南农生物分离工程生物分离3 (2)

要将盐析分布曲线重叠的两个蛋白质分级沉淀： 稀释后可能分级。
温度T
• 在低离子强度溶液或纯水
中蛋白质的溶解度大多数 还是随温度升高而增加。
• 高盐常相反 • 一般情况下，可在室温下
进行。
• 但对于某些对温度敏感的
酶 ， 要 求 在 0℃ ～ 4℃ 下 操作，以避免活力丧失。
溶液pH
pH 影 响 Cohnx 方 程 中 的 值 。
• 一般蛋白质0℃，有机溶剂-10℃加入。但
淀粉酶10-15℃。
有机溶剂浓度
同盐析一样，随着有 机溶剂浓度的上升， 蛋白质溶解度也呈指 数规律下降。
如血纤维蛋白原的溶解度在乙醇浓度为 8%时达到最大，而当乙醇浓度为40%时 达到最小。
pH值：
通常是选在等电点附近，也考虑样品稳定性。 很多酶pI在pH4-5，比稳定的pH低。
降低水的介电常数，使蛋白质分子水化程度降
低，促进了蛋白质分子的聚集沉淀。
是极性有机溶剂与蛋白质争夺水化水，而使蛋
白质分子沉淀。
优点：
• 分辨能力比盐析法高，即一种蛋白质或其
他溶质只在一个比较窄的有机溶剂浓度范围 内沉淀。
• 从沉淀的蛋白质中除去有机溶剂很方便，可
透析，而且有机溶剂本身可部分地作为蛋白 质的杀菌剂。
聚乙二醇
【HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH (n ＞ 4)】 ( Polyethylene Glycol 简写为 PEG )。 亲水性，溶于水和许多有机溶剂，对热稳 定，有广泛的分子量。 在生物大分子制备中，用的较多的是分子 量为6000～20000的 PEG。
A: 0 ℃ 0.27 20 ℃ 0.29 P1、P2:初始、最终饱和度%
饱和溶液体积 Va=Vo(P2-P1)/(1-P2)
Vo：蛋白溶液原始体积L
分段盐析
不同的蛋白质分子，由于其分子表面的极 性基团的种类、数目以及排布的不同，其水 化层厚度不同，故盐析所需要的盐浓度也不 一样，因此调节盐浓度，可以使不同的蛋白 质分别沉淀。如：
等电点沉淀法
• 利用具有不同等电点的两性电解质，在达到
电中性时溶解度最低，易发生沉淀，从而实现分 离的方法。氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两性 电解质，可以利用此法进行初步的沉淀分离。
• 由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且
仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出， 因此，单独使用此法分辨率较低，常与盐 析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起 配合使用。
和酶的分离纯化。
• 有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、
核酸以及生物小分子的分离纯化。
• 选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：
多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变 性的杂蛋白。
• 等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他
两性物质的沉淀，但此法单独应用较少， 多与其他方法结合使用。
• 有机聚合物沉淀： 是发展较快的一种新
沉 淀 脱水作用
脱水作用
脱水作用
作 用 示
++ +
+
碱
+
意
+
图
++
－－
酸－
－
－
－－ －
带正电荷的蛋白质 不稳定的蛋白质颗粒
带负电荷的蛋白质
蛋白质的聚沉
优点
A、设备简单、成本低、放大容易，产物浓度越高 沉淀越有利，收率越高；
B、原料液体积很快地减小10~50倍，从而简化生 产工艺、降低生产费用；
C、对许多生物活性物质具有稳定作用 D、操作简单、安全。
缺点：
A、耗用大量溶剂，试剂易燃，有毒
B、对某些具有生物活性的大分子容易引起变 性失活，操作需在低温下进行。
C、收率也比盐析法低；
有机溶剂的种类：
乙醇、丙酮、甲醇和乙腈，常用于低盐浓 度下沉淀pro。
有机溶剂浓度的计算
• 可用溶液体积的倍数：如加入一倍、二倍、
三倍原溶液体积的有机溶剂，来进行有机 溶剂沉淀。
• 溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度。
由于酶和各种蛋白质通常是在低温下稳定，因而盐 析操作也常在低温下（0～4℃）进行。
几种盐在不同温度下的溶解度（克/100毫升水）
0℃ 20℃
80℃ 100 ℃
（NH4)2SO4 Na2SO4
NaH2PO4
70.6 4.9 1.6
75.4 18.9
7.8
样品浓度：
