GSK3β和Akt参与THPN诱导的黑色素瘤细胞自噬性死亡

１．２．３ １．２．４ １．３
Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆＴＲ３………………………………………………………………………………５
１．３．１
Ｅｘｔｅｒｎａｌ ｓｔｉｍｕｌｉ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ ＴＲ３ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ……………………………………５ Ｕｐｓｔｒｅａｍ ｆａｃｔｏｒｓ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｔｒａｎｃｒｉｐｔｉｏｎ
Ｃ区（ＤＢＤ）…………………………………………………………．４ Ｄ区（铰链区）………………………………………………………．．５ Ｅ／Ｆ区（配体结合区）………………………………………………．５
１．２．４ １．３
ＴＲ３的表达调控……………………………………………………………５ １．３．１外界刺激对ＴＲ３表达的影响…………………………………………５ １．３．２上游基因对ＴＲ３转录的调控…………………………………………．６
１．５．１
１．５．２
１．５．３ ２
糖原合成酶激酶３１］（ＧＳＫ３Ｉ］）………………………………………………．１１
２．１
ＧｓＫ３Ｂ活性的调控………………………………………………………１
ｌ
２．１．１丝氨酸磷酸化抑制ＧＳＫ３１Ｂ活性……………………………………．１２ ２．１．２酪氨酸磷酸化增强ＧＳＫ３１Ｂ活性……………………………………．１３ ２．１．３结合蛋白对ＧｓＩ，：３１Ｂ活性的调控……………………………………．１３ ２．１．４亚细胞定位对ＧＳＫ３１３活性的影响调控……………………………．１３
２．３．２细胞传代………………………………………………………………２８ ２．３．３细胞冻存………………………………………………………………２８ ２．３．４药物处理………………………………………………………………２９ ２．４细胞转染…………………………………………………………………一２９ ２．４．１磷酸钙转染法…………………………………………………………２９ ２．４．２慢病毒介导的基因沉默技术…………………………………………２９ ２．５蛋白提取与Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ…………………………………………………３０ ２．６核浆分离…………………………………………………………………．．３１ ２．７免疫荧光染色和观察……………………………………………………．．３ ｌ ２．８流式细胞术…………………………………………………………………３２ ２．９线粒体提取………………………………………………………………．．３２
（步）１．经厦门大学保密委员会审查核定的保密学位论文，于
渺年亏月势日解密，解密后适用上述授权。
（√）２．不保密，适用上述授权。
（请在以上相应括号内打“√”或填上相应内容。保密学位论文应 是已经厦门大学保密委员会审定过的学位论文，未经厦门大学保密委 员会审定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认为 公开学位论文，均适用上述授权。）
３．１
Ａｋｔ的结构…………………………………………………………………１６ Ａｋｔ的作用底物…………………………………………………………一１６ Ａｋｔ的活性调控……………………………………………………………ｌ
７
３．２ ３．３ ３．４
Ａｋｔ的功能…………………………………………………………………１８ Ａｋｔ与细胞生长………………………………………………………．１９ Ａｋｔ与细胞增殖…………………………………………………………１９ Ａｋｔ与细胞存活………………………………………………………２０
Ａｂｓｔｒａｃｔ ｉｎ Ｅｎｇｌｉｓｈ………………………………………………………………………”２
ＩⅡｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ…………………………………………………………………………………¨３
１．ｏｒｐｈａｎ ｒｅｃｒｐｔｏｒ １．１ １．２
ＴＲ３………………………………………………………………………”３
巯基嘌呤例乙酰紫草素及其类似物321cytosporoneb271dinbutyltindichloride251nbutylenephthalide3031等都可以通过快速诱导tr3蛋白表达从而诱导肿瘤细胞凋亡而抑制内源tr3表达则可以抑制这些凋亡诱导剂引起的细胞凋亡1957591tr3可以以转录激活活性依赖或非依赖两种方式参与细胞凋亡的调控
厦门大学学位论文原创性声明
本人呈交的学位论文是本人在导师指导Ｆ，独立完成的研冗成 果。本人在论文写作中参考其他个人或集体己经发表的研究成果，均 在文中以适当方式明确标明，并符合法律规范和《厦门大学研究生学 术活动规范（试行）》。 ’课题（组） 另外，该学位论文为‘关取 ’’课题（组）经费或实验室的 的研究成果，获得‘凌本 ’’实验室完成。（请在以上括．３
４
恶性黑色素瘤………………………………………………………………．２０
４．１黑色素瘤演变过程………………………………………………………．．２ｌ ４．２黑色素瘤发生的信号通路………………………………………………．．２ｌ
４．２．１
ＲＡＳ通路与ＭＡＰＫ…………………………………………………．．２２
５．４
讨论与总结………………………………………………………………．５３ 参考文献……………………………………………………………………．５６
刭【谢……………………………………………………………………………………………。６８
Ｔａｂｌｅ ｏｆ Ｃ‘ｏｎｔｅｎｔ
Ａｂｓｔｒａｃｔ ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ………………………………………………………………………”１
１．３．２ １．４
ｏｆＴＲ３……………………６
Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｏｆＴＲ３………………………………………………………………………６
１．４．１
ｏｆＴＲ３………………………………・７ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｔｒａｎｓａｃｔｉｖｉｔｙ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆＴＲ３………………・－８ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ ｒｅｇｕｌａｔｅｓ ｓｕｂｃｅｌｌｕａｒ
