第二节 目的基因制备技术
目的基因的制备基因文库法ppt课件
组织或细胞染色体DNA 限带的所有基 因组DNA片段的集合.
克隆载体 重组DNA分子
受体菌 含重组分子的转化菌
genomic library
每个细胞含有一个基因组 DNA片段与载体的重组DNA分 子，许多细胞组成一个含有基 因组的色概率基因 该种生物所有基因 应用范围 ◆ 基因原始结构功能的研究 ◆ 对比分析内含子、外显子及调控区域 ◆ /46
逆转录
以单链RNA为模板合成双链DNA的反应。
DNA mRNA
14/46
逆转录病毒细胞内的逆转录现象：
RNA 模板 逆转录酶
RNA酶
DNA-RNA 杂化双链
Байду номын сангаас
单链DNA
双链DNA
逆转录现象说明：至少在某些生物，RNA同样具
有遗传物质的传代与表达功能。
15/46
逆转录酶的应用:
应用于基因工程
基因
mRNA 蛋白质多肽链
7/46
2.经验值
Transcription 从cDNA中获得的是经过剪切去除内含子的基因。
ln(1－P)
start codon Plasmid or phage
N=
非翻译区的序列特征对基因的表达具有重要的调控作用，编码序列则是合成基因产物—蛋白质模板。
ln(1－f/g) 某细胞的mRNA分子数为500 000，某个丰度为3500拷贝/细胞的mRNA基因，最小值为500 000/3500=143，丰度为14拷贝/细胞的mRNA
58330
人
3.2×109
320000
1473652
128000
589459
71111
327476
10/46
人工合成目的基因的方法
人工合成目的基因的方法人工合成目的基因是一种重要的分子生物学技术，它可以通过合成DNA序列来构建特定的基因，为基因工程和生物技术研究提供了重要的手段。
在实际操作中，人工合成目的基因的方法通常包括以下几个步骤：1. 设计目的基因序列。
首先，需要根据研究的需要，设计目的基因的DNA序列。
这个过程需要考虑到目的基因的功能和结构，以及在宿主生物体中的表达和调控情况。
在设计过程中，需要使用计算机辅助设计软件来优化基因序列，以提高其在宿主生物体中的表达水平和稳定性。
2. 合成基因序列。
一旦设计好目的基因的DNA序列，就需要使用化学合成或基因重组技术来合成目的基因的DNA序列。
目前，合成基因序列的技术已经非常成熟，可以通过化学合成或基因重组技术来合成几百到几千碱基对长度的DNA序列。
合成基因序列的质量和准确性对于后续的实验和研究至关重要。
3. 构建表达载体。
合成好目的基因的DNA序列之后，需要将其构建到适当的表达载体中。
表达载体是一种可以在宿主生物体中表达外源基因的DNA分子，通常是质粒或病毒。
在构建表达载体的过程中，需要考虑到目的基因的启动子、终止子和调控元件等，以确保目的基因在宿主生物体中能够正确地表达。
4. 转染或转化宿主生物体。
最后，构建好表达载体之后，需要将其转染或转化到宿主生物体中。
转染是指将表达载体引入到细胞中，而转化则是指将表达载体引入到整个生物体中。
通过转染或转化，目的基因就可以在宿主生物体中表达，从而实现对目的基因的研究和应用。
总结。
人工合成目的基因的方法是一项复杂而又重要的技术，它为基因工程和生物技术研究提供了重要的工具。
通过设计目的基因序列、合成基因序列、构建表达载体和转染或转化宿主生物体等步骤，可以实现对目的基因的人工合成和研究。
随着基因合成技术的不断发展，相信人工合成目的基因的方法将会在生物技术领域发挥越来越重要的作用。
目的基因的名词解释制备方法制备流程
目的基因的名词解释|制备方法|制备流程目的基因的名词解释把需要研究的基因称为目的基因。
(一般把需要分析的基因称靶基因，在基因克隆过程中有时两者均称为插入基因，有时三者含义相近。
所以有时有些书本上也笼统的称“用限制性核酸内切酶切割目的基因(靶基因)”)。
目的基因的制备方法从细胞核中直接分离简单的原核生物目的基因可从拟核中直接分离得到，但人类的基因分布在23对染色体上，较难从直接法中得到。
直接分离基因最常用的方法是“鸟枪法”，又叫“散弹射击法”。
这种方法有如用猎枪发射的散弹打鸟，无论哪一颗弹粒击中目标，都能把鸟打下来。
鸟枪法的具体做法是：用限制酶(即限制性内切酶)将供体细胞中的DNA切成许多片段，将这些片段分别载入运载体，然后通过运载体分别转入不同的受体细胞，让供体细胞所提供的DNA(外源DNA)的所有片段分别在受体细胞中大量复制(在遗传学中叫做扩增)，从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把带有目的基因的DNA片段分离出来。
如许多抗虫，抗病毒的基因都可以用上述方法获得。
用“鸟枪法”获取目的基因的优点是操作简便，缺点是工作量大，具有一定的盲目性。
