人参、西洋参和甘草组织培养研究

人参人参、、西洋参和甘草组织西洋参和甘草组织培养研究培养研究
Studies on the tissue culture in Panax
ginseng C. A. Meyer, Panax quinquefolium
L. and Glycyrrhiza uralensis Fisch.
一级学科：化学工程与技术
学科专业：应用化学
研 究 生：王娟
指导教师：高文远 教授
天津大学药物科学与技术学院
二零一二年六月
独创性声明
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学位论文作者签名：导师签名：
签字日期：年月日签字日期：年月日
摘要
人参（Panax ginseng C. A. Meyer）、西洋参（Panax quinquefolium L.）和甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）属于大宗类药材，应用十分广泛。

本文建立了人参不定根、西洋参细胞和甘草细胞培养体系，并进行了反应器培养研究。

本文以5年生人参根为外植体诱导出愈伤组织，在附加IBA 5 mg·L-1的MS 培养基中，由愈伤组织诱导得到人参不定根。

采用5 L近球型鼓泡式反应器培养人参不定根40天后，生长速率达到50倍。

总皂苷含量在培养第30天达到最大值。

利用LC-MS鉴定了人参不定根中8种人参皂苷单体（Rg1、Re、Ro、Malonyl-Rb1、Rb1、Rc、Rb2和Rd）；人参不定根培养体系生长速度较快，皂苷合成能力也有明显优势。

利用诱导子10 mg/L MJ培养人参不定根24 h后，人参皂苷含量显著提高，其中以二醇型皂苷尤为显著，这一结果与SE, DS, P450基因表达密切相关。

抗氧化活性研究表明：人参不定根中皂苷和多糖的DPPH抑制率均高于栽培人参。

不定根中皂苷含量为60 mg·L-1时，DPPH抑制率为96.03%。

以5年生栽培西洋参为外植体诱导出愈伤组织，将愈伤组织加入到附加 2 mg·L-1 2,4-D，0.25 mg·L-1 KT的MS培养基中诱导得到悬浮细胞。

5 L反应器培养中，西洋参细胞的生长和活性成分含量基本在第21天达到最大值，这一过程与营养成分消耗相关。

添加混合诱导子后（100 mg·L-1 LH和2 mg·L-1 MJ），细胞的生物量和多糖含量没有显著变化，而皂苷含量要高于添加单一诱导子的处理组。

第16天补加30 g·L-1蔗糖后，细胞干重生长率以及多糖含量均高于对照组，多糖产率在第21天达到最大值（1.608 g/L），为对照组的1.96倍。

西洋参两步培养法获得了较高的皂苷产率（31.52 mg·L-1）和多糖产率（1.72 g·L-1），分别是对照组的4.34倍和2.1倍。

西洋参细胞中鉴定出了4种成分，分别为Rg1、Re、Rf和Rb1。

较高的多糖含量是西洋参悬浮细胞的显著优势，但皂苷含量较低。

抗氧化活性研究表明：西洋参细胞中皂苷的DPPH抑制率（55.72%）高于栽培西洋参，栽培西洋参和细胞中多糖的DPPH抑制率均较低。

以甘草下胚轴为外植体诱导出愈伤组织，将愈伤组织加入到附加1.0 mg·L-1 2,4-D, 1.0 mg·L-1 NAA, 0.2 mg·L-1 6-BA的MS培养基中诱导得到悬浮细胞。

采用5 L近球型鼓泡式反应器培养甘草细胞20天后，干重生长率达到最大值。

三萜皂苷和黄酮分别在培养第10天和15天达到最大值。

采用10 L近球型鼓泡反应器培养18天后，甘草悬浮细胞生长率为10.86倍。

甘草细胞中鉴定出了5种成分，分别为甘草苷、甘草皂苷B、甘草皂苷J2、甘草酸和甘草皂苷B2；甘草细胞中
三萜类成分较少且甘草酸含量较低，甘草黄酮的成分和含量与栽培甘草接近。

