PPARγ基因shRNA真核表达载体的构建及其干扰效果鉴定

P P A M基因shRNA真核表达载体的
构建及其干扰效果鉴定
辛婧、沈亚非、邓飞\谢亚争、张日华2,刘云2
1.漯河市中心医院内分泌科，河南漯河462000;2•南京医科大学第一附属医院老年医学内分泌科
摘要：目的构建过氧化物酶体增殖物激活受体y(PPARy)基因RNA干扰的真核表达载体，转染小鼠3T3-L1前体脂肪 细胞，并鉴定其干扰效果。

方法选择设计2条针对小鼠PPA R y基因的干扰耙序列，构建真核表达载体PLKO. 1-PPARy-GFP-shRNAl/2,以PCR鉴定并进行序列分析。

证实质粒构建成功后，转染小鼠3T3-U前体脂肪细胞，荧光显微镜下观察 绿色荧光蛋白（eGFP)的表达，计算转染效率;采用实时定量PC R法和W estern印迹检测载体对PPA R y基因的表达干扰效 果;采用油红染色观察PPA R y在脂肪细胞分化过程中对脂滴形成的作用。

结果成功构建PPA R y干扰质粒PLKO.1- PPARy-GFP-shRNAl/2，PC R和DNA测序证实序列与设计完全一致;荧光显微镜下观察到3T3-L1细胞绿色荧光蛋白的表 达,证实重组质粒成功转人细胞，转染效率(92. 67士1.53)%;实时荧光定量PC R和Western B lot印记试验均显示PLKO. 1-PPARy-GFP-shRNAl/2转染的3T3-L1细胞PPARy基因分别被特异性抑制；耙点1干扰效率[(78. 2士2.1)%]高于耙点2 [(55.8±4.3)%],差异有统计学意义（P C0.05),靶点1初步鉴定为有效靶点。

油红染色显示PLKO. 1-PPARy-GFP-shR-NA1/2转染均可抑制3T3-L1脂肪细胞分化和脂滴聚集。

结论成功构建了耙向干扰PPA R y基因的shRNA真核表达质粒 PLKO.l-PPARy-GFP-shRNAl/2,并筛选出有效抑制靶基因的表达质粒，初步验证PPA R y基因对脂肪细胞分化的作用，为 进一步研究提供了有效的分子生物学工具。