声明人
加ｆ弓年。妇护∥日
（签名）：怖
目录 摘要………………………………………………………………………１
ＡＢＳＴＲＡＣＴ…………………………………………………………………………………。２
前言……………………………………………………………………………３ 月日ｉ弓……………………………………………………………………………………………３
４．２．２ ５
ＰＴＥＮ／Ｐ１３刚Ａｋｔ通路…………………………………………………．２２
本文研究的目的、内容和意义……………………………………………．２２
材料与方法……………………………………………………………………２４
１
实验材料……………………………………………………………………．２４
１．１主要试剂及药品…………………………………………………………．．２４ １．２实验器材……………………………………………………………………２５ １．３细胞株……………………………………………………………………．．２６
１．４
ＴＲ３的磷酸化修饰…………………………………………………………６ ＴＲ３的磷酸化与转录激活活性………………………………………．７
１．４．１
１．４．２磷酸化调控ＴＲ３的亚细胞定位………………………………………８
１．５
ＴＲ３的生物学功能…………………………………………………………８ ＴＲ３与细胞增殖………………………………………………………．９ ＴＲ３参与调控细胞凋亡………………………………………………．９ ＴＲ３其他的功能………………………………………………………１０
３．３ ４ ４．１
４．２ ４．３
高活性ＧＳＫ３１３是ＴＨＰＮ诱导黑色素瘤细胞自噬性死亡的关键………．．４ｌ
ＬｉＣｌ抑制ＴＨＰＮ诱导的黑色素瘤细胞死亡……………………………．４ｌ ＬｉＣｌ抑制ＴＨＰＮ诱导的黑色素瘤细胞自噬……………………………．４ｌ ＬｉＣＩ抑制ＴＨＰＮ诱导的ＴＲ３线粒体定位………………………………４２ ＧＳＫ３１３影响黑色素瘤细胞ＴＲ３的核浆定位并磷酸化ＴＲ３……………４４
１．５．１ １．５．２
１．５．３
２．ＧＩｙｃｏｇｅｎ ｓｙｎｔｈａｓｅ
２．１
ｋｉｎａｓｅ３［１（ＧＳＫ３１Ｂ）…………………………………………………”１１
ａｃｔｉｖｉｔｙ……………………………………………………………・１ｌ
Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ
ｏｆＧＳＫ３１３
２．１．１ ２．１．２
ｓｅｒｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ
１
孤儿受体ＴＲ３…………………………………………………………………３
１．１
１．２
ＴＲ３的发现…………………………………………………………………３ ＴＲ３的结构…………………………………………………………………３
Ａ／Ｂ区（ＴＡＤ）…………………………………………………………………４
１．２．１ １．２．２ １．２．３
２
试验方法……………………………………………………………………．２６ ２．１质粒转化……………………………………………………………………２６ ２．２质粒提取…………………………………………………………………．．２７ ２．２．１小规模质粒提取………………………………………………………２７ ２．２．２中量提取质粒…………………………………………………………２７ ２．３细胞培养…………………………………………………………………．．２８ ２．３．１细胞复苏………………………………………………………………２８
题或课题组负责人或卖验室名称，未有此项声明内容的，可以不作特
别声明。）
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４．４ ５
抑制Ａｋｔ活性增强ＴＨＰＮ诱导的其他类型肿瘤细胞自噬性死亡………４６
５．１ ５．２ ５．３
ＬＹ２９４００２增强ＴＨＰＮ诱导的其他肿瘤细胞死亡………………………４６ ＬＹ２９４００２处理加强ＴＨＰＮ诱导的肿瘤细胞发生自噬…………………４７ ＬＹ２９４００２促进胃癌细胞ＴＲ３的出核转运……………………………．．４９ ＬＹ２９４００２促进ＴＨＰＮ诱导的胃癌细胞ＴＲ３线粒体定位……………．．５０
ＤｉＳＣＯＶｅｒｙ ｏｆＴＲ３………………………………………………………………………………・３ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆＴＲ３…………………………………………………………………………………３
１．２．１ １．２．２
Ａ／Ｂ ｒｅｇｉｏｎ…………………………………………………………………………………・４ Ｃ ｒｅｇｉｏｎ……………………………………………………………………………………・・４ Ｄ ｒｅｇｉｏｎ……………………………………………………………………………………・４ Ｅ／Ｆ ｒｅｇｉｏｎ…………………………………………………………………………………・５
２．２
ＧｓＫ３１３的功能……………………………………………………………１４ ａｓＫ３１３对转录因子的调控…………………………………………．．１４ ＧＳＫ３１３与细胞凋亡…………………………………………………．．１５
２．２．１ ２．２．２
３
蛋白激酶Ｂ（Ａｋ０…………………………………………………………．１５
１．４．２ １．５
ｏｆＴＲ３…………………………………………………………………８ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ…………………………………………………………………………９ Ｃｅｌｌ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ……………………………………………………………………………“９ Ｏｔｈｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ…………………………………………………………………………・１０
结果与分析………………………………………………………………．３３
３
ＴＩ－ＩＰＮ诱导的黑色素瘤细胞自噬性死亡不依赖ＢＲＡＦ信号通路………３６
３．１
３．２
ＴＨＰＮ诱导的细胞死亡与ＢＲＡＦＶ６００Ｅ突变无关………………………．．３６ ＭＥＫ／ＥＲＫ不参与ＴＨＰＮ诱导的细胞死亡……………………………．．３７ ＴＨＰＮ诱导的自噬性细胞死亡依赖于Ａｋｔ和ＧＳＫ３［３通路……………３９