甘草细胞中多糖含量为11.7%，高于栽培甘草。

抗氧化活性研究表明：当黄酮浓度为500 mg·L -1时，栽培甘草和甘草细胞的DPPH 抑制率分别为93.98%和100%。

两种材料中甘草多糖的DPPH 抑制率则较低。

以上研究为工业化生产人参、西洋参和甘草的活性成分奠定了基础。

关键词关键词：：人参，西洋参，甘草，不定根，细胞
ABSTRACT
Panax ginseng C. A. Meyer, Panax quinquefolium L. and Glycyrrhiza uralensis Fisch. are widely used herb. In this study, adventitious root of P. ginseng,cells of P. quinquefolium and G. uralensis have been established. We also conducted studies on bioreactor culture.
Callus of ginseng was induced by roots of P. ginseng (5-year-old). Adventitious roots were initiated from callus which were inoculated onto MS solid media containing 5.0 mg·L-1IBA. Growth rate of 50-fold in 5 L balloon-type bubble bioreactor (BTBB) was obtained after 40 days of inoculation. The maximum total saponin was achieved on day 30. Rg1, Re, Ro, Malonyl-Rb1, Rb1, Rc, Rb2 and Rd were identified from ginseng adventitious root. Ginseng adventitious root culture grew faster and had a greater capability of ginsenoside production. With 24 h of 10 mg·L-1MJ elicitation, level of total saponins in ginseng adventitious root increased much higher than that observed in the control, especially Rb group, which were related to the expression of SE, DS and P450. DPPH inhibition of ginsenoside and polysaccharide were higher in adventitious roots than in native roots, with 60 mg L-1 ginsenoside of ginseng adventitious roots, the DPPH inhibition was 96.03%.
Callus of P. quinquefolium was induced by roots of P. quinquefolium (5-year-old). Cells were initiated from callus which were inoculated onto MS solid media containing 2 mg·L-1 2,4-D, 0.25 mg·L-1KT. In a bioreactor, the dry cell weight, the contents of ginsenosides and polysaccharide reached the maximum peak simultaneously on about 21 days and the results showed that cell growth and metabolites synthesis related to nutrients consumption. LH at 100 mg L-1 with methyl jasmonate (MJ) at 2 mg L-1 synergistically stimulated ginsenoside accumulation in P. quinquefolium cells compared with 100 mg L-1 LH. Using a fed-batch cultivation strategy, polysaccharide production was enhanced to 1.608 g L−1, which was 1.96-fold greater than with batch cultivation. Two-stage cultivation caused a significant increase in total saponins yield (31.52 mg·L-1) and polysaccharide yield (1.72 g·L-1) cell cultures. This value was increased by 4.34-fold and 2.1-fold compared to the batch cultivation, respectively. Rg1, Re, Rf and Rb1 were identified from P. quinquefolium cells. The higher polysaccharide content is an obvious advantage of P. quinquefolium
