基因工程综述

基因工程综述
第一篇：基因工程综述
植物基因工程技术及其应用进展
摘要:近几年来植物基因工程的研究进展十分迅速。

在植物抗病、抗虫、抗除草剂和改变植物的某些成份方面都巳得到不少转基因植株,有的巳经建成了品系。

为提高作物的产量、抗逆能力、改进它们的品质,进行快速、优质、稳产的良种选育提供了一条全新的诱人的途径，将给人类社会带来一场深刻的变革，我们有必要了解植物基因工程的概念、原理、技术程序，以及在农业、工业等方面的应用和进展情况。

关键词:植物基因工程原理技术程序应用进展
正文
（一）植物基因工程是近几年发展起来的分子生物技术。

基因工程是按照人们的意愿,把一种生物的有用基因提取或合成出来,在生物体外对DNA分子进行剪切、拼接、修饰和重新组合,然后转移到受体细胞内进行组织培养和无性繁殖,在受体细胞内复制并得到表达,产生受体细胞新的遗传性状,产出人类所需的基因产物。

利用植物基因工程技术,改良作物蛋白质成分,提高作物中必需的氨基酸含量,培育抗病毒、抗虫害、抗除草剂、抗盐、抗旱等抗逆境植株,有的已建立了品系,为快速培育优质、高产的良种开辟一条全新途径,并展示了植物基因工程在未来农业生产中的诱人前景。

1、目的基因的获取
开展植物基因工程的工作,首先必须取得目的基因。

获取目的基因的途径有直接分离和人工合成法。

1.1目的基因的分离
直接分离是用在核苷酸序列中具有特定切点的DNA限制性内切酶将供体细胞中含目的基因的DNA片段切取分离出来。

1.2人工合成基因
目前人工合成基因的方法主要有:一是以目的基因转录成的mRNA 为模板,反转录成互补的单链DNA,然后在酶的催化下合成双链DNA,而
获得所需要的基因。

另一条途径是根据已知的蛋白质的氨基酸序列,推测出相应mRNA序列,然后按照碱基互补配对的原则,推测出它的结构基因的核苷酸序列,再通过化学方法以四种脱氧核苷酸(dNTA)为原料合成目的基因。

三是通过DNA序列自动测序仪对提出的目的基因进行核苷酸序列分析,采用聚合酶链式反(PCR)技术,快速、简便地扩增目的基因的DNA片段。

其基本方法是:先提取植物的染色体DNA或RNA,对于RNA,需经过逆转录酶合成第一链cDNA,然后以染色体DNA或第一链cDNA为模板,以人工合成的一对寡聚核苷酸为引物,在dNTP存在下,通过DNA模板的变性、模板与引物的退火及引物的延伸3个阶段的多次循环,来扩增目的基因。

2、目的基因的修饰
目的基因分离出来后往往需要经过一些修饰,让它们能够和更好的在转基因植物中进行表达。

生物体细胞中存在着对基因表达的调控机制,使基因能够有序地表达。

在基因DNA分子上有结构基因,在结构基因的上游有协调配合,共同对结
构基因的表达起调控作用的操纵基因、启动子和调节基因。

3、目的基因转移到植物受体细胞的方法
3.1植物基因工程运载体及与目的基因的结合
植物基因工程实验常用土壤农杆菌Ti质粒作载体,需删除原Ti质粒上的致病基因并用抗生素抗性基因代之。

已发展出了共整合型载体和双元载体两套载体系统。

也可用DNA病毒等材料构建载体。

Ti质粒是根癌农杆菌细胞核区外存在的一种双链DNA分子,其长度约200-250kb。

Ti质粒有4个同源区,其中T-DNA区和Vir区与基因的转移和表达有关。

T-DNA能转移到植物受体细胞并整合到染色体基因组,称转移DNA.将目的基因与运载体结合,实际上是不同来源的DNA重组过程。

首先用一特定的限制性内切酶切断运载体产生粘性末端,然后用同一种限制性内切酶切断目的基因,使其产生相同的粘性末端,由同一种限制性内切酶切断得到的两个DNA片段的粘性末端可通过碱基互补配对而结合,并在DNA连接酶的催化作用下,DNA链的5c磷酸基与一相邻的DNA链的3c羟基形成磷酸二酯键连接起来,形成重组DNA分子。

3.2 DNA直接转移法
直接转移法是利用物理化学方法将外源基因直接转入受体植物细胞的技术。

聚乙二醇、多聚赖氨酸、多聚鸟氨酸等尤其是聚乙二醇是常采用的协助基因转移的聚合物,这些聚合物和二价阳离子如Ca、Mg、Mn及DNA可在原生质体表面形成沉淀颗粒,通过原生质体的内吞作用而被吸收。

