病理实验流程

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抗原修复注意事项及质量控制：
（2）煮沸热修复：电炉或者水浴锅加热0.01mol/L枸橼酸
钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织切片加热 10~15min； （3）微波热修复：在微波炉里加热0.01mol/L枸橼酸钠缓 冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织切片放入，断电，间隔 5~10min，反复1～2次； （4）酶消化方法： 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。 胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时 间约为5~30 min；胃蛋白酶消化37℃时间为30 min。
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组织的处理（机器操作）：
包括固定、脱水、透明、浸蜡和包埋，是制作优 质切片的关键，一旦组织处理有欠缺，往往导致 无法挽回的后果。
（1）制片过程按操作流程进行。 （2）包埋用石蜡必须过滤。 （3）试剂必须按要求及时更换。
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切片：
• 切片是制片技术中非常重要的环节。影响切片质量的因素
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特殊检查需要：
当某些特殊检查需要保持组织的抗原性或酶的活性不 被破坏时、或某些细胞成分在常规染色时无法显示时，也 需采用冷冻切片技术。例如: 确定细胞内脂肪作特殊染色时，需要作冷冻切片； 肾穿刺活检的荧光标记； 酶组织化学或某些特殊抗原的免疫组化检测等，也需要作 冷冻切片。
显示胶原纤维染色（VG及Masson）， 显示网状纤维染色（氢氧化银氨液浸染法）， 显示抗酸杆菌染色（苯酚碱性品红法）， 显示真菌和糖原染色（PAS）。
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三 、 相关技术简介
5.免疫组织化学染色技术
应用抗原与抗体的特异性反应原理，在石蜡切片组织、 冷冻切片组织、细胞涂片及细胞培养爬片上进行检测抗 原或抗体的特异性定位的方法，称为免疫组织化学法， 即用免疫学的方法进行组织化学检测。 适用于蛋白水平上组织的抗原或抗体检测。
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染色结果判断：
其次，要分析阳性染色的部位（细胞的微解剖部位）是否正确，如：
淋巴细胞的标志（CD20、CD43、CD5、CD45RB、CD30等）应为膜阳 性，若胞浆弥漫阳性或细胞核阳性则为假阳性； 抗体染色应为核阳性（如ER、PR、TdT、CyclinD1等），若胞浆或 胞膜阳性也为假阳性； 抗体可表现为二种阳性反应类型（如S100、ALK可为核阳性也可伴 有胞浆阳性；CD3O、CD15即可表现为细胞膜阳性，也可表现为核旁高 尔基区阳性）。
磷酸酶、酯酶、氧化酶-丙酮；
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固定液的选择： 皮下肥大细胞固定-AF液(95%乙醇90ml、甲醛液10ml）； 电镜观察标本-2.5-4%戊二醛--保存蛋白质和核酸；
（0.2mol/LPB50ml+25%GA12ml+双蒸水38ml-3%100ml）
-0.1%四氧化锇--保存脂类。
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染色结果判断：
免疫组化染色最终是否能得到正确的结论，关键还要看对染色结 果如何评价。同一种染色结果不同的病理医生可能有不同的解释，得 出不同的、甚至是截然相反的结论，导致不同的病理诊断。 首先，评价染色反应是否成功。最好比较同一张切片中存在的正常组 织，即所谓的内阳性对照，若全部细胞阴性则表明假阴性。如： CK染色时查看周围或肿瘤中残余的正常上皮是否阳性； SMA、CD34染色时查看肿瘤中血管阳性的表达； ER染色时查看正常乳腺腺泡的细胞核是否阳性； 淋巴瘤中反应的或残余淋巴组织的免疫反应
（1）申请：提前一天向病理科提出书面申请； （2）标本处理：技术员接收标本后应于15~20min内制成
切片交病理医师阅片。切片应立即贴上有编号的标签。同 一组织可视诊断需要切2~3张空白片备用；已冷冻的组织 应保留于切片机的“冷冻头”上，待诊断确立后再取下； （3）诊断一经确定，标本应立即固定。冷冻取材后剩余 的标本称“冷剩”(留作染色）。申请单上必须注明编号， 放置“冷剩”标本的容器应标明患者姓名及编号，以便查 对；
免疫组织化学法原理 Immunohistochemistry (IHC)
二抗结合并激活底物反应显色 一抗结合于受体
广西医科大学
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免疫组化操作规程：