关键词:小鼠3T3-L1前体脂肪细胞;RNA干扰;PPA Ry基因
中图分类号：R392 文献标识码：A文章编号：1006-%70(2021)03-0255-04
Construction of shRNA eukaryotic expression vector of
PPARy gene and identification of its interference efficiency
XIN Jin g*，SHEN Ya-fei，DENG Fei，XIE Ya-zheng，ZHANG Ri-hua，LIU Yun
*The Central Hospital of Luohe,Department of endocrinology, Henan Luohe 462000,China Abstract：Objective To construct the eukaryotic expression vectors to interfere the expression of peroxisome proliferator activated receptor/(PPA R y) gene；to transfect mouse 3T3-L1 cells and to study the silencing effect. Methods Two interfer­ence target sequences were designed for PPARy gene silencing in mice. The eukaryotic expression vectors PLKO. 1-PPARy- GFP-shRNAl/2 were constructed and identified by PCR and sequence analysis.The confirmed plasmids were transfected into mice 3T3-L1 preadipocytes. The transfection efficiency was calculated by observing the green fluorescence protein expression under the fluorescence microscope；the gene inhibition efficiency was analyzed by real time PCR and Western blot analysis for PPARy gene expression. The lipid droplets were observed by oil-red O staining to explore the role of P PA R/ in 3T3-L1 preadi­pocyte differentiation. Results The recombinant plasmids PLKO. l-PPA Ry-G FP-shR N A l/2 were constructed successfully, both PCR and DNA sequencing confirmed that the sequences were consistent with the design. The expression of green fluores­cent protein in 3T3-L1 cells was observed under fluorescence microscope, which confirmed that the recombinant plasmids were successfully transfected into 3T3-L1 cells，resulting the transfecting efficiency of (92. 67士 1. 53)%.The real time fluorescence quantitative PCR and Western blot analysis showed that PPARy gene expression levels in 3T3-L1 cells transfected with PL- KO. l-PPA Ry-GFP-shR NA l/2 were specifically inhibitecLThe interference efficiency of target 1[(78. 2士2. 1)%] was higher than that of target 2 [(55. 8 士4. 3 )%]，the difference was statistically significant ( P <0• 05); target 1was preliminary identified as effective target. Oil red staining showed that PLKO. l-PPA Ry-G FP-shR N A l/2 trasfection could inhibit 3T3-L1 preadipocytes differentiation and lipid droplet accumulation. Conclusion The eukaryotic expression vectors of PLKO. 1-
DOI： 10.13668/j.issn. 1006-9070.2021.03.001
基金项目：河南省教育厅高等学校重点科研项目（21A320011);河南省科技攻关项目（212102310199)
作者简介:辛婧(1985—），女，河南漯河人，副主任医师，主要从事代谢综合征方面的研究
通信作者：刘云，主任医师，丑-1113丨1:1丨11>0111@611111.6〇111.(：11
PPA Ry-G FP-shRN Al/2 were constructed successfully. The effective target silencing plasmid was identified, the effect of PPARy on adipocyte differentiation was preliminarily verified ； which provides an effective molecular biological tool for further study.
Key words：Mice 3T3-L1 preadipocyte；RNA interference；PPA R/ gene
过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisomepro-liferators-activated receptor,PPARs)是一•类被配体激 活的转录因子，包括PPAR«、PPAR/3和PPARy 3种 亚型，均属于核受体超家族成员[1]，其中对PP A R y的研究最为广泛和深人。

P P A R y的生物学功能较为复 杂，不仅参与糖脂代谢、脂肪细胞分化、动脉粥样硬 化、炎症、免疫及肿瘤细胞分化与凋亡等生理病理过程 的调控，还在细胞信号通路中起关键作用[2_3];对其促进 脂肪细胞分化和生成作用，分子机制、对机体能量和糖 脂代谢等方面所起的调节作用，是当前肥胖与糖尿病等 代谢性疾病研究领域的关注热点M。

本研究设计构建 针对靶基因P P A R y的小发卡RNA(shRNA)的重组 质粒载体，同时转染小鼠3T3-L1前体脂肪细胞，并鉴 定其干扰效果，旨在为进一步探讨PPA R y基因调控 前体脂肪细胞分化及肥胖发生的作用机制奠定分子 生物学基础。

1材料与方法
1.1材料3T3-L1细胞株购自上海细胞生物研究 所，293T细胞(上海细胞库）、大肠杆菌DH5«感受态 细胞及PLK〇. 1-SP6-G F P载体由南京医科大学分子 遗传研究室李建民教授馈赠；限制性核酸内切酶(EcoRI、NheI)、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、D N A片段纯化试剂盒、反转录试剂盒（PrimeScript™RT reagent K it,Expand Template PCR System)!^ 购于大连T akara公司；质粒小量抽提试剂盒及质粒 中抽试剂盒（MiNi/MiDi K it)均购于美国QIAGEN 公司；TRIzol Reagent、焦碳酸二乙酯DEPC、无 RNAase水、M-MLV-Reverse Transcriptase system、R N ase抑制剂、细胞转染试剂盒Lipofectamine 2000 等试剂均购于美国Invitrogen公司；油红（)、IBMX、胰岛素、地塞米松购于美国Sigma公司；DMEM高糖 培养液及胎牛血清购于美国H ydone公司；PPARy 兔源抗体购于美国Research Genetics公司，二抗羊抗 兔IgG■辣根过氧化物酶及/3-actin抗体购于北京中杉 生物技术有限公司。