染色体DNA的限制性内切酶酶解II型限制性内切酶可专一性地识别并切割特定的DNA顺序，产生不同类型的DNA末端。
若载体DNA与插入的DNA片段用同一种内切酶消化，或靶DNA与载体DNA末端具有互补的粘性末端，可以直接进行连接。
DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式——黏性末端和平末端。
当限制酶在识别序列的中心轴线两侧将DNA的两条链分别切开时，产生的是黏性末端，而当限制酶在它识别序列的中心轴线处切开时，产生的则是平末端。
人工体外合成简短的目的基因可在了解DNA一级结构或多肽链一级结构氨基酸编码的核苷酸序列的基础上人工合成。
用逆转录酶制备cDNA大多数的目的基因是由mRNA合成cDNA(反转录DNA)得到。
从RNA入手，先从细胞提取总RNA，然后根据大多数真核mRNA含有多聚腺嘌呤(polyadenylic acid ,polyA)尾的特点，用寡聚dT纤维素柱将mRNA分离出，以mRNA为模板，在多聚A尾上结合12-18个dT 的寡聚dT片段，作为合适的起始引物，在逆转录酶作用下合成第一条。
目的基因的获取
需要克隆的DNA片段
编码某种蛋白质
研究某基因与 疾病的关系
研究某基因结构 和功能的关系
二、目的基因的获取
化学合成法
直接从染色体DNA中分离
聚合酶链式反应基因组DNA;cDNA三、PCR扩增获得目的基因
1、PCR的含义
聚合酶链式反应 Polymease Chain Reaction(PCR) 是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法, 由高温变性、低温退火及适温延伸等几步反 应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅 速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、 省时等特点。
（6）引物 3’端的碱基要求严格配对（不能做任 何修饰）， 5’端无严格限制。 （7）引物5′端可修饰 引物5′端限定着PCR产物的长度，但对扩增特异 性影响不大；引物5′端碱基可不与模板DNA互补 而呈游离状态；引物5′端最多可加10个碱基而对 PCR反应无影响。
3’
5’ 3’
限制性内切酶的识别序列 启动子序列 定点突变
若低于94℃则需延长时间
但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有 影响。
3)、退火(复性)：使引物结合在模板上。退火温 度是影响PCR特异性的重要因素。 退火温度，取决于引物的长度、碱基组成及其浓 度，还有靶基因序列的长度，一般在40-65 ℃之 间。
对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55℃作 为选择最适退火温度的起点较为理想。
结果）
•
引物的复性温度的计算公式
Tm（解链温度）＝4(G+C)+2(A+T)
复性温度=Tm值－（5～10℃）； 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可 大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高 PCR反应的特异性；
目的基因的制备
和固相合成两种形式。前者操作繁琐，基本上已淘汰；后
者反应中间物的分离程序简便，DNA合成仪就是根据固
相亚磷酸三酯法原理设计的
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化学合成的单元操作
DMT： 二甲氧基三苯甲基
DMT O
DMT O
CH2 O G
HH
H
H
OH
激活
CH2 O G
HH
H
H
OH
Me O P
Me N Me
CH CH
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1.2.2 化学合成的单元操作
化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体 一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括： 基团保护、分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。
从反应机理上来讲，DNA化学合成有磷酸二酯法、
磷酸三酯法、亚磷酸三酯法；具体操作过程又有液相合成
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第一节 目的基因的制备
26Biblioteka 2）连接反应的效率 连接反应的效率和连接产物的组成与DNA末端的特性、 DNA末端的浓度以及所用的连接酶量有关。