电击法是将植物细胞酶解去壁获得原生质体,并与外源基因混合置于电激仪的样品室中,在适当外电压作用下,进行短时间(Ls-ms)直流电脉冲,细胞膜被击穿而使外源基因导入原生质体内。

基因枪法是将外源基因吸附在钨、金等金属微粒(1Lm)表面,然后以400mPs的速度直接射入受体植物细胞,微弹携带外源基因穿透细胞壁和细胞膜进入受体植物细胞而实现基因转移。

此外,还有激光微束穿孔法、显微注射法、脂质体介导法和花粉管通道法等。

4、植物转化细胞的筛选和转基因植物细胞的组织培养
目前,转化细胞与未转化细胞的区分及未转化细胞的淘汰常采用抗生素抗性基因和抗除草剂基因,即筛选标记基因和筛选试剂。

就是将有抗性的筛选标记基因同时转移进植物细胞中去,然后在筛选试剂的作用下,未转化的细胞受到抑制,转化的细胞被赋予抗性而能继续存活、分裂和分化成株。

植物细胞的全能性指植物细胞具有全套遗传信息,在特定的适当环境下仍能够进行表达,培养成为一个完整的植物体。

DNA直接转移法是将DNA通过一定手段直接导入到植物的原生质里或细胞中去,然后将它们放在适当的培养基表面进行培养,使其形成愈伤组织,最后诱导出苗并培养成植株。

5、目的基因的表达和鉴定
大多数转基因植物的外源基因的表达都相当低,现在认为这是由于外源基因插入的位点效应引起的;另外,外源基因的表达会受到植物体自身的同源基因或先前转入的外源基因中的同源序列的影响而常表现为外源基因失活。

目的基因在其转化后获得的转基因植物中能否有效表达,转基因植物能否表现出特定的遗传性状,并稳定地遗传给后代,可借助植株的表型、
PCR方法鉴定和筛选转化植株,或取植物细胞或愈伤组织的提取物检测外源基因表达的生成物来鉴定。

（二）让我们来了解一下基因工程在农业、工业及环境保护、医药、食品等方面的应用。

随着生命科学和基因工程技术的进一步发展和完善，越来越多以基因工程改良的植物、动物和微生物品种已经或将要应用于社会生产。

农业生产的方式必将发生重大的改变，农产品的产量和质量将大幅度提高；许多高耗能、高污染的化工产业将可能被低耗能、低污染的基因工程产业所取代等等。

1、基因工程在农业方面的应用。

基因工程技术对农业发展具有举足轻重的作用。

我国的杂交水稻技术使水稻的产量有了大幅度的提高，为解决我国和世界粮食问题做出了巨大的贡献。

我国杂交水稻研究中心的科学家与美国科学家的联合研究发现了一个高光合效率的基因，专家们的分析认为，如果将此高光合效率基因转移到杂交水稻中，则杂交水稻的产量有可能在原有的基础上再提高20%。

虫害是降低农作物产量的主要原因之一，全世界每年都因虫害要损失数千亿美元。

化学杀虫剂的长期和大量使用已经产生出许多严重的问题，而用基因工程方法培育出的能抗虫害，不需要施用农药，对人、畜食用安全的作物，则不仅能提高种植的经济效益，而且能有效地保护我们的生存环境。

2、基因工程在工业及环境保护方面的应用。

应用基因工程技术，使植物成为能替代微生物发酵设备的生物反应器，更经济地生产出人类所需要的各种原料已经成为非常具有吸引力的领域。

现在已经培育了多种可作为生物反应器的转基因植物，能产生出可分解的塑料原料、石油、工业用脂肪、糖类和酶类等。

环境保护是人类目前面临的与人类前途生死攸关的重大问题。

基因重组技术为解决这些问题提供了可能性，通过基因重组，人们可以根据需要将某种微生物的基因转移到另一种微生物中，创造一些对有害物质分解能力更强、更能适应环境要求的新菌种。

利用微生物分解各种废弃物的同时能产生出重要的工业原料是转基因微生物应用的一个重点。

3、植物基因工程在食品方面的应用
按转基因的功能大致可以分为以下几种类型：⑴增长型。

家作物增产与其生长、分化、肥料、抗逆、抗虫害等因素密切相关，故可转移成修饰相关的基因达到增产效果。

⑵控熟型，通过转移或修饰与控制成熟期有关的基因可以使转基因生物成熟期处迟或提前，以适应市场需求；⑶高营养型，从改造种子贮藏蛋白质基因入手，使其表达的蛋白质具有合理的氨基酸组成；⑷保健型，通过转移病原体抗原基因或毒素基因至粮食作物或果树中，人们吃了这些粮食和水果，相当在在补充营养的同时服用了疫苗，起到预防疾病的作用；⑸新品种型，通过不同品种间的基因重组形成新品种，由其获得的转基因食品可能在品质、味和色香方面具有新的特点；⑹加工型，由转基因产物作原料加工制成，花样最为繁多。