1.2 方法
1.2.1靶向PPARy shR N A表达质粒的构建依据GenBank中PP A R y的核苷酸序列，结合PPARy m RN A的二级结构及小分子干扰RN A设计原则，设 计了2个靶序列（PPAR广s h R N A l和PPARy-shRNA 2)，同时设计1条不降解任何靶基因的阴性对照序列。

PPARy-shR N A l:正义链（5’-CCGGGCCCTG-GCAAAGCATTTGTATCTCGAGATACAAAT GCTTTGCCAGGGCTTTTT03，），反义链（5，-AATTCAAAAAGCCCTGGCAAAG CATTTGTA-TCTCGAGATACAAATGCTTTGCCAGGGCS-'); PPARy-shRNA2:正义链（5’-CCGGGCCCTTTAC-CACAGTTGATTTCTCGAGAAATCAACTGTG GTAAAGGGCTTTTT03，），反义链（5，-AAT-TCAAAAAGCCCTTTACCACA GTTGATTTCTC-GAGAAATCAACTGTGGTAAAGGGC-3,）。

取相应的正义链和反义链oligo溶液，进行单链 退火反应。

将所得双链寡聚物连接至酶切处理后RNAi表达载体 PLKO. 1-TRC-screamble shRNA 的A gel与EcoRI位点之间，构建靶向shRNA重组表达 质粒。

转化感受态DH5a细菌，涂在100 M g/m l氨苄 青霉素的培养板上，37 °C培养过夜，次日挑取单克隆 菌落进行摇菌扩增。

1.2.2重组表达质粒的鉴定以摇菌后的菌液为模板，3卩6、116(5’-八八丁八八丁丁八€〇八丁八0八八〇〇(：丁- GTTAGAGA03')为引物进行PC R扩增，产物经琼 脂糖凝胶电泳鉴定，目的片段286 b P，挑取阳性菌落 并保种，抽提质粒送至上海英骏生物技术有限公司测 序鉴定。

1.2.3慢病毒载体转染293T细胞对测序正确的干扰质粒转化摇菌扩增后，经Plasmid MiDi K it抽提 质粒，同时准备阴性对照质粒PLKO. 1-TRC-screamble shRNA，包装质粒 PVSVG，delta8.91。

转 染前24 h将293T细胞铺6 cm培养皿，（2〜4) X106万/皿（细胞密度约为90%〜95%)。

6 h后换用DMEM完全培养基。

转染后24 h换液3 m l,转染后 48、72 h收集包装产生的慢病毒上清。

1.2.4建立稳定转染细胞株感染前1天，将3T3-L1细胞接种到6 cm细胞培养皿中，细胞数为(6〜10) X 1〇4个（细胞密度为10%〜20%)。

二次感染后的3T3-L1细胞进行传代，传代后用含嘌呤霉素（浓度为0.5 yg/m l)的D M EM完全培养基培养感染后的3T3-L1细胞,观察细胞状态，约每2天换一次液，共培 养2周，显微镜下观察到的单克隆细胞团即稳定转染 细胞株。

挑取稳定转染的3T3-L1细胞株，置于荧光 显微镜下观察绿色荧光表达强度并拍照，计算出转染 效率(转染效率=发出绿色荧光细胞个数/明场中细
通PCR 扩增，作琼脂糖凝胶电泳鉴定，6个单克隆均扩 增出286 b p 目的片段286,与鉴定结果相符(图1)。

1 2 3 4 5 6 Marker
注：1、2、3 为 PLKO . 1-PPARy -GFP-shRNAl 的阳性克隆，4、5、6 为 PLKO . l -PPARy -GFP -shRNA 2 的阳性克隆。

图1
重组质粒PLKO•卜P PA R y-G FP 的P C R 鉴定结果
2.2测序鉴定结果将阳性克隆抽提质粒送测序， 测序结果证实目的基因干扰序列插人完全正确且无突变。

