高效液相色谱实验

实验1 气相色谱分析条件的选择和色谱峰的定性鉴定
一、目的要求
1.了解气相色谱仪的基本结构、工作原理与操作技术；
2.学习选择气相色谱分析的最佳条件，了解气相色谱分离样品的基本原理；
3.掌握根据保留值，作已知物对照定性的分忻方法。

4.掌握归一化法测定混合物各组分的含量。

二、基本原理
气相色谱是对气体物质或可以在一定温度下转化为气体的物质进行检测分析。

由于物质的物性不同，其试样中各组份在气相和固定液液相间的分配系数不同，当汽化后的试样被载气带入色谱柱中运行时，组份就在其中的两相间进行反复多次分配，由于固定相对各组份的吸附或溶解能力不同，虽然载气流速相同，各组份在色谱柱中的运行速度就不同，经过一定时间的流动后，便彼此分离，按顺序离开色谱柱进入检测器，产生的讯号经放大后，在记录器上描绘出各组份的色谱峰。

根据出峰位置，确定组分的名称，根据峰面积确定浓度大小。

对—个混合试样成功地分离，是气相色谱法完成定性及定量分析的前提和基础。

而其中气相色谱分离条件的选择至为关键。

主要涉及以下几个方面：
1. 载气对柱效的影响：
载气对柱效的影响主要表现在组分在载气中的扩散系数D m(g)上，它与载气分子量的平方根成反比，即同一组分在分子量较大的载气中有较小的D m(g) 。

根据速率方程：
（1）涡流扩散项与载气流速无关；
（2）当载气流速u 小时，分子扩散项对柱效的影响是主要的，因此选用分子量较大的载气，如N2、Ar，可使组分的扩散系数D m(g)较小，从而减小分子扩散的影响，提高柱效；
（3）当载气流速u 较大时，传质阻力项对柱效的影响起主导作用，因此选用分子量较小的气体，如
H2、He 作载气可以减小气相传质阻力，提高柱效。

2. 载气流速（u）对柱效的影响：
从速率方程可知，分子扩散项与流速成反比，传质阻力项与流速
成正比，所以要使理论塔板高度H最小，柱效最高，必有一最佳流速。

对于选定的色谱柱，在不同载气流速下测定塔板高度，作H-u 图。

由图可见，曲线上的最低点，塔板高度最小，柱效最高。

该点所
对应均流速即为最佳载气流速。

在实际分析中，为了缩短分析时间，
选用的载气流速稍高于最佳流速。

3. 固定液的配比又称为液担比。

从速率方程式可知，固定液的配比主要影响C s u，降低d f，可使C s u减小从而提高柱效。

但固定液用量太少，易存在活性中心，致使峰形拖尾；且会引起柱容量下降，进样量减少。

在填充柱色谱中，液担比一般为5％～25％。

4. 柱温的选择
柱温是影响气相色谱分离的重要参数之一，主要影响来自于K、k、D m(g)、D s(l)；从而直接影响分离效能和分析速度。

柱温与R和t 密切相关。

提高t，可以改善Cu，有利于提高R，缩短t。

但是提高柱温又会增加B/u 导致R 降低，r21变小。

但降低t 又会使分析时间增长。

在实际分析中应兼顾这几方面因素，选择原则是在是在难分离物质对能得到良好的分离，分析时间适宜且峰形不托尾的前提下，尽可能采用较低的柱温。

同时，选用的柱温不能高于色谱柱中固定液的最高使用温度（通常低20-50℃）。

对于沸程宽的多组分混合物可采用“程序升温法”，可以使混合物中低沸点和高沸点的组分都能获得良好的分离。

5.气化温度的选择
气化温度的选择主要取决于待测试样的挥发性、沸点范围。

稳定性等因素。

气化温度一般选在组分的沸点或稍高于其沸点，以保证试样完全气化。

对于热稳定性较差的试样，气化温度不能过高，以防试样分解。

6.色谱柱长和内径的选择
能使待测组分达到预期的分离效果，尽可能使用较短的色谱柱。

一般常用的填充柱为l～3m。

填充色谱柱内径为3～4mm。

7. 进样时间和进样量的选择
进样迅速（塞子状）以防止色谱峰扩张；
进样量要适当：在检测器灵敏度允许下，尽可能少的进样量：液体样0.1～10ul，气体试样为0.1～10ml。