平末端连接反应的效率相对较低，它需要较高浓度的平 末端、较大的连接酶量、较低浓度的ATP以及不能有象 亚精胺一类的多胺。
在连接反应中加入15％的PEG 8000或1～1.5pmol／L 氯化六氨合钴等浓缩剂可极大地促进平末端反应的连接 速度，同时可改变不同连接产物的比例，使连接产物增2019/5/3
第一节 目的基因的A或mRNA 在高度分化的生物体中，不同组织和细胞在不同时段
的mRNA重叠区。 第二 保证DNA片段大小均一。 超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需加装人工接头。 部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，这样 DNA酶解片段的大小可控。 连接前，上述处理的DNA片段必须根据载体的装载量进行分级分 离，以杜绝不相干的DNA片段随机连为一体。
基因工程目的基因的制备
AAAAAA TTTTTTT
连接后体外包装
Eco RI位点 Eco RI酶切
co s位点
co s位点
感染大肠杆菌
整理课件
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（2）、 以mRNA分子为模板合成cDNA第一 链：
以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下，利 用适当的引物合成的。
引物：
oligo(dT)引物：从3`端开始，适于较短的 mRNA。
随机引物：在mRNA的任何位置开始，适于 较长的mRNA。
整理课件
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（3）、双链cDNA的合成：
A、自我引导合成：
用碱处理使mRNA-DNA杂交分子中的 mRNA降解，cDNA第一链解离，单链 cDNA 3`端自身环化，形成一个发夹环结 构。在DNA聚合酶的作用下产生一个完 整的发夹结构双链cDNA，S1核酸酶将发 夹切去，即可。
缺点：S1酶会多切，而丢失信息。
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引物结合 逆转录
细胞总mRNA数/某种mRNA的拷贝数
细胞总mRNA数为500500个
某种mRNA的拷贝数3500最小为500500/ 3500=143个
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经验值是理论值的4.5倍左右
整理课件
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四、利用PCR扩增目的基因
采用PCR进行DNA的克隆省时、省力， 但要求对待扩增的DNA片段的序列必需 已知，至少要求DNA片段的两端约20bp 序列是已知的。
PCR的有以下几种类型：
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1、套式PCR 两对引物扩增同一样品的方法。从一个DNA模板 的同一区域扩增出不同长度的片段而设计。
外侧引物
内部引物
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目的基因的制备
3) 免疫法分离编码特异性蛋白基因：核糖体 沿mRNA进行转译时产生多肽链，通过特异性抗 体与核糖体－mRNA－多肽链复合体结合，然后 分离纯化抗体－核糖体－mRNA－多肽链复合体， 获得特定基因的mRNA。 4)酶促反转录分离特定基因：在反转录酶的作 用下，合成双链DNA，获得一定大小的基因片 断。
•编码区： 翻译起始密码（ATG）：位于SD序列后4-9bp 多肽链编码区： 翻译终止密码（TAG，TGA,TAA）：某些基因后 面只有一个终止密码，某些基因后面有两个终止 密码.
•转录终止区
终止子：原核生物基因在转录终止前的一段提供 转录终止信号的DNA序列（Terminator）. 特点：回文结构，转录后可形成发夹状的结 构，从而使聚合酶减慢或停止前进. a）不依赖于终止因子的终止子（简单终止子） 含有寡聚T序列和一段富含GC的序列 b）依赖于终止因子（）的终止子.
SV40基因组的结构
2）重复基因
在某些生物基因组中，某些基因存在多个拷贝的 现象 * 真核生物基因组中组蛋白基因
3）加倍基因
同一细胞中至少含有两套完全或基本相同的基因
* 高等生物含有两倍以上的染色体 * 细菌质粒DNA * 蓝藻染色体
4）基因重排
在生物的发育过程中，同一基因簇中的基因在 不同的细胞中的排列顺序发生改变的现象.它与 细胞功能的分化及表达有关.