免疫组化染色方法种类繁多，但所需仪器设备简单 （18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉、水浴锅等）； 所需的试剂一般试剂公司都有出售。这里仅介绍酶标抗生 物素蛋白链菌素-生物素（lablled strptavidin biotin ,LSAB或S-P法）的操作过程。
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抗原修复注意事项及质量控制：
（1）高压热修复：在沸水中加入EDTA（pH8.0）或
0.01mol/L枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压 锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓 慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5min，然后将盖子锁定， 小阀门将会升起来。10min后，去除热源，置入凉水中， 当小阀门沉下去后打开盖子。 适用于较难检测抗原或核抗原的抗原修复；
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病理学
病理实验室工作流程、 相关技术简介
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一 、 工作流程
工作流程
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二 、 工作制度
标本接收与清点制度 制片 读片 资料管理制度 仪器设备维修和保养制度
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标本接收与清点制度
接收-核对-签收-编号-取材登记记录-扫描-录入
（ 37-40%原液低于15度久置变甲酸。通常取原液10ml加 水90ml配成10%福尔马林液，实际上只有3.7-4%的甲醛浓 度。免疫组化、原位杂交、FISH、突变、PCR效果好)；
糖原、尿酸结晶-80～95%乙醇； 脂肪、睾丸、皮肤-Bouin液（1.22%饱和苦味酸水溶液
75ml、甲醛液25ml、冰醋酸5ml）；
直接涂片—巴氏染色（核、完全角化、成熟鳞状上皮、
代谢活跃细胞）--95%乙醇。
脱落细胞或穿刺细胞—TCT、DNA检测。
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三 、 相关技术简介
4.特殊染色技术
根据化学反应原理，在组织切片上滴加或将组织浸入 特定的化学试剂以显示组织内的某些化学成分称为组织 化学，也称特殊染色。现介绍几种常见特殊染色：
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注意事项： 标本均需用固定液固定； 大标本按自然状态切开固定，10倍体积的固定液； 取材后立即投入固定液固定，72小时内制片最佳； 取材大小：长2厘米，宽1.5厘米，厚3毫米；
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固定液的选择： 无特殊要求-用10%中性福尔马林（甲醛）溶液固定。
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染色结果判断：
当然，有不少染色或病例缺乏内阳性对照，若对染色反应有疑问只 能选用另外的阳性对照片核实。若内（或外）阳性对照组织免疫反应 阴性，瘤组织阳性则表明假阳性；瘤组织阴性则表明假阴性。只有阳 性对照染色阳性瘤组织反应才属真实。 是否有非特异反应，如CK染色、淋巴细胞标志染色时看纤维组织、 肌组织等是否阳性，Desmin染色时看周围上皮组织、炎细胞等是否阳 性。特别要注意内源性生物素造成的非特异染色（如在肝、肾及富含 线粒体的细胞等），常常表现为非特异的胞浆阳性。 总之，只有阳性对照染色阳性，阴性对照组织又基本阴性，这样 的免疫组化染色结果才可信。
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免疫组化操作规程：
1．将已制作好的组织切片进行脱蜡和水化（详见H.E染
色），冷冻切片和细胞涂片不用脱蜡； 2.PBS洗2次各5 min； 3.3%双氧水阻断10 min；（新配） 4.PBS洗2次各5 min； 5.抗原修复（方法见后，有些抗体无需修复）； 6.PBS洗2次各5 min； 7.滴加Ⅰ抗孵育1 h(37℃)； 8.PBS洗3次各5min； 9.滴加Ⅱ抗孵育15～30 min；
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资料管理制度
玻片-蜡块-申请单-报告单-登记本
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三 、 相关技术简介
1.常规H.E染色制片技术
