microbio36(2): 193~197 © 2009 by Institute of Microbiology, CAS
研究报告
毛霉的产蛋白酶发酵条件优化
郑晓婷 赵新淮*
(东北农业大学 乳品科学教育部重点实验室 黑龙江 哈尔滨 150030)
Abstract: A strain of Mucor named M2, which could produce protease, was isolated from a traditional fermented soybean product. Culture conditions of proteases produced by M2 were studied therefore. The results showed that nitrogen source and carbon source preferred for protease production were soybean protein isolate and glucose, while inorganic salts preferred were KH2PO4, CaCl2 and MgCl2. The suitable culture conditions for protease production were as follows: culture temperature was 28°C, inoculation volume was 2%, liquid level was 100 mL in 300 mL triangle bottle at pH 5, rotating speed was 150 r/min and culture time was 48 h. The obtained protease activity in culture was about 4.35 U/mL. The protease produced by Mucor was analyzed with SDS-PAGE. The protease had a molecular weight of 36.4 kD.