SDS-PAGE analysis of proteins translated by cell-free translation system. Lane 1: protein marker; Lane 2,without mRNA; Lane 3 to 7: translation products of total mRNA from mammalian cells
4第四章 目的基因的制备1
（3）双抗体免疫法分离编码蛋白的基因
原理：抗原、抗体结合 适用范围：适于分离某一真核蛋白质已被分离纯 化，且足以产生特定抗体的基因。
（4）酶促反转录法直接从特定mRNA分离基因 适用范围：主要用于合成分子质量较大，转录产物 mRNA易分离的目的基因。 原理：分离出目的基因的mRNA,再经RT－PCR合 成cDNA
克隆目的基因的基本战略
随机克隆供体细胞的全基因组DNA片段，然后通
过快速有效的筛选程序从众多克隆中分离出含有目
的基因的目的重组子，进而获得目的基因。
鸟枪法步骤
1.使用限制性内切酶将带 有目的基因的DNA链切成若
干小段。
2.再使用DNA连接酶将其整 合到质粒载体的基因中,并 转化受体细胞使其表达。 3.如果在某个细胞中得到
GGA CCTAG
Sal3AI的酶切末端 dATP、dGTP
利用大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段将酶 切末端稍短的突出段部分补平，可有效防止 DNA片段自身连接成原基因组的结构，及载 体臂的自身连接，使噬菌体双臂仅能与单个 基因组DNA片段连接。
G
Xho I识别位点图4-4 不经分级 分离的构建例如，已知某目的基因位
于20kb的Sal3AI片段中，
将染色体DNA用Sal3AI切开
，琼脂糖凝胶电泳分离，
用刀片切下相当于18 - 22 kb大小区域内的凝胶块，
22 kb 18 kb
20 kb
从此凝胶块中回收DNA片段
，然后与载体进行拼接
Klenow片段
GATCC G
G CCTAG
GATCC AGG
用精密的密度梯度超速离心技术）
单链酶解法（富含GC的片段Tm高） 分子杂密度梯度离心法
化学方法合成目的基因
化学方法合成目的基因
化学方法合成目的基因是通过合成化学技术将目标基因的DNA序列人工合成，以用于后续研究或应用。
具体的合成步骤包括：
1. 设计目标基因的DNA序列，并确定所需的合成长度。
2. 将目标基因的DNA序列转换为嵌合基因（chimeric gene）序列，通过添加适当的引物序列和限制性内切酶位点，便于后续的克隆和表达。
3. 使用化学合成技术，如固相合成或酶法合成，根据目标基因的DNA序列逐个合成基因的DNA片段。
在这个过程中，可以考虑引入一些修饰（如特定的限制性内切酶位点、启动子、标签等）来满足研究或应用的需要。
4. 对目标基因进行编辑和修饰，如优化启动子和终止子序列、核苷酸突变、插入或删除片段等，以满足特定的研究或应用需求。
5. 在合成完成后，通过测序验证合成的DNA序列的准确性。
6. 最后，将合成的目的基因进一步克隆入合适的载体中，如质粒、病毒载体或人工染色体等，以进行后续的表达和研究。
化学方法合成目的基因的优势包括制备速度快、灵活性高、定制性强，可以克服目标基因的复杂性和其他技术难题。
这种合成方法广泛应用于基因工程、合成生物学和药物开发等领域。
《目的基因的制备》课件
表达
让目的基因在目标生物体 中得到表达，产生所需的 蛋白质或产物。
常用的制备方法
1
PCR法
通过聚合酶链式反应扩增目的基因，需设计引物与模板DNA配对。
2
连接法
通过连接酶催化，将目的基因与载体DNA连接，形成重组DNA。
3
重组法
利用重组酶切割DNA，然后将目的基因嵌入到载体DNA中。
PCR法的制备步骤
重组法的制备步骤
1. 将目的基因和载体DNA以及重组酶一起反应。 2. 重组酶切割DNA，使目的基因与载体DNA形成黏性末端。 3. 将目的基因嵌入载体DNA中，即形成重组DNA。 4. 将重组DNA转化入宿主细胞，进行表达。 5. 检测表达产物的功能和纯度。
目的基因的应用
科学研究
目的基因的制备使得科学家可 以深入研究细胞、生物体和人 类基因等重要领域。
1. 设计引物，使其与目的基因的序列互补。 2. 提取模板DNA。 3. 设置PCR反应体系，包括引物、酶、酶缓冲液等。 4. 进行PCR扩增，包括变性、退火、延伸等步骤。 5. 检测PCR产物的纯度和大小。
连接法的制备步骤
1. 准备目的基因、载体DNA和连接酶。 2. 将目的基因与载体DNA进行切割，暴露黏性末端。 3. 用连接酶将目的基因与载体DNA连接。 4. 转化连接产物入宿主细胞，形成重组DNA。 5. 筛选含有目的基因的克隆，进一步分析。
医学研究
目的基因的制备有助于研究疾 病发生机制、疾病基因与药物 治疗的关系，推进医学进步。