避免使用很稀的浓度。 高浓度样品，可以节省有机溶剂，减少 变性的危险，但杂蛋白的共沉淀作用大。 通常使用5mg/mL～20mg/mL的蛋白 质初浓度为宜。
无机盐的离子强度
• 通常盐浓度以不超过5％为宜，乙醇的量
以不超过原蛋白质水溶液的２倍体积为 宜。
• 少量的中性盐对蛋白质变性有良好的保
护作用，但盐浓度过高会增加蛋白质在 水中的溶解度，降低了沉淀效果。
• 通常是在低浓度缓冲液中沉淀蛋白质。
• 金属离子
Ca2+ 、Zn2+等与蛋白形成复合物，降低溶 解度。
常用醋酸锌、硫酸锌。
• 沉淀所得的固体样品，如果不是立即溶解进行下
一步的分离，则应尽可能抽干沉淀，减少其中有
机溶剂的含量，可以透析脱有机溶剂，以免影响 样品的生物活性。
水解后溶液pH降低，在高 pH下产氨，腐蚀 性强，有异味，终产物必须除尽。
• 次常用Na2SO4
缺点：在40℃以下溶解度较低，主要用于热 稳定蛋白。
盐析的操作方法
• 最常用的是固体硫酸铵加入法。将其研成细粉，
在搅拌下缓慢均匀少量多次地加入，避免局部硫 酸铵浓度过大而造成蛋白质沉淀。
• 盐析后要在冰浴中放置一段时间，待沉淀完全后
95.3 43.3 93.8
103 42.2 101
• 分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵
盐析，一步就可以除去75％的杂蛋白， 纯度提高了四倍。
• 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的
作用。有的酶或蛋白质用2～3mol/L浓
度 的（NH4)2SO4保存可达数年之久。
• 价格便宜。
• (NH4)2SO4缺点：
使那些对表面活性剂和有机溶剂敏感 性强的杂蛋白变性沉淀，通常在冰浴 中进行。
• 选择性酸碱变性
利 用 对 pH 值 的 稳 定 性 不 同 而 使 杂 蛋 白变性沉淀。通常是在分离纯化流程 中附带进行的分离纯化步骤。
有机聚合物沉淀法
• 有机聚合物是六十年代发展起来的一类重要
的沉淀剂，最早应用于提纯免疫球蛋白和沉淀一 些细菌和病毒。近年来广泛用于核酸和酶的纯化。 如聚乙二醇（PEG）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP） 和葡聚糖等。
(NH4)2SO4
血清
球蛋白
50%饱和度
析出
饱和
清蛋白
析出
盐析曲线的制作
• 如果要分离一种新的蛋白质和酶，没有文献数据可
以借鉴，则应先确定沉淀该物质的硫酸铵饱和度。 • 蛋白质量(mg)或酶活力
10 20 30 40 50 60 素
无机盐种类
In 1888，Hofmeister对一系 列盐沉淀蛋白质的能力进 行了测定研究。
阴离子排序为：柠檬酸根3- > 酒 石 酸 根 3- >F- > IO-3 > H2PO-4 > SO-4 > CH3COO> Cl- > ClO-3 > Br- > NO-3 > ClO-4 > I- > CNS-;
对 阳 离 子 排 序 为 ： Th4+ > Al3+ > H+ > Ba2+ > Sr2+ > Ca2+ > Cs+ > Rb+ > NH4+ > K+ > Na+ > Li+
脱盐才能进一步精提纯。脱盐常用透析 法。
透析是将含有小分子杂质 的蛋白质溶液装在半透膜（ 玻璃纸、火绵纸等）制的透 析袋里放在蒸馏水中进行， 可不断更换蒸馏水，直至杂 质被除去。
透析袋 蛋白质溶液
蒸馏水
有机溶剂沉淀法
• 有机溶剂对于许多蛋白质（酶）、核酸、多
糖和小分子生化物质都能发生沉淀作用，是较 早使用的沉淀方法之一。其原理主要是：
• 在等电点处溶解度小，
pH值常选在该蛋白质 的等电点附近。
如从酵母中提取细胞色素C：
离子交换后，洗脱液加85%(NH4)2SO4 ， pH5.0-5.5，产生杂蛋白沉淀，除杂蛋白， 上清液调pH4.8-5.1，产生细胞色素C沉淀。
盐析沉淀的蛋白质仍保持天然构象，即 仍有活性。
• 蛋白质用盐析方法沉淀分离后，还需要
再离心与过滤。
• 在低浓度硫酸铵中盐析可采用离心分离，高浓
度硫酸铵常用过滤方法。
加固体（工业）、饱和溶液 （小规模）
• 各种饱和度下需加固体硫酸铵的量可查出。
25 ℃饱和浓度4.1mol/l(767g/l) 100%饱和度
X=G(P2-P1)/(1-AP2) X:g/L G: 0 ℃ 515 20 ℃ 513
影响因素及控制
温度：
多数生物大分子如蛋白质、酶和核酸在有 机溶剂中对温度特别敏感，温度稍高就会 引起变性，且有机溶剂与水混合时产生放 热反应，因此必须预冷，操作要在冰盐浴 中进行，加入有机溶剂时必须缓慢且不断 搅拌以免局部过浓。
• 一般规律是温度越低，得到的蛋白质活性
越高。在乙醇沉淀人血浆蛋白时，温度控 制在-10C下进行。
缺点：
A、沉淀物可聚集有多种物质，如大量盐类和溶剂， 所以沉淀法所产品纯度通常都比结晶法低；
B、过滤较困难
盐析法
Cohnx经验公式
式中, S为蛋白质的溶解度(g/L)；I