2.3重组质粒转染效率干扰质粒带有绿色荧光片 段，重组质粒转染3T 3-L 1细胞24 h 后，荧光显微镜观 察显示感染细胞中可表达绿色荧光蛋白（G FP )，通过 对多张视野下图片行定量细胞统计分析，得到G F P 显 著表达细胞转染率为(92. 67土1. 53)%。

2. 4 稳定R N A 干扰3T 3-L 1细胞株P P A R y 水平 转染PLKO . 1-PPARy G F P 质粒的3T 3-L 1细胞于 24 h 后收取细胞，T riz o l 法提取RNA ，逆转录成
c D N A 后，以荧光定量PC R 测定PPARy m R N A 水平
鉴定其干扰效果。

同时，收集各组细胞蛋白行
W estern 印迹验证。

各实验独立重复3次以上，重复 性好。

稳定干扰组细胞的PP A R y 基因m R N A 及蛋 白表达水平较阴性对照组细胞明显下降，与阴性对照 相比差异均有统计学意义（P 值均<〇_ 〇5)。

耙点1 干扰效率为（78.2 士 2.1)%，靶点2为（55.8 士 4. 3)%，差异有统计学意义(PC O . 05).靶点1初步鉴 定为有效靶点。

见图2、图3。

2. 5 PPA R y 干扰对前体脂肪细胞分化过程中脂滴 形成的影响诱导分化各组3T 3-L 1细胞，采用油红 〇染色，观察前体脂肪细胞分化过程中脂滴形成情 况，发现2个靶点的PPA R y 干扰在4、8 d 均可显著抑 制3T 3-L 1细胞分化过程中脂滴的形成(图4)。

空白对照组阴性对照组 靶点1 靶点2
注：与阴性对照组相比，* P <〇. 〇5, ••■?<〇. 〇1。

图2
P P A R y 稳定干扰3T 3-L 1细胞株表达水平
胞总个数X 100%)。

1.2.5
实时荧光定量R T -PC R 法检测PPARy
mRNA 的表达分别吸去转染24 h 后的各组细胞培 养液，用Trizol 试剂盒分别提取各组细胞总RNA ;取 2哗RNA 模板行逆转录，按试剂盒方法进行反转录 得到cDNA 。

对各组细胞的cDNA 进行模板效果验 证。

GenBank 序列通过引物设计软件设计PPARy (F : 5 '-aataatggctatatttatagctgtcatta -3'; R : 5 ’-aataatg -
gactttcctgctaatacaag -3’）及内参 /3-actin 定量引物（In -vitrogen 公司合成）。

实时荧光定量RT-PCR 的总反 应体系共 20 p i ，应用 Quanti Tectonic SYBR Green PCR Master M ix 进行扩增。

反应结束后分析2_^^值 并计算定量结果。

所得值以内参/?-actin 标化后输人 Excel 软件进行分析。

1.2.6 Western B lo t 印迹法检测PPA R y 蛋白表达 分别抽提正常3T 3-L 1细胞、转入阴性对照质粒
PLO . 1-shRNA 的3T 3-L 1细胞及转入慢病毒载体
(P L K a i -PPARy -GFP -shRNAl /2)的 3T 3-L 1 稳定 转染细胞中的总蛋白，制备分离胶和浓缩胶，1〇〇 V 稳 压电泳，半干转膜。

其中一抗为PPA R y 多克隆抗体 (抗体浓度1:500)，二抗为羊抗兔IgG ■辣根过氧化物 酶(抗体浓度1: 2 000),用Western B lot 印迹化学发 光法检测各组细胞株PPA R y 蛋白的表达。

1. 2. 7 3T 3-L 1细胞培养及诱导分化3T 3-L 1前体 脂肪细胞在含10%FB S 的DMEM 高糖培养基培养， 在37 °C 、5% C 02培养箱中生长，根据细胞状况换液。