即常规石蜡包埋切片技术，将所研究的组 织用固定液固定，再经过水洗、梯度乙醇脱 水、二甲苯或TO透明剂透明、浸蜡等处理， 然后用石蜡包埋剂支持组织进行切片、苏木 素-伊红（H.E）染色的技术。 适用于没有特殊固定要求的一切组织；所 获得的组织切片还可用于多种染色。
很多; • 组织块固定、脱水、透明和浸蜡的质量直接影响切片的质 量； • 优质的切片机是制备优质切片的重要前提； • 对技术人员的技能要求也很高，即使是同一蜡块，使用同 一台切片机和同一切片刀，不同的操作者也会切出不同质 量的片子。
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切片： (1)切片刀必须锋利，切片过程中用力均匀；切片
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染色结果判断：
再者，一定要结合HE染色切片确定免疫反应阳性的组织或细胞是否为
肿瘤或有意义的组织细胞。如果肿瘤成分较多，与周围间质界限清楚 时容易确定阳性反应，但若肿瘤成分较少，弥散存在，可能会将周围 反应性成分或残余组织的阳性反应误认为肿瘤阳性，导致错误的诊断。 如： 伴有大量淋巴细胞浸润的未分化癌（未分化鼻咽癌）； 富于T细胞的大B细胞淋巴瘤，瘤组织中残余的横纹肌，脂肪组织； 有的细胞（肥大细胞）可对多种抗体表达阳性反应，应注意区别。
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冷冻切片检查的工作程序
（4）冷冻切片后留下的组织称“冷残”。诊断明确后，
应立即置“冷残”于组织盒中，与“冷剩”组织放在同一 个固定容器内，作常规制片，以备作对照之用； （5）消毒处理切片机！！！
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三 、 相关技术简介
3.细胞学制片技术
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局限：
病灶或组织过小(一般小于0.2cm)和含水量较多的脑组织标
本。此类标本因取材破碎、量少，常影响冷冻制片质量。 已知传染性疾病(例如结核病、AIDS、病毒性肝炎)标本。 此类标本一般不宜作冷冻切片检查，应待组织固定后再行 常规制片处理。
Hale Waihona Puke Pathology冷冻切片检查的工作程序
厚度以4µm为宜。切片必须完整，无污染、皱褶和 刀痕。 (2)组织片贴附应在除去标签位置后居玻片的中间， 各块组织的方向应一致。 (3)小活检组织须做间断连续切片。
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染色封片：
(1)烤片温度应在60~62℃左右，不得高于65℃，时间不能
少于20min。 (2)染色试剂必须根据切片染色质量按要求及时更换。 (3)切片封固前必须经乙醇充分脱水、二甲苯透明，湿封。 不得用温箱烤干或用电吹风吹干后封片。 (4)盖玻片使用前必须清洗(真空包装除外)。 (5)封片时不应有气泡，不得有树胶外溢。
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基本原理：
利用已知的特异性抗体(或抗原)检测组织或细胞中未知 的抗原(或抗体)。但是因为抗原抗体结合后形成的“免疫 复合物”在一般光学条件下无法观察，因此先在已知抗体 (或抗原)上连接一些可以用光镜观察到的显示剂，经过特 定化学反应，最后“免疫复合物”显示不同颜色。在普通 显微镜、荧光显微镜下能通过观察组织细胞特定部位颜色 变化来找出疾病的特征性表现。
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其他：
标签必须贴于玻片左侧，必须确保载玻片上的病理编号与
相关组织蜡块的病理号完全一致。编号字迹必须清楚、整 齐，且不易褪色，有条件者尽量采用打印标签。
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三 、 相关技术简介
2.冷冻切片技术
是采用冷冻的方法将未经固定处理的组织切 成薄片，然后快速染色制片以进行病理诊断。
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免疫组化操作规程：
10.PBS洗3次各5 min； 11.加HRP标记的抗生物素蛋白链菌素孵育15～30 min； 12.PBS洗3次各5 min； 13.DAB显色1～5分钟，在显微镜下掌握染色程度； 14.PBS冲洗10 min； 15.苏木精复染1～2 min，盐酸酒精分化； 16.自来水洗10 min； 17.脱水、透明、封片、镜检。
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染色结果判断：
随着对免疫反应靶分子部位的更深入了解，人们近年来还提出免 疫反应的形态也是重要的参考依据，如： 嗜铬蛋白A、细胞毒标志（粒酶B，穿孔素，TIA1）等阳性反应在 胞浆内应呈颗粒状； CD79a等为胞浆弥漫阳性，细胞角蛋白染色阳性应为胞浆细丝状。 若反应类型不符可能也要怀疑为假阳性。但要精确观察到阳性反 应的细微类型表现必须切片薄，并采用高分辨率的显色系统。。