4、基因工程在医药方面的应用。

在医药方面，基因工程主要用来生产各种重要的人用蛋白药物，迄今为止，人们已经分离和克隆了300多种不同的人用蛋白药物的基因，其中有数十种基因已经在不同的宿主中进行了表达和对其表达产物进行了功能分析和检测，有20多种经批准已经投放市场，如通过转基因微生物生产的干扰素、胰岛素、人和动物用生长激素等。

（三）我们了解一下基因工程的进展状况。

基因工程技术是一项正在蓬勃发展的技术，而且也已经取得了许多重要的应用成果，但我们也应该看到，基因工程技术不是一项已经成熟的技术，仍然还很粗糙和原始，在许多方面尚需完善和改进。

1、基因工程在技术上存在一定的不确定性和盲目性。

这种不确定性表现在两个方面，一是技术方面的不稳定性，二是由于对不同生物的生理特性的了解不很深入，如我们将鱼类抗冻蛋白基因转移到不抗寒的罗非鱼等热带鱼中，虽然抗冻蛋白基因得到表达，但并没有使受体鱼产生预期的抗寒效果。

目前我们所进行的基因工程基本上只能对简单的、单基因控制的性状进行设计和改造，操作对象只限于一些比较简单的单因子基因。

但生物绝大部分的重要性状是由多个基因共同控制的，对这些多基因控制的性状，现有的基因工程技术几乎仍然是束手无策。

我们对活的生物体中基因表达调控的机制知
之甚少，有关的知识仅限于对启动子和增强子有所了解，对生物体整体的调节复杂性的认识还刚刚开始。

2、在安全性方面存在着不确定性。

对社会大众来说，最主要和最关心的是基因工程的安全性问题，基因工程的安全性问题包括两个方面：一是基因工程产品的消费安全问题，二是转基因生物的生态安全问题。

目前用转基因技术生产出来的食品因其成分的某些改变是否会对人类的健康产生不良的影响，这需要实验和时间来验证。

有着某种生存优势的转基因生物如果进入到自然生态系统，就有可能排挤自然种群，降低生态系统里物种的多样性，打破生态平衡。

所以我们在大力发展转基因技术的同时，必须高度重视对转基因动物、植物及微生物品种的生物控制和控制技术的研究。

在转基因品种的安全性没有进行全面的评估和没有可靠的生物控制措施之前，应严格禁止其进行生产和进入开放的自然生态系统，只有其生态安全性达到了传统育种方法培育的新品种时，或无生殖能力的转基因动物和植物才能允许进入自然界进行生产，也只有这样才是有益于人类和社会进步的。

第二篇：基因工程
《基因工程论文》
嗜热解烃基因工程菌SL-21的构建
学
院：生命科学学院班
级：生物技术12-2 学
号：7011208209 姓
名：陈昆任课教师：张锐
嗜热解烃基因工程菌SL-21的构建
摘要﹕从以C15—C36直链烷烃为惟一碳源生长的解烃菌———地芽孢杆菌MD-2细胞中获得了1个新的烃降解基因———烷烃单加氧酶基因sladA。

将基因sladA克隆到质粒pSTE33上,构建了重组质粒pSTalk。

通过电转化将pSTalk转化入嗜热脱氮土壤芽孢杆菌ZJ-3
内,构建了基因工程菌SL-21。

SL-21兼具嗜热和解烃的功能,在70℃条件下,14d后对原油的降解率达75.08%。

研究结果表明,可以通过体外重组的方式向嗜热菌中引入烃降解基因,从而构建嗜热解烃基因工程菌。

关键词:微生物采油;烃类降解菌;嗜热解烃基因;质粒;基因工程菌微生物降解原油是微生物提高原油采收率的主要机理之一。

研究结果表明,在解烃菌作用下原油的族组分发生变化,轻质组分增加,粘度下降,改善了原油的流动性;同时,解烃菌还可以将烃类分子转化成有机溶剂、表面活性剂、酸和气体等驱油物质。