cells. However, the ginsenoside contents in the cell cultures are still much lower than that in field cultivated. DPPH inhibition of ginsenoside in P. quinquefolium cells was higher than that in native root. DPPH inhibition of polysaccharide both in native P. quinquefolium and cells are lower.
Callus of G. uralensis was induced by hypocotyls of G. uralensis. Cells were initiated from callus which were inoculated onto MS solid media containing 1.0 mg·L-12,4-D, 1.0 mg·L-1NAA, 0.2 mg·L-16-BA. The maximum dry weight, triterpenoids and flavonoids were achieved on day 20, 10 and 15, respectively in 10 L BTBB. Maximum growth rate of 10.86-fold in 10 L BTBB were obtained after 18 days of inoculation. Liquiritin, licorice glycoside B, licorice saponin J2, glycyrrhizic acid and licorice saponin B2 were identified from G. uralensis cells. Triterpenoids in G. uralensis cells are much less than that in native licorice. However, flavonoids in cells are similar to the native licorice. Content of polysaccharide in cells (11.7%) is higher than that in native. About 93.98% and 100% DPPH inhibition occurred with 500 mg L-1 flavonoids of native licorice and cells. DPPH inhibition of polysaccharide in native licorice and cells are lower.
These results provide a theoretical reference for an efficient production of active metabolites of above three kinds of plants.
KEY WORDS：Panax ginseng C. A. Meyer, Panax quinquefolium L., Glycyrrhiza uralensis Fisch., adventitious root, cell
目 录
第一章文献综述 (1)
1.1药用植物组织培养研究进展 (1)
1.1.1植物细胞培养生产次生代谢产物 (2)
1.1.2植物组织和器官培养生产次生代谢产物 (3)
1.1.3植物毛状根培养生产次生代谢产物 (4)
1.1.4药用植物生物转化研究 (6)
1.1.5药用植物的快速繁殖 (7)
1.2人参皂苷生物合成途经及关键酶研究 (8)
1.2.1人参皂苷生物合成途径 (8)
1.2.2人参皂苷生物合成途径中关键酶的基因调控 (10)
1.3人参组织培养研究进展 (13)
1.3.1人参愈伤组织培养 (13)
1.3.2人参细胞培养 (13)
1.3.3人参再生植株 (13)
1.3.4人参毛状根培养 (14)
1.3.5人参不定根培养 (14)
1.4西洋参组织培养研究 (15)
1.4.1愈伤组织的诱导与培养 (15)
1.4.2西洋参试管苗再生 (16)
1.4.3西洋参细胞悬浮培养 (17)
1.4.4西洋参冠瘿组织培养 (18)
1.4.5西洋参毛状根培养 (19)