8. 燃气和助燃气的比例
在气相色谱分析中，燃气和助燃气的比例会严重的影响组分的分离，一般两者的比例为1：8~1：15。

而真正实现对—个混合试样成功地分离，色谱条件的选择中最为关键的是色谱柱的选择、柱温的选择、载气的选择及其流速的确定、燃气和助燃气的比例等。

衡量气相色谱分离好坏的程度可用分离度R表示：
()
,2,2
12
2
R R
t t R
Y Y
-
=
+
式中，t R2，Y2和t R1，Y1分别是两个组分的保留时间和峰底宽，如图所
示。

当R＝1.5时，两峰完全分离；当R=1.0时，98％的分离。

在实际应用
下，R＝1.0时一般可以满足需要。

用色谱法进行定性分析的任务是确定色谱图上每一个峰所代表购物质。

在色谱条件确定时，任何一种物质都有确定的保留值、保留时间、保留体积、保留指数及相对保留值等保留参数。

因此，在相同的色谱操作条件下，通过比较已知纯样和未知物的保留参数或在固定相上的位贸，即可确定未知物为何种物质。

当手头上有待测组分的纯样时，作与巴知物的对照进行定性分析极为简单。

实验时，可采用单柱比较法、峰高加入法或双柱比较法。

单柱比较法是在相同的色谱条件下，分别对已知纯样及待测试样进行色谱分析．得到两张色谱图，然后比较其保留参数。

当两者的数值相同时，即可认为待测试样中有纯佯组分存在。

双柱比较法是在两个极性完全不同的色谱住上，在各自确定的操作条件下，测定纯样和待测组分在其上的保留参数，如果都相同，则可准确地判断试样中有与此纯样相同的物质存在。

由于有些不同的化合物会在某一固定相上表现出相向的热力学性质，故双柱法定性比单柱法更为可靠。

在一定的色谱条件下，组分i的质量mi或其在流动相中的浓度，与检测器的响应讯号峰面积Ai或峰
高hi，成正比：
A
i i i
m f A
=⋅
或
h
i i i
m f h
=⋅
，
式中，
A
i
f
和
h
i
f
称为绝对校正因子。

这是是色谱定量的依据。

响应信号Ai、hi及校正因子
A
i
f
和
h
i
f
的
淮确测量直接影响定量分析的准确度。

而其中峰面积更适于作为定量分析的参数。

现代色谱仪或工作站中一般都能准确测量色谱峰面积。

绝对校正因子可用下式表示：
A i
i
i
m
f A
=
式中，Mi可用质量、物质的量及体积等物理量表示，糊应的校正因子分别称为质量校正因子、摩尔校正因子和体积校正因子。

由于绝对校正因子受仪器和操作条件的影响很大，其应用受到限制，一般采用
相对校正因子。

相对校正因子是指组分i与基准组分s的绝对校正因子之比，即：
'
i
i i i
s
s
s
m
f A f
m
f
A ==
根据不同的情况，可选用不同的定量方法。

归一化法是将样品巾所有组分合量之相按100％计算，以它们相应的响应信号为定量参数，从而计算各组分的质量分数。

该法简便、准确。

当操作条件变化时，对分析结果影响较小，常用于定量分析，尤其适于进佯量少而体积不易准确测量的液体试样。

但采用本法进行定量分析时，要求试样中各组分产生可测量的色谱峰。

三、仪器和试剂
1.气相色谱仪任一型号
2.氮气或氢气钢瓶
3.微量进样器10μL，医用注射剂 5ｍＬ， 10ｍＬ
4.色谱条件色谱柱：苯系物专用检测柱（2mm×2m不锈钢填充柱，其最高耐受温度105℃），气
化室温度：150℃，检测器温度：150℃，载气（N2）流速：30~50mL/min，燃烧气（H2）流速：40~50mL/min，助燃气（空气）流速：400~500mL/min，柱温：65℃~100℃。

初始色谱条件：气化室温度：150℃，检测器温度：150℃，载气（N2）流速：30mL/min，燃烧气（H2）流速：40mL/min，助燃气（空气）流速：400mL/min，柱温：65℃。