农业应用
通过改良作物品种，提高产量 和抗病能力，目的基因的制备 对农业发展具有重要意义。
常见问题及解决方法
1 降低质量
使用高质量的试剂和操作规范可以减少目的基因制备过程中的质量问题。
制备目的基因的方法
制备目的基因的方法Gene editing is a method used to modify the DNA of an organism, including humans. 基因编辑是一种用于修改生物体DNA的方法，包括人类。
One of the most common methods for preparing target genes is the CRISPR-Cas9 system. CRISPR-Cas9 is a revolutionary gene editing technology that allows for precise modification of DNA in living organisms. 最常用的制备目的基因的方法之一是CRISPR-Cas9系统。
CRISPR-Cas9是一种革命性的基因编辑技术，可以精确修改活体生物的DNA。
The first step in preparing target genes using the CRISPR-Cas9 system is to design the guide RNA that will lead the Cas9 enzyme to the specific DNA sequence to be edited. 利用CRISPR-Cas9系统制备目的基因的第一步是设计引导RNA，引导Cas9酶到要编辑的特定DNA序列。
Once the guide RNA has been designed, it is then synthesized and inserted into the target cells along with the Cas9 enzyme. 一旦设计好引导RNA，就会将其合成并与Cas9酶一起插入目标细胞中。
After the guide RNA and Cas9 enzyme have been introduced into the target cells, the Cas9 enzyme will search for the specific DNA sequence guided by the RNA and create a double-strand break at that location. 当引导RNA和Cas9酶被引入目标细胞后，Cas9酶将在RNA引导下搜索特定的DNA序列，并在该位置创建一个双链断裂。
目的基因的制备方法
目的基因的制备方法1. 目的基因合成法：目的基因合成法是一种通过化学合成的方式来制备目的基因的方法。
该方法通常用于制备较短的目的基因（小于1000bp），优点是速度快，产量高，并且可以轻松地对目的基因进行修改。
在该方法中，目的基因的序列首先被设计并确定，然后通过化学合成的方式进行合成。
通常将该序列分成几个较短的片段，并逐一地进行合成和连接，直到完整的目的基因被制备出来。
2. PCR扩增法：PCR扩增法是一种广泛应用于制备目的基因的方法。
该方法利用特定引物的作用下，在体外反应体系中将目的基因的DNA序列扩增至所需的数量。
优点是产量高，适用于中等长度的目的基因，且可以进行定向的修饰。
在该方法中，首先设计引物，确定PCR反应体系中目的基因的起始和终止位置。
然后，通过PCR扩增反应，将模板DNA中的目的基因序列扩增至所需数量。
通过纯化和测序等处理，制备出干净的目的基因。
3. 基因克隆法：基因克隆法是将目的基因分子克隆至载体DNA上的一种方法。
该方法通常适用于较长的目的基因（大于1000bp），优点是产量高，重复性好，并且可以进行定向的修饰。
在该方法中，需准备一种能够接受目的基因的载体DNA，并将其线性化。
然后，在体外反应体系中，将目的基因的DNA序列与线性化载体DNA连接，形成重组DNA。
通过将重组DNA转化至感受态细胞中并筛选，制备出所需的目的基因。
4. 基于CRISPR技术的编辑法：基于CRISPR技术的编辑法是在生物体内或外对目的基因进行编辑的方法。
该方法利用CRISPR-Cas9等系统以及其引导RNA的作用，直接在目的基因序列中进行特定断裂和编辑。
优点是精度高，易于实现定向编辑。
在该方法中，首先需要设计合适的引导RNA序列，并在细胞内或外表达Cas9蛋白，以引导Cas9与引导RNA结合并特异性切割目的基因的DNA序列。
然后，在切割的断口处，可将外源DNA序列转化进去，实现目的基因的定向编辑。
5. 手工组装法：手工组装法是一种将片段PCR产物或化学合成的短片段组装成完整目的基因的方法。