当细胞生长至完全融合后2 d ，用含10%FBS 、0.5
mmol/L IBMX 、1 H g/m l 胰岛素及 1 H mol/L 地塞米
松的高糖培养液诱导2 d ，再换含10%FBS 、1 yg/ml 胰岛素的高糖培养液培养2d 。

此后撤去胰岛素，换 用10%FBS 的高糖培养液直到细胞完全分化成熟。

1.2.8油红O 染色观察脂肪细胞分化脂滴聚集情 况各组3T 3-L 1细胞在分化不同天数(0、4、8 d )进 行油红0染色，细胞经10%福尔马林固定10 m im 用
PBS 洗涤3次，加人60%异丙醇与油红0燃料应用液 避光孵育20 min ,吸弃液后以自来水冲洗，在倒置显 微镜下观察各组细胞脂滴形成与聚集情况。

1.3统计分析每个实验平行重复>3次，所选图表 为重复试验结果之一。

实验室数据用3次实验均值， 以(J 士O 表示，采用r 检验分析，以P C 0.05表示差 异有统计学意义。

2 结果
2.1重组质粒的鉴定两个干扰耙点的连接反应培养 皿中分别挑取3个菌落，接种到含氨苄青霉素的LB 配 养板上。

以摇菌后菌液为模板，U 6、sP 6为引物进行普
2
o 8 6
4.2C
1.1.0.0.0.0.A QS v d
d
PPARy
々-action
空白对照阴性对照靶点1靶点2图3 P P A R y稳定干扰3T3-L1细胞株蛋白质表达水平
空白对照
阴性对照
靶点1
靶点2
图4油红染色各组细胞分化过程中脂滴的形成（X200)
3讨论
PPA R y主要负责调节脂肪细胞基因表达及胰岛 素细胞间的信号转导，从而参与调控脂肪细胞分化和 糖脂代谢，在肥胖的发生、发展过程中起重要作用「56]。

PPA R y在脂肪组织中高表达，并调节脂肪细 胞标志基因的表达、脂质贮存与代谢，是维持内环境 糖和脂质稳定的重要调节因子[78]。

有研究发现，PP A R y的表达水平随着前体脂肪细胞的分化而递增[9]。

肥胖是机体脂肪细胞增生肥大和脂肪组织增 长的直接结果，与脂肪细胞分化都直接相关[1°]。

肥胖 已成为危害人类健康的公共卫生问题，也是很多疾病 如糖尿病、高血压、心脑血管疾病甚至癌症的独立危 险因素。

因此，对脂肪细胞分化的作用机制进行研究 十分必要。

RNAi技术广泛用于基因功能研究、基因表达调 控机制研究等领域，该技术使得特定细胞中的目标基 因在m RNA水平上降解，从而导致表达沉默，相当于 暂时“敲除”了目标基因[1112]，通过研究目标基因缺失 情况下细胞发生的变化，得以研究目标基因在细胞中 的功能[13]。

本课题组应用R N A i技术，以PPA R y基 因为靶基因，体外合成编码shR N A的D N A序列，并 将其插人到PLKO. 1-G F P载体中，用慢病毒载体感 染小鼠3T3-L1前体脂肪细胞。

该质粒带有绿色荧光蛋白（EGFP)，荧光显微镜下观察转染效率较高。

经 荧光定量P C R和W estern检测表明特异性序列转染 组细胞PPA Ry基因均受到抑制，并且初步鉴定出靶 点1为有效耙点。

油红（）染色初步验证干扰PPARy 基因可有效抑制前体脂肪细胞分化过程中脂滴形成，以靶点1干扰效果尤为显著。

为后续研究PPA R y基 因对3T3-L1前体脂肪细胞分化的作用机制奠定了 基础。

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收稿日期：
2021-02-01编辑:彭海燕。