蛋白质免疫印记技术实验报告

实验二蛋白质免疫印迹技术
河北大学生命科学学院2010生物技术河北保定071002
摘要：目的：学习掌握动物抗血清的制备原理及技术，通过实际操作学会动物抗血清的制备，掌握Western－blotting的基本原理，熟悉Western－blotting的实验操作。

方法：，使用鸡卵类粘蛋白对小白鼠进行常规免疫，获得抗血清，然后利用Western－blotting 检测抗血清。

结果：纯化的鸡卵类粘蛋白能引起小鼠的免疫反应.
关键词：常规免疫抗血清免疫印记
Abstract：objective：learn to master the theory and technology of preparing animals’antiserum by operating the experiment in person ,learn to prepare the animals’antiserum , mastering the basic principles of Western－blotting, and being familiar with the experiment operation of Western－blotting. Methods : using chicken ovomucoid operating the routine immunization of , and obtain the antiserum, then detecting the antiserum
through Western－blotting.
Result:Purified chicken ovomucoid can lead to the laboratory rat's immunoreaction Keywords: routine immunization antiserum Western－blotting
前言
免疫印迹(Western blotting)是一种检测固定在固相基质上的蛋白质的免疫化学方法该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种常规技术，是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。

进行免疫之前必须具备可特异性识别目的蛋白质的单抗或多抗，以及含有目的蛋白质的粗制或纯化的样品。

因此，免疫印迹可以从复杂抗原中检出特定的抗原或者从多克隆抗体中检出单克隆抗体，又可以对转移到固相膜上的抗原或抗体进行连续分析，以取得目的蛋白的定位、定性或定量。

现在，免疫印记技术，在对人的病理研究上，也有了很大的应用，免疫印记法检测细胞中癌基因的表达及其意义。

［1］（潘静坤.免疫印记法检测宫颈液基细胞中HPV16、18 E6癌基因的表达及其意义［D］.中国医科大学,2006.）
1、试剂与器材
1．1小鼠的常规免疫与抗血清的制备所需试剂与器材
注射器蜗旋混合器纯化的鸡卵类粘蛋白苦味酸（以75%乙醇配置）标记小鼠
佐剂（完全佐剂不完全佐剂）酒精棉球冰箱离心机
1.2 Western Blot
12%分离胶，3.6%浓缩胶马斯亮蓝脱色液PVDF膜甲醇电泳缓冲液
封闭液（0.5%BSA、TBST溶液）一抗（自制多克隆抗血清以TBST按1:100比例稀释）二抗（羊抗鼠，按1:1000比例用TBST稀释）DAB显色液蒸馏水镊子烧杯海绵垫
2 方法
2.1 小鼠的常规免疫和抗血清的制备
（1）抗原的提取与制备
1）抗原为纯化的鸡卵类粘蛋白
2）利用苦味酸（以75%乙醇配置）标记小鼠背部
（2）初级免疫：小鼠背部多点皮下注射，0.2mL/只小鼠
1）抗原与佐剂的混合：取1.5mL蛋白与1.5mL完全佐剂混合，震荡混匀，制成油包水的形态
2）用酒精棉球消毒待注射部位
3）皮下多点注射，每点注射量应小于0.1mL
初级免疫后仔细观察小鼠对外源抗原的反应，两周后进行加强免疫
（3）加强免疫：小鼠背部多点皮下注射，0.15mL/只小鼠
1）抗原与佐剂的混合：取1.5mL蛋白与1.5mL不完全佐剂混合震荡混匀，制成油包水的形态。

2）用酒精棉球消毒待注射部位
3 ）皮下多点注射，每点注射量应小于0.1mL。

（4）第二次加强免疫：加强免疫一周后进行。

操作相同。

（5）收集抗血清（第二次加强免疫后一周后）
小鼠取血。

收集的血液置于室温下1h左右，凝固后，置4℃下，析出血清，离心，3000rpm,10min。

吸出血清，分装（0.05～0.2mL），贮于-20℃以下冰箱保存。

2.2 Western blotting检测抗血清
1.抗原SDS-PAGE
凝胶的制备：12%分离胶，3.6%浓缩胶
抗原样品的制备：蛋白样品与样品液混合等体积混合后沸水浴5分钟。

点样：
1—3 粗品4—5 抗原（纯品）
电泳：浓缩胶（120V）分离胶，170V
2.抗原样品经SDS-PAGE电泳后，取出凝胶，去掉浓缩胶和溴酚兰。

从5、6号点样孔处将胶切开，并全切下胶的右下角作为标记，有1-5号孔的胶浸在转移电泳液中用于转移电泳；6-10号孔的胶放到考马斯亮蓝中染色15分钟，加脱色液脱色。

3.转移电泳
（1）戴上手套，剪一块与胶同样大小（？cm×？cm）的PVDF膜，甲醇活化15秒，然后浸泡在转移电泳缓冲液中15～30min待用。

（2）将海绵垫浸泡在转移电泳缓冲液中，避免产生气泡。

（3）打开转移电泳槽的塑料夹板，负极板在下，首先放上两层海绵泡沫板，再铺上用电泳液浸泡过的3～6层滤纸，依次加上凝胶、膜、3～6层滤纸、两层海绵泡沫板、正极板，各层接触后均用玻璃棒赶出之间的气泡。

（4）插入电泳槽内（注意凝胶一边在负极端），加转移电泳液，4℃冰箱中稳流15mA 进行转移电泳1h。

（5）取出膜，用冷风吹至半干，放入冰箱保存。

4.封闭
将膜放入封闭液（0.5%BSA、TBST溶液）中，37℃脱色摇床振荡反应1h。

TBST振荡洗膜三次，每次用TBST 50mL，每次5min。

5.与一抗、二抗结合
（1）一抗，3毫升：自制多克隆抗血清以TBST按1:100比例稀释，即取30微升一抗，再加入3mLTBST。

（2）将膜转移至一抗（稀释好的自制抗血清）中，37℃振荡反应1h或室温反应2h以上。

（3）于TBST中洗膜三次，每次5min。

(4)加入二抗（羊抗鼠，按1:1000比例用TBST稀释），37℃反应1h或室温反应2h以上。

(5)TBST洗膜三次，每次5min。

6.显色
(1)取10-15mL DAB显色液置于平皿中。

(2)将膜放入显色液中，脱色摇床上震荡直至出现条带，用大量清水冲洗以终止反应。

(3)冷风吹干，扫描杂交结果。

3 结果。