关于目的基因的制备 (2)课件
目的基因的获取
1 基因组DNA片断化 2 PCR技术于带有粘性末端，产物可以直接与载 体连接。
➢ 缺点：目的基因内部也可能有该内切酶的切点。 目的基因也被切成碎片！
BamH I BamH I
BamH I
gene
1.2 机械切割法
1）超声波 超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约
300bp的随机片断。 2）高速搅拌
1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机 片断。
低浓度引物
高浓度引物
4）RT-PCR:
• 提取组织或细胞中的总RNA
• 以其中的mRNA作为模 板，以 Oligo（dT）或 随 机引物 或 基因特异性为引 物，利用逆转录酶反转录 成cDNA。
• 以cDNA为模板进行PCR 扩增，而获得目的基因或检 测基因表达
5）多重PCR：在一个反应体系中使用一对以上 引物的PCR称，其结果是产生多个PCR产物， 用于检测特定基因序列的存在或缺失。
目的基因的获取
1 基因组DNA片断化 2 PCR技术se Chain Reaction
（1）反应体系：
含有目的基因或序列的DNA模板 热稳定的DNA聚合酶（Taq酶） 一对脱氧寡核苷酸引物（primer） 4种脱氧核苷三磷酸(dNTP) Buffer及Mg 2+等
粘性末端 连接
平末端
接头或
T-A
连接 衔接物分子 克隆
导入宿 主细胞
重组噬菌体 DNA的转染
重组质粒 的转化
重组噬菌体DNA或柯斯质粒 体外包装成噬菌体颗粒的转导
化学合成法合成目的基因的步骤
化学合成法合成目的基因的步骤嘿，咱今儿个就来聊聊化学合成法合成目的基因那些事儿！你想想看啊，这就好像搭积木一样，得一块一块精心地拼凑起来。
首先呢，咱得设计好基因的序列，这可不能马虎，就像盖房子得先有个精确的图纸似的。
然后根据这个序列，把一个个核苷酸小分子给连接起来。
这连接的过程可不简单啊！就跟串珠子似的，得小心翼翼，不能串错了。
每一个核苷酸都得放对位置，不然最后合成出来的基因可就不是咱想要的啦。
接着呢，把这些连接好的小片段慢慢延长，一点点地让它长成我们期望的那个样子。
这时候就需要一些特殊的酶来帮忙啦，它们就像是神奇的助手，能让这个过程更顺利地进行。
等合成得差不多了，还得检查检查，看看有没有什么瑕疵。
这可不能将就，就跟挑水果一样，有坏的咱可不能要。
要是发现有问题，就得赶紧修正，可不能让有缺陷的基因跑出去捣乱呀。
再之后，把合成好的目的基因从那些反应物里分离出来，让它干干净净地出现在我们面前。
这感觉就像是从一堆杂物里找出宝贝一样，得有耐心，还得有技巧。
最后，好好地保存起来，等要用的时候再拿出来。
就像是把珍贵的东西放进保险箱里，得确保它的安全和稳定。
你说这化学合成法是不是很神奇？咱通过一步步的操作，就能够创造出我们想要的目的基因。
这在以前，那简直是想都不敢想的事儿啊！但现在呢，科学家们就是这么厉害，能够让这些看似不可能的事情变成现实。
这合成目的基因的步骤，每一步都很关键，每一步都不能马虎。
就像走钢丝一样，得稳稳当当的，稍有差错可能就前功尽弃啦。
所以啊，做这个可得打起十二分的精神来。
咱平时生活里也有很多类似的事情啊，比如说做一道复杂的菜，不也是得一步一步来，调料不能放错，火候不能弄错，最后才能做出美味的菜肴。
这和合成目的基因不是很像吗？都是需要精心、细心和耐心的呀！所以说，不管是科学研究还是日常生活，道理都是相通的嘛。
总之呢，化学合成法合成目的基因，这可是个了不起的技术，它为我们打开了一扇通往未知世界的大门。
目的基因的制备和基因克隆的筛选
contents
目录
• 引言 • 目的基因的制备 • 筛选策略与方法 • 实验结果与数据分析 • 结论与展望
01 引言
目的基因的重要性
决定生物性状
目的基因是生物体内控制特定性 状表达的关键基因，其序列和表 达水平直接影响生物的表型特征。
潜在应用价值
目的基因往往与生物体的生长、 发育、代谢等关键过程密切相关， 因此具有潜在的应用价值，如用 于基因工程、生物制药等领域。
限制性内切酶酶切分析
利用限制性内切酶对DNA进行酶切，通过凝胶电泳分析酶切片段的大小和数量，判断 目的基因是否插入到载体中。
Southern杂交分析
将酶切后的DNA片段转移到固相支持物上，与特异性探针进行杂交，通过放射自显影 或化学发光等方法检测杂交信号，确定目的基因的存在和位置。
PCR筛选
菌落PCR筛选
05 结论与展望
实验结论总结
成功制备了目的基因
通过PCR扩增和基因合成等方法，成功获得了所需的目的 基因片段，为后续实验提供了基础。
建立了基因克隆筛选体系
通过构建重组质粒、转化宿主细胞、筛选阳性克隆等步骤， 成功建立了基因克隆的筛选体系，为后续基因功能研究提 供了有效手段。