迄今为止,从自然界筛选的高效解烃菌绝大多数为嗜温微生物,最适合生长温度一般为20-45℃,很难适应油藏的高温环境。

笔者从1株解烃菌细胞中分离出1个新的烃降解基因———烷烃单加氧酶基因sladA,并采用基因工程手段将此基因转化到另外1株最适合生长温度为70℃的嗜热菌体内,构建了嗜热解烃基因工程菌SL-21。

该基因工程菌既具有高效的解烃功能,又能适应油藏高温环境,在微生物采油中具有良好的应用前景。

1.1 实验材料实验材料包括限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ;UNIQ-10柱式DNA 胶回收试剂盒、PCR片断回收试剂盒;大肠杆菌感受态细胞E.coliDH5α;pGEM-T easy载体;质粒pSTE33 kanr,Ampr,EcoRⅠ/XhoⅠ;异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、十二烷基硫酸钠(SDS)、氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kan)。

LB培养基按文献配制。

无机盐培养基组成:Na2HPO40.06g;KH2PO40.02g;NaNO30.2g;CaCl20.001g;FeSO 40.001g;MgSO4 0.03g;蒸馏水100mL;pH值为7.2。

嗜热脱氮土壤芽孢杆菌ZJ-3,分离自胜利油区孤岛油田中一区馆3区块采出液,最适合生长温度为70℃;地芽孢杆菌MD-2,以C15—C36直链烷烃为惟一碳源生长,分离自胜利油区原油污染土壤。

1.2 实验方法
DNA的操作基因组DNA小量提取,利用聚合酶链式反应(PCR)对DNA扩增、PCR产物的回收、酶切与连接,质粒DNA提取和基因序列测定等均按文献[13-14]方法进行。

菌株培养所涉及到的菌株培养均在温度为70℃,转速为180r/min的条件下进行振荡培养。

基因工程菌的构建和筛选方法ZJ-3感受态细胞的制备按文献[13-14]方法进行。

用
构建的重组质粒pST alk在最佳条件下电转化ZJ-3感受态细胞构建基因工程菌。

在含有50μg/mL Kan的LB琼脂平板上挑选10个阳性克隆接种到5mL LB培养基中,培养过夜,获得种子液。

将该种子液接种到200mL以液蜡为惟一碳源的无机盐培养基中,培养5d后用CCl4抽提剩余的液蜡,用红外测油仪测定烃的剩余量,根据菌株降解液蜡的速率筛选出目的基因工程菌。

基因工程菌的诱导表达及SDS-PAGE检测挑取阳性克隆接种于含100μg/mL Amp的10mL的LB液体培养基中,180r/min下振荡培养至光密度值达到0.6(检测光波波长为600nm),加诱导物IPTG至终浓度为1mmol/L,振荡培养8h,收集表达菌体,加SDS上样缓冲液,于100℃水浴10min后上样,用12%的SDS-PAGE电泳检测。

基因工程菌降油能力测试将基因工程菌接入20mL LB培养基中,培养12h,以5 000r/min的速度离心5min收集菌体,用无菌生理盐水洗涤菌体1次,加20mL无菌生理盐水悬浮,作为菌株利用烷烃生长的种子液。

取菌悬液按1%接种量接入200mL无机盐培养基中,加入2%孤岛油田中一区馆3区块原油或2%的液体石蜡作为惟一碳源培养,取样稀释涂布计数。

原油降解实验在无机盐培养基中添加2%的原油,按1%接种量接入基因工程菌,培养14d。

用正己烷萃取降解后的原油,用气相色谱仪测定原油饱和烃组分的降解情况。

原油降解率为菌株降解前、后原油量的差值与菌株降解前原油量的比值。

2 实验结果与分析
2.1 MD-2基因组DNA的检测
对MD-2基因组进行提取和纯化。

提取后的染色体DNA经0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测,相对分子质量不小于23kb,说明提取的DNA完好。

在检测光波波长为260280nm条件下分别测出DNA的光密度,其比值为1.95,换算出DNA的质量浓度为1 400g/mL,表明DNA纯度较好,无蛋白、RNA、酚和多糖物质的干扰。

2.2 烷烃单加氧酶基因的克隆与序列分析依据美国国立卫生研究院基因序列数据库(Genbank)中的烷烃单加氧酶基因开放阅读框两端保守序列,设计了一对兼并引物以MD-2基因组DNA为模板进行PCR扩增,将约1.3kb的PCR产物回收后连接到pGEM-T easy载体上,转入E.coliDH5α,挑取阳性克隆质粒进
行测序。