1.4.6西洋参不定根培养 (19)
1.5甘草组织培养研究进展 (19)
1.5.1甘草愈伤组织培养 (20)
1.5.2甘草快繁苗培养 (20)
1.5.3甘草细胞培养 (21)
1.5.4甘草毛状根培养 (21)
1.6立题依据 (22)
第二章人参不定根反应器培养 (23)
2.1实验材料 (23)
2.2实验方法 (23)
2.2.1人参不定根培养体系的建立 (23)
2.2.2人参不定根反应器培养中人参皂苷，氧气消耗速率（SOUR）以及
电导率的动态变化 (24)
2.2.3人参不定根逐级放大培养 (24)
2.2.4人参不定根培养体系的综合评价 (25)
2.2.5诱导子茉莉酸甲酯对人参不定根皂苷合成的影响 (25)
2.2.6人参不定根中皂苷和多糖对DPPH自由基的清除作用 (25)
2.3分析方法 (26)
2.3.1生物量及干重生长率的测定 (26)
2.3.2人参皂苷含量测定 (26)
2.3.3多糖含量测定 (27)
2.3.4 SE, DS, P450基因表达 (28)
2.3.5 DPPH法测定抗氧化活性 (30)
2.3.6氧气消耗速率测定 (31)
2.4结果与分析 (31)
2.4.1人参不定根反应器培养中人参皂苷，SOUR和电导率的变化 (31)
2.4.2人参不定根逐级放大培养 (31)
2.4.3人参不定根培养体系的综合评价 (34)
2.4.4诱导子茉莉酸甲酯对人参不定根皂苷合成的影响 (43)
2.4.5人参不定根中皂苷和多糖对DPPH自由基的清除作用 (45)
2.5讨论 (46)
2.5.1人参不定根反应器培养中人参皂苷，SOUR和电导率的变化 (46)
2.5.2人参不定根逐级放大培养 (47)
2.5.3人参不定根培养体系的综合评价 (47)
2.5.4诱导子茉莉酸甲酯对人参不定根皂苷合成的影响 (47)
2.5.5人参不定根中皂苷和多糖对DPPH自由基的清除作用 (48)
2.6小结 (48)
第三章西洋参悬浮细胞反应器培养 (49)
3.1实验材料 (49)
3.2实验方法 (49)
3.2.1西洋参愈伤组织的诱导和继代培养 (49)
3.2.2西洋参悬浮细胞培养 (49)
3.2.3诱导子对西洋参细胞生长和活性成分含量的影响 (49)
3.2.4西洋参悬浮细胞反应器放大培养 (50)
3.2.5西洋参药材与悬浮细胞成分分析 (51)
3.2.6西洋参细胞中皂苷和多糖对DPPH自由基的清除作用 (51)
3.3分析方法 (51)
3.3.1蔗糖的测定 (51)
3.3.2葡萄糖的测定 (52)
3.3.3果糖的测定 (52)
3.3.4硝态氮(NO3--N)的测定 (52)
3.3.5铵态氮(NH4+-N)的测定 (52)
3.3.6 PO43--P的测定 (53)
3.3.7生物量及干重生长率的测定 (55)
3.3.8人参皂苷含量测定 (55)
3.3.9多糖含量测定 (55)
3.3.10 DPPH法测定抗氧化活性 (56)
3.4结果与分析 (56)
3.4.1诱导子对西洋参细胞生长和活性成分含量的影响 (56)
3.4.2西洋参悬浮细胞反应器放大培养 (58)
3.4.3西洋参药材与悬浮细胞成分分析 (66)
3.4.4西洋参细胞中皂苷和多糖对DPPH自由基的清除作用 (71)
3.5讨论 (72)
3.5.1诱导子对西洋参细胞生长和活性成分含量的影响 (72)
3.5.2西洋参悬浮细胞反应器放大培养 (72)
3.5.3西洋参药材与悬浮细胞成分分析 (74)
3.5.4西洋参细胞中皂苷和多糖对DPPH自由基的清除作用 (75)
3.6小结 (75)
第四章甘草悬浮细胞反应器培养 (76)
4.1实验材料 (76)
4.2实验方法 (76)
4.2.1甘草愈伤组织诱导 (76)
4.2.2甘草悬浮细胞系建立 (76)
4.2.3甘草细胞反应器培养中三萜皂苷，黄酮和SOUR的动态变化 (77)
4.2.4甘草悬浮细胞逐级放大培养 (77)
4.2.5栽培甘草与甘草细胞成分分析 (77)
4.2.6甘草黄酮和甘草多糖对DPPH自由基的清除作用 (77)
4.3分析方法 (77)
4.3.1甘草三萜皂苷和黄酮含量测定 (77)
4.3.2生物量及干重生长率的测定 (78)
4.3.3多糖含量测定 (78)
4.3.4 DPPH法测定抗氧化活性 (79)
4.3.5氧气消耗速率测定 (79)
4.4结果与分析 (79)
4.4.1甘草细胞反应器培养中三萜皂苷，黄酮和SOUR的动态变化 (79)
4.4.2甘草悬浮细胞逐级放大培养 (79)
4.4.3甘草细胞成分分析 (80)
4.4.4甘草细胞中黄酮和多糖对DPPH自由基的清除作用 (86)
4.5讨论 (87)
4.5.1甘草细胞反应器培养中三萜皂苷，黄酮和SOUR的动态变化 (87)
4.5.2甘草悬浮细胞逐级放大培养 (87)
4.5.3甘草细胞成分分析 (87)
4.5.4甘草细胞中黄酮和多糖对DPPH自由基的清除作用 (88)
4.6小结 (88)
第五章结论 (89)
参考文献 (90)
发表论文和参加科研情况说明 (103)
致谢 (105)
第一章文献综述
1.1药用植物组织培养研究进展
我国是世界上使用和出口中药材资源最多的国家，除野生采集以外，药用植物的大田栽培是目前提供中药材的主要途径。