验证了基因功能
通过基因表达分析、蛋白互作研究等方法，初步验证了目 的基因在细胞中的功能和作用机制。
重组DNA的转化与扩增
重组DNA的转化
将重组DNA分子导入到合适的宿主细胞中，如细菌、酵母或哺乳动物细胞等，使其获得新的遗传特性 。
重组DNA的扩增
通过选择培养基筛选阳性克隆，并进行扩大培养，以获得足够的重组DNA分子用于后续实验。同时， 可以通过PCR等方法对重组DNA进行进一步验证和鉴定。
人工合成目的基因的方法
人工合成目的基因的方法
人工合成目的基因的方法是指通过化学合成的方法组装出含有特定功能的基因序列。
这种方法可以将不同的基因片段组合在一起，以便制造出需要的蛋白质或工程化细胞，从而具有了多种应用。
以下是人工合成目的基因的方法：
1. DNA合成：化学DNA合成方法能够使我们在实验室中人工制造出任意长度和序列的DNA分子。
该方法使得研究人员可以从头开始设计大量不同的DNA 序列，以便最终得到想要的表达和功能。
2. PCR扩增：如今，PCR（聚合酶链反应）已成为许多实验室里人工合成DNA 的常规技术。
PCR方法能够大规模扩增目标DNA序列，通常需要对模板DNA 进行设计，以适应PCR特定的引物、温度和其他参数。
3. 基因拼接：这个方法是将多个DNA片段组装在一起，产生新的DNA序列。
由于基因拼接方法最终生产的DNA可能长度很长，特别是用于人工合成蛋白质和合成先进纳米器件时，该流程更显重要。
4. 化学修饰：DNA开放着广泛的潜力，在理想情况下可以用于各种化学修饰操作。
对DNA的化学修饰能够改变其性质，例如DNA碱基的附加功能，染料滴定物等，这些改变可能会改变DNA的表达和功能，这些特性能够用于对生物学
过程的研究。
5. 克隆：当人工合成DNA准备好之后，克隆就是下一步操作。
克隆是将人工合成的DNA序列纳入到表达载体或其他载体中，这些载体通常用于将人工合成的DNA序列导入到目的细胞中。
总之，人工合成目的基因的方法可以精确地设计出需要的DNA序列和蛋白质，从而推动开发各种生命科学和细胞生物学的应用。
这种方法提供了一种响应快速的、高效率的方法，也是下一代药物和纳米设备的发展方法。
人工合成目的基因的方法
人工合成目的基因的方法目的基因是指通过人工合成技术获得的具有特定功能的基因序列。
人工合成目的基因的方法是一种重要的基因工程技术，可以用于生物学研究、医学治疗、工业生产等领域。
下面将介绍几种常见的人工合成目的基因的方法。
1. 基于DNA合成技术的方法DNA合成技术是目前最常用的合成基因的方法之一。
它通过化学合成方式，将设计好的目的基因序列合成成DNA片段。
DNA合成技术具有高效、精确、可控的特点，可以根据需要合成任意长度的基因序列。
合成的DNA片段可以直接用于转化到宿主细胞中，实现目的基因的表达。
2. 基于PCR扩增技术的方法PCR扩增技术是一种通过DNA聚合酶酶链反应合成目的基因的方法。
通过设计引物，可以选择性地扩增目的基因的特定片段。
PCR 扩增技术具有高度特异性和高效性，可以在短时间内合成大量目的基因序列。
此外，PCR扩增技术还可以通过引入特定的变异、插入或删除来构建具有特定功能的目的基因。
3. 基于重组DNA技术的方法重组DNA技术是一种通过将两个或多个不同的DNA序列组合在一起，构建具有新功能的目的基因的方法。
重组DNA技术可以通过DNA酶切和连接酶的作用，将不同来源的DNA片段连接在一起，形成目的基因。
重组DNA技术可以实现不同基因的拼接、替换、插入等操作，从而创造出具有特定功能的目的基因。
4. 基于基因片段合成技术的方法基因片段合成技术是一种通过合成目的基因的部分片段，然后通过连接酶的作用将这些片段逐步连接在一起，最终构建完整的目的基因的方法。
基因片段合成技术可以根据需要合成目的基因的不同片段，然后通过连接酶的作用将这些片段连接在一起，形成完整的目的基因。
基因片段合成技术可以实现对目的基因的精准控制和调控，从而获得具有特定功能的目的基因。
人工合成目的基因的方法是一种重要的基因工程技术，它可以通过合成和改造基因序列，创造出具有特定功能的目的基因。
这些方法在生物学研究、医学治疗、工业生产等领域具有广泛的应用前景。
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1、基本原理和构建过程
特：是含 有某种生物全部无表达功能的内含子序列。 每一个克隆变性
95˚C
延伸 72˚C
退火
Tm-5˚C
Template DNA
5
The 1st cycle
5
5
Primer 1
5 Primer 2
5
5
5
The 2nd cycle
5
5
5 5
5
5 5
5
5
指数扩增期
平台期
到达平台期所需PCR 循环次数取决于模板 拷贝数、PCR扩增效 率及DNA聚合酶的种 类及活性.
