[英语学习]westernblot流程-经典版

1培养细胞总蛋白的抽提
1)将代测细胞标准条件下培养48h，PBS洗涤2次，用细胞刮匙
轻轻将细胞从培养瓶中刮下，收集细胞总量1×107个。

1500rpm
离心10min，弃上清。

2)PBS洗涤2min×3，每次1500rpm 离心10min，弃去上清。

3)150μl三去污细胞裂解液重悬细胞，冰上静置30min。

15000rpm
离心30min弃去沉淀，细胞总蛋白即在上清液中。

三去污细胞裂解液的成分：
50mM tris-HCl, pH 8.0,
150 mM NaCl,
0.5% 去氧胆酸钠
1% NP-40
0.1% SDS
1 mM EDTA
100 μg/ml苯甲基磺酰氟(PMSF) （临用前配制）
10U/ml aprotinin（临用前配制）
4)将蛋白定量、分装。

细胞总蛋白经BCA Protein Assay Reagent
Kit定量后分装保存。

Western blot检测（ECL法）
1）SDS-PAGE（凝胶）电泳：配制12%的分离胶和5%的浓缩胶。

取15μl样品液和3μl 6×加样缓冲液，混匀。

煮沸5min使蛋白
变性后上样，每孔上样量约为30μg。

110V恒压电泳约90min，
至溴酚蓝完全消失。

SDS-PAGE的配制
成分分离胶(12%) 浓缩胶(5%)
去离子水 1.6ml 1.8ml
3%AA母液 2.0ml 0.3ml
1.5M Tris-HCl (PH8.8) 1.3ml --
1 M Tris-HCl (PH6.8) -- 0.75ml
10% SDS 50μl 30μl
10%过硫酸胺(APS) 50μl 50μl
TEMED 5μl 5μl
总体积5ml 3ml
2）转膜：电泳完毕后，切去浓缩胶，将胶浸于蛋白转移缓冲液中平衡10-20min。

用湿转的方法将蛋白条带转移至硝酸纤维素膜上( SDS-凝胶位于负极，硝酸纤维素膜位于正极)，0.3A 恒流电泳80min。

3）封闭：转膜结束后，取下硝酸纤维素膜，PBS浸泡5 min后将膜浸于含5%脱脂奶粉的PBS(MPBS)中1 h。

已转膜的凝胶用考马斯亮蓝染液染色1h，脱色液脱色30min，观察胶上残留蛋白情况，判断转膜效率。

4）一抗孵育（带有辣根过氧化物酶）：封闭结束后将膜置于杂交袋内，加入目的抗体(1%MPBS按试剂盒要求稀释)，4℃摇动下过夜。

5）二抗结合：PBS-T快速洗膜一遍后，PBS-T洗膜10min×3遍。

加入辣根过氧化物酶标记的相对于一抗的第二抗体(1%MPBS 按要求比例稀释)，室温下孵育1 h。

PBS-T快速洗膜一遍，再洗膜10min×3遍。

6）ECL显色：临用前将ECL显色液A与B混和，均匀滴加至膜表面，避光曝片，于显影液、定影液中冲洗照片，观察结果。