但我国是世界上人均可耕地面积最少的国家之一，必然会出现中药材栽培与农作物栽培相互争地的矛盾。

此外，对于人参，红豆杉和长春花这些药用植物来说，或者生长年限长，或者有效成分含量很低，通过大田栽培很难满足这些药用植物的资源用量。

因此，土地资源有限的我国不能只寄希望于大田栽培手段来提供中药材及其活性成分，大力发展生物技术来解决中药材的资源问题对我国具有特殊而且重要的意义。

利用植物细胞和器官培养技术是名贵药物资源可持续发展的一条重要途径。

药用植物组织培养技术的应用，可以体现在以下几个方面：与大田栽培相结合，快速大量繁殖药用植物的种苗；培养药用植物的器官，部分替代野生或大田栽培的药用植物资源；通过组织培养材料直接生产活性成分；通过添加诱导子等手段，深入研究药用植物的次生代谢机理；通过饲喂底物，利用药用植物的培养物进行生物转化，生产目的化合物；通过大规模培养技术，直接开发有特色的药品，保健品和化妆品。

如韩国利用培养的人参不定根开发了系列保健品和化妆品，反应器规模达到30 t，我国利用虫草发酵开发的补益药物金水宝胶囊以及以人参细胞为主要原料的丁家宜化妆品在国内市场上都有很好的销量。

植物组织培养正以其独特的优势，潜在的巨大经济效益和社会效益成为世界各国研究的热点。

2009-2012年检索到的国际组织培养研究报道主要包括：利用细胞，器官和毛状根培养生产次生代谢产物，通过添加诱导子等手段来提高次生代谢产物含量并对次生代谢机理进行深入研究；利用组织培养体系对底物进行生物转化，生产目标化合物；药用植物快速繁殖体系的建立。

2009-2012年我国的组织培养研究内容涵盖了国际组织培养研究的各个方面，在细胞和毛状根培养生产代谢产物及其代谢机理研究方面处于国际领先水平，此外，加强了对大规模反应器培养的研究，如建立了长鞭红景天细胞7 L气升式反应器培养体系[1]；成功利用5 L鼓泡式反应器培养膜荚黄芪不定根[2]，这些研究将会更好的丰富药用植物资源，生产有益的药用活性成分，促进相关产品的研发。

以下，本文综述了药用植物组织培养的研究进展。

1.1.1植物细胞培养生产次生代谢产物
作为获取高价值次生代谢物的一种手段，植物细胞培养有着广泛的应用前景。

表1-1列举了近年通过药用植物细胞培养得到的天然产物。

药用植物细胞培养研究的大部分内容是通过高产细胞系的筛选与培养条件的优化等，以期提高次生代谢产物的产量，或者通过对次生代谢产物生物合成途径的调控来达到同样的目的，如通过添加诱导子等手段来提高次生代谢产物含量并对次生代谢机理进行深入研究。

表1-1 药用植物细胞培养生产次生代谢产物
Tab. 1-1 Production of secondary metabolites by medicinal plant cell culture
Product Plant species
Peruvoside (甲黄次苷) Thevetia peruviana (黄花夹竹桃)[3] Guggulsterone (没药甾酮) Commiphora wightii (没药)[4]
Catharanthus roseus (长春花)[5]
Total alkaloid (生物碱), Catharanthine (长春碱),
Vindoline
Taxuyunnanine C (云南紫杉烷C), taxol (紫杉醇) Taxus chinensis (中国红豆杉)[6-7]
periploca sepium (杠柳)[8]
Periplocin (杠柳毒苷),
4- methoxysalicylaldehyde (4-甲基水杨醛)
Chlorogenic acid (绿原酸) Eucommia ulmoides (杜仲)[9] Gentiopicroside (龙胆苦苷) Gentiana macrophylla (秦艽)[10-11]
Crocin (藏红花素) Crocus sativus (藏红花)[12] Campothecin (喜树碱) Campototheca acuminate (喜树)[13] Tanshinone (丹参酮) Salvia miltiorrhiza (丹参)[14]
Favonoids (黄酮) Ginkgo biloba (银杏)[15]
Atractylodin (苍术素) Atractylodes lancea (苍术)[16] Ginsenoside (人参皂苷), polysaccharide (多糖) Panax quinquefolium (西洋参)[17]
在黄花夹竹桃细胞培养的第0天，添加100 mg·L-1的MJ21天后，甲黄次苷的产率达到最大值8.93 mg·L-1[3]。