（二）PCR引物
是一段与模板DNA互补的寡核苷 酸片段，对DNA的扩增起到引发作用。
1. 长度：15～30个核苷酸 2. 碱基随机分布，G+C：45％－55% 两端引物有近似的Tm值 3. 引物内、引物间不应有互补序列 4. 引物与非特异扩增区无同源性 5. 3′端必须互补 6. 5′端可游离十几个碱基，而不影响反应，可修饰
（三）PCR的主要应用
目的基因的克隆 基因的体外突变 DNA和RNA的微量分析 DNA序列测定 基因突变分析
二段，每一 个DNA片段都与一个载体分子拼接成重组DNA， 然后将所有的重组体都引入宿主细胞并进行扩 增，得到的分子克隆的混合体称为“基因文 库”。从基因组中通过杂交筛选得到目的 基因片段。
DNA Replication:
• DNA Replication:
Template
3’
5’
DNA-pol 3’ dATP dGTP
5’
3’ dCTP
Primer
dCTP
dGTP dATP
dTTP
dTTP
PCR仪器设备：
自动移液器和枪头 微量离心管 PCR仪 电泳设备
2、PCR反应原理
(引物浓度一般为0.1～ 0.5mol/L)
（三）耐热DNA聚合酶：
比如：Taq DNA聚合酶（Taq :
Thermus aquaticus）
Taw DNA聚合酶在70～80℃具 有最高聚合活性度； 95℃,T1/2(half life) 40min Taq酶活性需要Mg2+ ，Mg2+浓 度过高导致非特异扩增，一般常 用1.5mmol/L
（五）底物dNTP浓度
Zn ++ ，Mg++是Taq酶活性所必需的金属离 子。 1.5~2.0mM Mg++是比较合适的。 Mg++浓度的高低能影响反应的特异性和扩 增片断的产率。Mg++过量能增加非特异性扩 增并影响产率。
（六）PCR反应缓冲液：
组成 50mM KCl 10mM Tris.Cl RNA 逆转录成cDNA后,将所有cDNA混合体与载体进 行连接后，将所有的重组体分子都引入宿主 细胞并进行扩增，所得到的分子克隆的混合 体称为 cDNA。1、基本原理 和构建方法
（二）cDNA目的基因的筛选原理：利用已知的分编码的表达产物（核酸杂交）， 从而分离出目标基因。
（二）聚合酶链反应（PCR）
1、定义： 又称基因体外扩增；是在引物的介导 下，通过变性、退火、延伸三步循环反 应，体外快速的DNA特异性扩增技术。
——PCR技术的发明者——
Kary B. Mullis（1944－）
“I do my best thinking while driving”
1993 Nobel prize
第六章第二节
目的基因的制备技术
主讲人:张敏
一、已知基因的获得
（一）人工合成
①根据已知某种基因的核苷酸序列或某种基因 产物的氨基酸序列，可推导出为该多肽编码的 核苷酸序列，再用DNA合成仪人工合成目的基 因。 ②适用于合成分子量较小的目的基因（100bp 以内）。
应用：
核酸分子杂交的探针 合成DNA链的引物：DNA序列分析双脱氧终 止法的引物和聚合酶链式反应的引物等。 基因合成元件：较小的基因或天然来源不易得 到的完整基因或用于改造天然基因。 DNA末端改造中的接头 制备cDNA，筛选克隆基因，用于基因定位及 位点专一性改变。
模拟体内DNA复制过程，通过变性、退火、延 伸三步反应的循环完成，靶基因的双链DNA变 性为单链，特异的引物在退火过程中与单链 DNA模板聚合，在靶DNA的指导下引物的3’末端 延伸靶DNA的互补链，完成一个循环。理论上， 每一循环使DNA分子扩增一倍，n次循环后， DNA分子扩增为2n；
2、PCR反应体系
1.5mM MgCl2
（七）一价阳离子
一般使用50mmol/L的KC1溶液，有利于改善 扩增的产物质量。
3、PCR的基本操作
（1）变性，加热至95 ℃，使模板DNห้องสมุดไป่ตู้解开成单链；
（2）退火，温度降至适宜，使引物与模板互补结合；
（3）延伸，温度升至72 ℃ ，DNA聚合酶以4种dNTP
为底物，在引物的3’-OH上，合成与模板 互补的DNA新链。
模板：DNA或RNA(逆转录合成cDNA) DNA聚合酶：TaqDNA聚合酶 缓冲液系统：Tris-HCl,KCl,Mg2＋ 底物：相同浓度的dNTP 引物
salts (ions)
Template DNA
dNTPs
Primers
DNA Polymeras e
（一）模板
包括生物体基因组DNA、质粒DNA、 噬菌体DNA、mRNA和cDNA分子等， 几乎所有形式的DNA和RNA都能作为 PCR的模板。除此之外，PCR还可以直 接以细胞为模板。
Polymerization 聚合反应
Taq Polymerase
5’ 3’ 3’
A
Taq polymerase: 72℃, 2,000～4,000 bases/min
5’
（四）脱氧核苷三磷酸(dNTP)：
是DNA合成的原料，包括dATP、dGTP、dTTP、 dCTP。
dNTP浓度应在20~200uM, 浓度过高可加快反应速度。同时，还可增加碱基 的错误掺入率和实验成本。 浓度过低会导致反应速度的下降，但可提高实验 的精确性。 此外，由于dNTP可能与Mg++ 结合，因此应注 意Mg++浓度和dNTP浓度之间的关系。
①用核酸探针筛选目的基因： ②寡核苷酸探针筛选目的cDNA某基因对器官、组织和细组织基因的制备。 3. 由于每一个cDNA克隆都包含一种mRNA序列，这 样在筛选中出现假阳性的概率就会降低。 4. 为了测定mRNA序列，利用它的cDNA拷贝序列就 可以