5.苯、甲苯、乙苯、正己烷等均为分析纯。

四、试验步骤
1.样品的配制：分别取取苯、甲苯及乙苯各50μL，用正己烷稀释至50mL容量瓶中，密封摇匀。

2.样品的测定：先按照初始条件设定色谱条件，待仪器的电路和气路系统达到平衡，记录仪上的基线平
直时，既可进样。

吸取2uL标准样品注入汽化室，记录色谱图，采集色谱数据。

重复进样两次。

进样后及时在记录纸上，于进样信号处标明标准溶液号码，注意每做完一种标准溶液需用后一种待进样标准溶液洗涤微量进样器5~6次。

3.柱温的选择：改变柱温：65℃、75℃、85℃，同上测试，判断柱温对分离的影响。

4.载气流速的选择：改变不同的载气流速，同上测试，判断柱温对分离的影响。

5.燃气和助燃气的比例的选择：改变燃气和助燃气的比例，同上测试，判断柱温对分离的影响。

五﹑数据及处理
1.记录初始实验条件下的色谱条件及色谱结果（各自组分及对应保留时间）。

并根据单一标准样的保留
时间确定混合样品中各峰的物质名称。

记录实验条件：
（1）色谱柱的柱长及内径：
（2）载气及其流量：
（3）燃气及其流量：
（4）助燃气及其流量：
（5）柱温：
（6）检测器及检测温度：
（7）汽化室温度：
记录各色谱图上各组分色谱峰的保留时间值，并填入下表中。

编号
t苯t甲苯t乙苯
1 2 3 平均值 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值
单标
混合样
2.采用混合标样作为样品，改变柱温：60℃、65℃、70℃、75℃、80℃，同上测试，记录各色谱图上各
组分色谱峰的保留时间值，并填入下表中。

判断柱温对分离的影响。

温度
t苯t甲苯t乙苯
1 2 3 平均值 1 2 3 平均值 1 2 3 平均值
60℃
65℃
70℃
75℃
80℃
3.如果时间许可，可以以混合标样作为样品尝试改变不同的载气流速，改变燃气和助燃气的比例，判断
柱温对分离的影响。

六、思考题
1.气相色谱定性分析的基本原理是什么？本实验中怎样定性的？
2.试讨论各色谱条件（柱温等）对分离的影响。

3.本实验中的进样量是否需要准确，为什么？
4.简要分析各组分流出先后的原因。

注：苯、甲苯、乙苯的密度分别取以下值(20℃)：
苯的密度：0.879g/mL
甲苯的密度：0.865g/mL
乙苯的密度：0.867g/mL
实验2 苯、甲苯、二甲苯的气相色谱定量分析
一、目的要求
1. 学习气相色谱法测定样品的基本原理、特点。

定性、和定量分析的基本方法。

2. 学习外标法定量的基本原理和测定方法。

3. 学习内标法定量的基本原理和测定方法，以及与内标法定量的区别。

二、基本原理
1. 外标法定量的基本原理
用待测组分的纯品作对照物质，以对照物质和样品中待测组分的响应信号相比较进行定量的方法称为外标法。

此法可分为工作曲线法及外标一点法等。

工作曲线法是用对照物质配制一系列浓度的对照品溶液确定工作曲线，求出斜率、截距。

在完全相同的条件下，准确进样与对照品溶液相同体积的样品溶液，根据待测组分的信号，从标准曲线上查出其浓度，或用回归方程计算，工作曲线法也可以用外标二点法代替。

通常截距应为零，若不等于零说明存在系统误差。

工作曲线的截距为零时，可用外标一点法(直接比较法)定量。

外标一点法是用一种浓度的对照品溶液对比测定样品溶液中i 组分的含量。

将对照品溶液与样品溶液在相同条件下多次进样，测得峰面积的平均值，用下式计算样品中i 组分的量：W ＝A(W)／(A)
式中W 与A 分别代表在样品溶液进样体积中所含i 组分的重量及相应的峰面积。

(W)及(A)分别代表在对照品溶液进样体积中含纯品i 组分的重量及相应峰面积。

外标法方法简便，不需用校正因子，不论样品中其他组分是否出峰，均可对待测组分定量。

但此法的准确性受进样重复性和实验条件稳定性的影响。

此外，为了降低外标一点法的实验误差，应尽量使配制的对照品溶液的浓度与样品中组分的浓度相近。

外标法 external standard method 色谱分析中的一种定量方法，它不是把标准物质加入到被测样品中，而是在与被测样品相同的色谱条件下单独测定，把得到的色谱峰面积与被测组分的色谱峰面积进行比较求得被测组分的含量。