在两步培养法培养没药细胞的实验中，同时添加真菌和生长延缓剂，可以使没药甾酮含量在17天后达到最大值，其含量接近于对照组的5倍[4]。

Shukla等[5]对长春花悬浮细胞中吲哚生物碱类化合物次生代谢机理进行了研究，结果表明当添加腐霉和MJ诱导子后，总生物碱含量提高，但没有检测到vindoline。

与此同时，与吲哚生物碱类化合物生物合成相关的SGD基因表
达增强，而DAT基因则表达缺失，这一结果与总生物碱和vindoline的表达直接相关。

研究还发现，细胞分化对DAT基因的表达至关重要。

以100 μM 2, 3-二羟丙基茉莉酸(DHPJA)，20 g·L-1蔗糖和100 g·L-1XAD-7HP的原位吸附对红豆杉细胞进行联合处理，对6个基因表达水平进行了调控，使得细胞培养第30天时云南紫杉烷C (Tc)产量高达1517 mg·L-1，是对照处理的11.1倍[6]。

在喜树悬浮细胞培养的第8天添加0.5 μM终浓度的Cu2+，后在第18天添加40 μM终浓度的Cu2+，可以使喜树碱的产量在第24天达到71.9 mg·L-1，是未经处理的7.9倍[13]。

研究发现Ag+, Cd2+, YE均可以提高丹参悬浮细胞中总丹参酮含量，最高可以达到2.3 mg·g-1，是对照组的10倍[14]。

在内生菌刺激银杏细胞生产黄酮的研究中发现，脱落酸参与到黄酮的生物合成中[15]。

内生真菌诱导子还能有效提高茅苍术细胞悬浮培养体系中苍术素的产量[16]。

此外，本实验室在西洋参悬浮细胞的研究中也发现，添加混合诱导子MJ和LH后，细胞的生物量和多糖含量没有显著变化，而皂苷含量要高于添加单一诱导子的处理组[17]。

诱导子对不同植物体系的最适作用量不同，在具体的工作中应首先进行实验来确定最适添加量。

诱导子在与植物的相互作用中，能快速、高度专一地诱导特定基因的表达。

近年来，大量的研究证明诱导子可作为研究植物次生代谢信号识别及细胞内信息传递的良好实验体系。

1.1.2植物组织和器官培养生产次生代谢产物
与细胞培养相比，从某种意义上讲，组织和器官的培养对药用植物具有更加重要的意义。

众所周知，培养药用植物的最终目的是为了获取其有效成分，而药用植物的有效成分主要是次生代谢产物。

药用植物合成次生代谢产物的目的是为了其自身生理代谢的需要，而在细胞阶段，往往不需要合成次生代谢产物，但到了组织和器官阶段，合成次生代谢产物的需要就会加强。

因此，培养药用植物的组织和器官，更容易获得药用植物的次生代谢产物。

表1-2列举了近年通过植物组织和器官培养生产次生代谢产物的一些实例。

通过对培养条件的优化，可以提高培养体系中代谢产物的含量，并且某些代谢产物的含量还要超过原植株。

如在贯叶连翘再生植株不同时期活性成分变化的研究中发现，花期和果期中的黄酮类含量最高，并且含量超过栽培植株[19]。

Aslam[21]研究发现，长春花再生植株的叶片中长春碱含量高于体外培养。

利用3 L 气升式反应器培养铁皮石斛原球茎生产的多糖和生物碱含量均高于栽培苗和组培苗[25]。

在雷公藤胚状体培养合成次生代谢产物的研究中发现，雷公藤甲含量分别是栽培叶和根的1.07倍和1.44倍；生物碱含量分别是栽培叶和根的17.02倍和1.46倍[28]。