测序结果经Genbank检索,表明该DNA序列是个新的烷烃单加氧酶基因,命名为sladA。

2.3 基因工程菌的构建及筛选
通过PCR扩增sladA后,将PCR产物用EcoRⅠ或XhoⅠ消化,分离纯化出1 329bp的片断,与经EcoRⅠ或XhoⅠ消化的pSTE33质粒连接,构建成含sladA的重组质pSTalk。

经电泳鉴定表明(图1),重组质粒构建成功。

2.4 基因sladA在基因工程菌SL-21中的诱导表达
由基因工程菌SL-21全蛋白的SDS-PAGE图谱可见(图2),在烷烃单加氧酶基因sladA对应蛋白大小的地方扫描到高信号强度,表明sladA基因在SL-21中得以表达。

2.5 基因工程菌SL-21碳源生长基因工程菌SL-21在以原油和液体石蜡为惟一碳源的无机盐培养基中培养,在70℃和180r/min条件下,经过3d的延滞期后进入对数期,菌体数增加。

17d后,菌体数为接菌初期的5倍,表明SL-21能够利用原油或液体石蜡作为惟一碳源生长。

2.6 对原油的降解作用
由原油饱和烃组分的降解情况可看出(图3),基因工程菌对原油有很明显的降解效果,几乎将饱和烃降解完全。

经对气相色谱各峰面积对比,计算出各峰面积的含
量和饱和烃组分降解率(表2)。

基因工程菌SL-21对原油的降解率为75.08%。

实验结果表明,烃类降解菌地芽孢杆菌MD-2细胞提取的烷烃单加氧酶基因sladA可以在嗜热脱氮土壤芽孢杆菌ZJ-3中表达。

但不同的基因工程菌株中烷烃单加氧酶基因sladA表达的效率不同,需要通过菌株对原油的降解评价进一步筛选。

获得的对原油降解速率最高的基因工程菌SL-21能在70℃高温条件下生长,并且对原油降解效果明显。

因此以体外重组方式向嗜热菌中引入烃类降解基因构建嗜热解烃基因工程菌在技术上是可行的。

3 结论
以地芽孢杆菌MD-2为目标菌株,克隆和表达了降解长链烷烃的单加氧酶基因sladA,并在嗜热脱氮土壤芽孢杆菌ZJ-3中正确表达了基因sladA,构建了基因工程菌SL-21。

基因工程菌SL-21在70℃条件下,能以原油或液体石蜡为惟一碳源生长。

14d对原油的降解率为75.08%,
对原油饱和烃组分均有明显的降解效果。

该基因工程菌既可以用于微生物驱油技术,又可以用于高温油田污水的生物处理。

利用基因工程的方法可以获得既能耐受极端环境,又具有良好功能的基因工程菌株,是石油微生物菌种选育的重要方向。

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第三篇：基因工程
宁波大学科学技术学院考核答题纸
（2011--2012学年第学期）
课号：:EK5G04A00
课程名称：现代生物技术概论
阅卷教师：
班级：10级生物工程
学号：104177306
姓名：郭兆峰
成绩：
基因工程
摘要：基因工程是20世纪70年代在分子遗传学、细胞生物学基础上发展起来的，是一种可以按照人们的意愿设计、改造和组建生物品种的新技术。

包括它通过基因操作，将目的基因活DNA片段与合适的载体连接转入目标生物细胞，通过复制、转录、翻译外源目的基因以及蛋白质的活性表达，使转基因生物获得新的遗传性状。

关键词：生物技术；基因工程
一、基因工程的诞生：
从20世纪40年代开始，受分子生物学、分子遗传学发展的影响，基因分子生物学取得巨大进步，为基因工程的诞生奠定了基础。

现在人们公认的诞生日期是1973年，其中现代分子生物学领域上的三大发现及技术上的三大发明起了决定性作用。

理论上的三大发现包括：第一，20世纪40年代，Avery 在美国的一次学术会上报道了肺炎球菌的转化，证明了遗传信息的携带者是DNA而不是蛋白质；第二，1953年，Watson 和 Crick 提出的DNA 分子的双螺旋结构以及半保留复制机理，解决了基因的自我复制和传递问题；第三，20世纪50年代末的“中心法则”，60年代由Monod 和Jacob 提出的操纵分子学说，并成功的由一批科学家破译了遗传密码从而阐明了遗传信息的流向和表达问题。

以上问题的解决使得人们自主改造生物遗传性状从理论上成为现实。

技术上的三大发明：第一，1967年发现的DNA连接酶，以及1979年发现的具有更高活性的T4 DNA连接酶。

在1970年Smith和Wilcox从流感嗜血杆菌中分离并纯化的限制性核酸内切酶HindⅡ和1972年发现的EcoRⅠ核酸内切酶。

后来发现的大量的限制性核酸内。