外标物与被测组分同为一种物质但要求它有一定的纯度，分析时外标物的浓度应与被测物浓度相接近，以利于定量分析的准确性。

2. 内标法定量的基本原理
对于试样中少量杂质的测定，或仅需测定试样中某些组分时，可采用内标法定量。

用内标法测定时需在试样中加入一种物质作内标，而内标物质应符合下列条件： 错误！未找到引用源。

应是试样中不存在的纯物质；
错误！未找到引用源。

内标物质的色谱峰位置应位于被测组分色谱峰的附近； 错误！未找到引用源。

其物理性质及物理化学性质应与被测组分相近； 错误！未找到引用源。

加入的量应与被测组分的量接近。

设在质量为m 试样的试样中加入内标物质的质量为m s ，被测组分的质量为m i ，被测组分及内标物质的色谱峰面积（或峰高）分别为A i ， A s (或h i ， h s )，则m i =f i A i ，m s =f s A s
s
s i i s i s s i i s i A f A
f m m A f A f m m ==,
100%⨯=
试样
m m c i
i 100%⨯∙=
s
s i i s i A f A
f m m c 试样 若以内标物质作标准，则可设f s =1，可按下式计算被测组分的含量，即
100%⨯∙=
s
i i s i A A
f m m c 试样 或 100%''⨯∙=s
i
i s i h h f m m c 试样
式中f i "为峰高相对质量校正因子。

也可用配制一系列标准溶液，测得相应的A i /A s （或h i /h s ）绘制A i /A s ~%c i 标准曲线，如下图所示。

这样可在无需预先测定f i （或f i "）的情况下，称取固定量的试样河内标物质，混匀后即可进样，根据A i /A s 之值求得%c i 。

内标法是一种间接或相对的校准方法。

在分析测定样品中某组分含量时，加入一种内标物质以校谁和消除出于操作条件的波动而对分析结果产生的影响，以提高分析结果的准确度。

内标法在气相色谱定量分析中是一种重要的技术。

使用内标法时，在样品中加入一定量的标准物质，它可被色谱拄所分离，又不受试样中其它组分峰的干扰，只要测定内标物和待测组分的峰面积与相对响应值，即可求出待测组分在样品中的百分含量。

采用内标法定量时，内标物的选择是一项十分重要的工作。

理想地说，内标物应当是一个能得到纯样的己知化合物，这样它能以准确、已知的量加到样品中去，它应当和被分析的样品组分有基本相同或尽可能一致的物理化学性质(如化学结构、极性、挥发度及在溶剂中的溶解度等)、色谱行为和响应特征，最好是被分析物质的一个同系物。

当然，
在色谱分析条什下，内标物必须能与样品中各组分充分分离。

需要指出的是，在少数情况下，分析人员可能比较关心化台物在一个复杂过程中所得到的回收率，此时，他可以使用一种在这种过程中很容易被完全回收的化台物作内标，来测定感兴趣化合物的百分回收率，而不必遵循以上所说的选择原则。

内标法定量结果准确，对于进样量及操作条件不需严格控制，内标标准曲线法更是用于工厂的操作分析。

本试验选用苯作内标物质，以内标标准曲线法，测定未知样品中甲苯和乙苯等的含量。

在使用内标法定量时，有哪些因素会影响内标和被测组分的峰高或峰面积的比值?
影响内标和被测组分峰高或峰面积比值的因素主要有化学方面的、色谱方面的和仪器方面的三类。

由化学方面的原因产生的面积比的变化常常在分析重复样品时出现。

化学方面的因素包括： 1、内标物在样品里混合不好； 2、内标物和样品组分之间发生反应，
3、内标物纯度可变等。

对于一个比较成熟的方法来说，色谱方面的问题发生的可能性更大一些，色谱上常见的一些问题(如渗漏)对绝对面积的影响比较大，对面积比的影响则要小一些，但如果绝对面积的变化已大到足以使面积比发生显著变化的程度，那么一定有某个重要的色谱问题存在，比如进样量改变太大，样品组分浓度和内标浓度之间有很大的差别，检测器非线性等。

进样量应足够小并保持不变，这样才不致于造成检测器和积分装置饱和。

如果认为方法比较可靠，而色谱固看来也是正常的话，应着重检查积分装置和设置、斜率和峰宽定位。

对积分装置发生怀疑的最有力的证据是：面积比可变，而峰高比保持相对恒定，在制作内标标准曲线时应注意什么?
在用内标法做色话定量分析时，先配制一定重量比的被测组分和内标样品的混合物做色谱分析，测量峰面积，做重量比和面积比的关系曲线，此曲线即为标准曲线。