实验中还发现半夏原球茎中生物碱含量是栽培的4.5倍[29]；反应器培
养的膜荚黄芪不定根中，多糖含量超过3年生栽培植株，皂苷和黄酮均接近栽培植株水平[2]。

表1-2药用植物组织和器官培养生产次生代谢产物
Tab. 1-2 Production of secondary metabolites by medicinal plant tissue and organ culture Product Plant species Culture system
Hypericum perforatum (贯叶连翘) 不定根[18-19] Chlorogenic acid (绿原酸)
hypericin (金丝桃素)
Phenolic (酚类) Hypericum ternum 再生植株[20] Vinblastine, vinblastineand,
Catharanthus roseus 再生植株[21-22]
total alkaloid
Vinblastine Catharanthus roseus体细胞胚[23] Lanatoside C (毛花洋地黄),
Digitalis davisiana (洋地黄) 再生植株[24]
digoxin (地高辛)
Polysaccharide , alkaloid Dendrobium candidum (铁皮石斛) 原球茎[25] Polysaccharid, alkaloids Dendrobium huoshanense (霍山石斛)原球茎[26-27] Triptolide (雷公藤甲素),
Tripterygium wilfordii (雷公藤)胚状体[28]
total alkaloids
Alkaloid Pinellia ternata (半夏)原球茎[29] Ginsenosides, polysaccharide Panax ginseng (人参) 不定根[30] Favonoids Metasequoia glyptostroboides (水杉) 再生植株[31] Puerarin (葛根素) Pueraria tuberosa (葛根) 再生芽[32] Gentiopicroside Gentiana macrophylla 再生植株[33] Saikosaponins (柴胡皂苷) Bupleurum chinense (柴胡) 不定根[34] Periplocin periploca sepium 不定根[35] Gentiopicroside Gentiana cruciata L (龙胆)再生植株[36] Ginsenosides Panax quinquefolium 不定根[37]
Astragalus membranaceus (膜荚黄芪) 不定根[2] Polysaccharide, saponin,
flavonoid
1.1.3植物毛状根培养生产次生代谢产物
毛状根是整体植株或植株的某一器官、组织（包括愈伤组织）、细胞甚至原
生质体受发根农杆菌（Agrobacterium rhizagenes）的感染所产生的一种病理现象。

由于毛状根具有培养时生长迅速，且不需添加外源激素，拥有亲本植株特征的次生代谢途径，遗传稳定，起源于单细胞，处于分化状态等特点，尤其是他的稳定性和生长迅速是植株次生代谢物工业化生产所梦寐以求的，因此毛状根培养技术被认为是生产植物次生代谢物的一条有效途径。

表1-3列出了近年毛状根培养生产次生代谢产物的实例。

影响毛状根培养生产次生代谢产物的因素主要包括培养基成分和诱导子等。

表1-3 药用植物毛状根培养生产次生代谢产物
Tab. 1-3 Production of secondary metabolites by medicinal plant hairy root culture Product Plant species
Phenolic Platycodon grandiflorum (桔梗)[38]
Flavonoid Psoralea corylifolia (补骨脂)[39]
Ginsenoside Panax quinquefolium[40-41]
Tropane alkaloids (托品烷生物碱) Anisodus acutangulus (三分三)[42] Polysaccharide, acetylshikonin (乙酰紫草素) Arnebia euchroma (新疆紫草)[43-44]
Glycyrrhiza uralensis (甘草)[45-46] Glycyrrhizic acid (甘草酸), licochalcone A (甘
草查尔酮A), total flavonoid
Gentiopicroside Gentiana macrophylla[47]
Salvia miltiorrhiza[48-49]
Tanshinone, danshensu (丹参素), rosmarinic
acid (迷迭香酸), salvianolic acid B (丹酚酸B)
Catharanthine Catharanthus roseus[50-51]
Baicalin(黄芩苷) Scutellania amoena (滇黄芩)[52]
Isoflavonoid (异黄酮) Pueraria candollei[53]
Flavonoids Saussurea involucrate (雪莲)[54]
Ginsenoside Panax ginseng[55]
Triterpenoid Codonopsis lanceolata (党参)[56]
Decursinol angelate (前胡醇) Angelica gigas (当归)[57]
研究结果显示, 适宜浓度的外源物质Mg(Ac)2、L-亮氨酸、甲基茉莉酸(MJ)和水杨酸(SA)均可促进西洋参毛状根中皂苷含量的增加，MJ尤其明显[41]。

利用MJ、SA、无水乙醇(EtOH)及银离子(Ag+)分别对三分三毛状根进行0 h、24 h、48 h、96 h不同时间的处理，结果表明：4种诱导子都会对毛状根的生长起到抑制作用，其中MJ阻遏效果最为明显。

SA有助于提高山莨菪碱和樟柳碱的含量。

添加EtOH能够有效促进三分三毛状根生物碱的合成，使其生物碱含量显著提高。

而Ag+对催化三分三毛状根中生物碱合成作用则并不明显。

此外，利用基因转化研究代谢机理的实验中发现，双基因共转化毛状根中生物碱的含量提高更为显著[42]。

在甘草毛状根中添加2% Tween80后，甘草查尔酮和总黄酮含量比对照组分别提高了9倍和11倍，这一结果与PAL，C4H和4CL酶的表达直接相关[46]。

添加酵母提取物(YE)，黑曲霉和MJ均可以提高丹参毛状根中活性成分的含量[48-49]。

对活性成分代谢机理的研究还表明，硝普钠(SNP)和MJ联合使用使长春花毛状根中PGGT-I基因表达量降低，从而对长春碱的合成产生拮抗作用[50]。

此外，长春碱合成还与编码P450的基因G10H有关[51]。

0.5 mg·mL-1YE对于提高葛根毛状根中的异黄酮含量最为有效，为对照组的4.5倍[53]。

研究还发现新疆紫草毛状根中水溶性总糖含量为25.57%, 是野生根总糖含量的3.4倍；固体培养的毛状根多糖含量最高达4.29%，是液体培养毛状根的3.37倍，是野生根的4倍[43]。

甘草毛状根中甘草总黄酮的含量接近生药根，可以作为新资源开发，但其中甘草酸含量非常低[45]。

此外，党参毛状根中三萜皂苷含量显著高于野生根[56]。

1.1.4药用植物生物转化研究
由于高等植物中的次生代谢物含量相对很低且有些产物不能或难于通过化学合成途径得到，因此，人们期望能够充分利用植物组织培养以及植物酶对外源底物进行转化，得到目标化合物。

利用植物细胞、组织或转基因器官等生物体系将加入到其中的外源化合物的某一特定部位或功能基团进行特异性的结构修饰，以获得有价值的不同化学产物的过程称为植物生物转化技术。

目前用于生物合成转化的植物培养系统很多，包括体细胞胚、细胞、毛状根等。

利用长春花和熏衣草悬浮细胞转化青蒿素的研究中发现，底物添加时间对目的产物的转化十分重要。

培养第0天加入底物青蒿素会导致细胞死亡，并且没有检测到转化产物；而在培养第20天加入青蒿素6天后，目的化合物脱氧青蒿素的转化率达到最大值78.6%[58]。

在芸香和贯叶连翘组培苗中，加入氢醌进行生物转化后，熊果苷的含量达到7.8%，高于欧洲药典规定的原料药含量[59]。

暨南大学药学院于荣敏教授等人对几种药用植物培养体系进行了生物转化的研究，在三尖杉和黄花蒿培养体系中，添加底物青蒿酸和二氢青蒿酸，首次分别得到转化产物3-α-羟基青蒿酸，3-α-羟基二氢青蒿酸和3-β-羟基二氢青蒿酸[60-61]。

此外，他们还利用转基因何首乌毛状根悬浮培养体系对氯代香豆素进行生物转化，得到了两个转化产物，经结构鉴定分别为4-苯基-6-氯-香豆素-7-O-β-D-葡萄糖苷和4-甲基-6-氯-香豆素-7-O-β-D-葡萄糖苷[62]。