在实际样品分析时所采用的色谱条件应尽可能与制作标准曲线时所用的条件一致，因此，在制作标准曲线时，不仅要注明色谱条件(如固定相、柱温、载气流速等)，还应注明进样体积和内标物浓度。

在制作内标标准曲线时，各点并不完全落在直线上，此时应求出面积比和重量比的比值与其平均位的标准偏差，在使用过程中应定期进行单点校正，若所得值与平均值的偏差小于2，曲线仍可使用，若大于2，则应重作曲线，如果曲线在铰短时期内即产生变动，则不宜使用内标法定量。

3. 定量分析中怎样选择内标法或外标法
选一与欲测组分相近但能完全分离的组分做内标物（当然是样品中没有的组分），然后配制欲测组分和内标物的混合标准溶液，进样得相对校正因子。

再将内标物加入欲测组分的样品中，进样后测得欲测组分和内标物的定量参数。

用内标法公式计算即可。

内标法是将一定量的纯物质作内标物，加入到准确称量的试样中，根据被测试样和内标物的质量比及其相应的色谱峰面积之比，来计算被测组分的含量。

选择内标物有4个要求：1.内标物应是该试样中不存在的纯物质；2.它必须完全溶于试样中，并与试样中各组分的色谱峰能完全分离；3.加入内标物的量应接近于被测组分；4.色谱峰的位置应与被测组分的色谱峰的位置相近，或在几个被测组分色谱峰中间。

内标法的优点是测定的结果较为准确，由于通过测量内标物及被测组分的峰面积的相对值来进行计算的，因而在一定程度上消除了操作条件等的变化所引起的误差。

内标法的缺点是操作程序较为麻烦，每次分析时内标物和试样都要准确称量，有时寻找合适的内标物也有困难。

外标法简便，但进样量要求十分准确，要严格控制在与标准物相同的操作条件下进行，否则造成分析误差，得不到准确的测量结果。

内标与外标都是定量的一种方法，至于哪一种方法好与不好不能一概而论，做不同的分析，面对着不同的要求，再加上分析成本分析效率等等问题，应优先选用简单而有效，能满足定量分析的要求即可。

一般首选外标法，简单而省事。

对于精密度要求比较高、结果准确度会产生重大影响、实验室条件不是很理想的等等条件下，用内标法还是必要的。

无论应用那种方法，方法的验证和确认都是很重要的，只要是按照程序经过验证和确认的方法，都有其应用的空间的。

三、仪器和试剂
1.气相色谱仪（配有氢焰离子化检测器）任一型号
2.氮气或氢气钢瓶
3.微量进样器10μL
4.医用注射剂 5ｍＬ， 10ｍＬ
5.色谱条件色谱柱：苯系物专用检测柱（2mm×2m不锈钢填充柱，其最高耐受温度105℃），气化室
温度：150℃，检测器温度：150℃，载气（N2）流速：40~50mL/min，燃烧气（H2）流速：40~50mL/min，助燃气（空气）流速：400~500mL/min，柱温：65℃，3min后10℃/min升温到100℃。

6.苯、甲苯、乙苯、正己烷等均为分析纯。

四、试验步骤
1. 相对较正因子的测定
（1）标准样品的配制：分别按下列比例移取苯、甲苯、乙苯于50mL容量瓶中，用正己烷稀释至刻度，密封摇匀。

编号苯/uL 甲苯/uL 乙苯/uL
1 50 10 10
2 50 30 30
3 50 50 50
4 50 70 70
5 50 90 90
（2）相对较正因子的测定：将色谱仪按仪器操作步骤调节至可进样状态，待仪器的电路和气路系统达到平衡，记录仪上的基线平直时，既可进样。

吸取2uL标准样品注入汽化室，记录色谱图，采集色谱数据。

重复进样两次。

进样后及时在记录纸上，于进样信号处标明标准溶液号码，注意每做完一种标准溶液需用后一种待进样标准溶液洗涤微量进样器5~6次。

2．样品的测定：
将样品摇匀后，在50mL容量瓶中加入适量未知样品，用正己烷稀释至刻度，摇匀。

在与测定相对较正因子相同的色谱条件下对样品进行测定，记录各组分在组分柱上的色谱图和色谱数据，并重复进样两次。

五﹑数据及处理
1．记录实验条件：
（1）色谱柱的柱长及内径：
（2）载气及其流量：
（3）燃气及其流量：
（4）助燃气及其流量：
（5）柱温：
（6）检测器及检测温度：
（8）汽化室温度：
2．测量各色谱图上各组分色谱峰面积Ai值，并填入下表中。

编号
A甲苯A乙苯
1 2 3 平均值 1 2 3 平均值
1
2
3
4
5
未知
3.按照外标法对以上样品进行分析，绘制标准曲线，计算未知样品中甲苯、乙苯的含量。

六、思考题
1．实验中是否要严格控制进样量，实验条件若有所变化是否会影响测定结果，为什么？
2．内标法定量有何优点，它对内标物质有何要求？
3．在内标标准曲线法中，是否需要应用校正因子，为什么？
4．试讨论外标法与内标法对样品进行分析的区别。

实验3 荧光法分析VB2
一、目的要求
1.掌握荧光法分析的基本原理
2.学习采用荧光法分析测定维生素B2的含量
二、基本原理
1. 荧光分析法的基本原理
光的本质是一种电磁波，具有不同的波长。

可见光的波长范围在400～700nm。

紫外光的波长范围在200～400nm范围。

有色物质可以选择性地吸收一部分可见光区光地能量而呈现不同颜色，某些物质却能选择性地吸收紫外光的能路。

物质吸收由光源发出地某些波长可形成特定的吸收光谱。

由于物质的吸收光谱与物质的分子结构有关，而且在一定条件下其吸收程度与该物质的浓度成正比，所以可以利用物质的特定吸收光谱对其进行定性和定量分析。

分光光度法是利用各种物质所具有的这种吸收特性建立的分析方法。

当处于基态的被测物质的分子在吸收适当能量，如光、化学、物理能后，其共价电子从成键分子轨道或非键分子轨道跃迁到反键分子轨道上去，形成分子激发态。

分子激发态不稳定，将很快衰变到基态。

在分子激发态返回到基态的同时常伴随着光子的辐射。

这种现象就是发光现象。

荧光则属于分子的光致发光现象。

当某些物质受紫外光或可见光照射激发后能发射出比激发光波长较长的荧光。

1）荧光的产生此化学物质能从外界吸收并储存能量（如光能、化学能等）而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量可以电磁辐射的形式放射（即发光）。

荧光发射的特点是：可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光；而一旦停止供能，发光（荧光）现象也随之在瞬间内消失。

可以引起发荧光的能量种类很多，由光激发所引起的荧光称为致荧光。

由化学应所引起的称为化学荧光，由X线或阴极射线引起的分别称为X线荧光或阴极射线荧光。

2）荧光效率荧光分子不会将全部吸收的光能都转变成荧光，总或多或少地以其他形式释放。

荧光效率是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率，与发射荧光光量子的数值成正比。

荧光效率＝发射荧光的光量分子数（荧光强度）／吸收光的光量子数（激发光强度）
发射荧光的光量子数亦即荧光强度，除受激发光强度影响外，也与激发光的波长有关。

各个荧光分子有其特定的吸收光谱和发射光谱（荧光光谱），即在某一特定波长处有最大吸收峰和最大发射峰。

选择激发光波长量接近于荧光分子的最大吸收峰波长，且测定光波量接近于最大发射光波峰时，得到的荧光强度也最大。

3）荧光的猝灭荧光分子的辐射能力在受到激发光较长时间的照射后会减弱甚至猝灭，这是由于激发态分子的电子不能回复到基态，所吸收的能量无法以荧光的形式发射。

一些化合物有天然的荧光猝灭作用而被用作猝灭剂，以消除不需用的荧光。

因此荧光物质的保存应注意避免光（特别是紫外光）的直接照射和与其他化合物的接触。

在荧光抗体技术中常用一些非荧的色素物质如亚甲蓝、碱性复红。

伊文思蓝或低浓度的过锰酸钾、碘溶液等对标本进行得当复染，以减弱非特异性荧光本质，使特异荧光更突出显示。

2. 荧光分光光度计的特点
物质的激发光谱和荧光发射光谱，可以用作该物质的定性分析。

当激发光强度、波长、所用溶剂及温。