值得关注的线粒体12SrRNA C1494T突变——药物敏感致聋靶点

值得关注的线粒体12SrRNA C1494T突变——药物敏感致
聋靶点
王秋菊;韩明鲲;刘晓雯;鲍晓林;赵亚丽;王大勇;兰兰;赵翠;韩东一
【摘要】目的探讨线粒体12SrRNA C1494T突变与氨基糖苷类药物致聋的临床表型特征的相关性,警示临床值得关注的又一药物致聋敏感靶点.方法对遗传性聋资源库中两个具有母系遗传特征的耳聋大家系成员进行病史、体检、纯音测听及听性脑干反应检查并绘制系谱图.提取耳聋患者的外周血基因组DNA,运用聚合酶链扩增反应(polymerase chain reaction,PCR)方法对耳聋患者线粒体12SrRNA基因1 228～1 984位序列(涵盖12SrRNA 1494及1555位点)进行扩增,扩增产物纯化后进行限制性酶切鉴定或测序,运用DNAStar软件对测序结果进行比对分析.结果两个家系分别为一个四代相传的母系遗传家系(196家系)和一个三代相传的母系遗传性耳聋家系(1 802家系).196家系发现8名12SrRNA C1494T携带者,其中3名在接触氨基糖苷类药物后出现重度耳聋.成为聋哑人(Ⅱ:2、Ⅱ:5、Ⅲ:2);2名无耳毒性药物用药史者(Ⅱ:9、Ⅱ:7),表现为高频听力损失,言语发育正常;1名患者25岁时应用链霉素后致重度耳聋,现交流困难(Ⅱ:3);1名突变者现为2岁幼儿,目前对声音反应正常(Ⅳ;1);1名为听力正常人(Ⅲ:3).现年28岁.1 802家系发现12名耳聋患者,其中7名患者为母系后代,全部为聋哑,配偶聋哑人5名.1 802家系中母系后代成员10名(3名男性,7名女性),其中7名为聋哑患者(2名男性,5名女性).3名为听力正常人(1名男性,2名女性).7名母系后代患者中有4名有明确的耳毒性药物用药史(奎宁、链霉素或庆大霉素),3名用药史不详.2名母系患者进行基因检测发现线粒体12SrRNA C1494T突变.结论本研究通过两个线粒体12SrRNA C1494T突变家系警示线粒体12SrRNA C1494T突变又是一个值得非常关注的药物敏感作用靶点.具有此突变的患者接触氨基糖苷类药物会产生重度耳聋,而未接触该药物者可以是正
常听力或是高频听力下降者.临床要高度警示线粒体12SrRNA C1494T突变患者,早发现、早预警可避免聋哑患者的出现.
【期刊名称】《听力学及言语疾病杂志》
【年(卷),期】2008(016)006
【总页数】5页(P446-450)
【关键词】线粒体12SrRNA C1494T突变;线粒体DNA;氯基糖苷类抗生素;母系遗传
【作者】王秋菊;韩明鲲;刘晓雯;鲍晓林;赵亚丽;王大勇;兰兰;赵翠;韩东一
【作者单位】解放军总医院耳鼻咽喉-头颈外科,解放军耳鼻咽喉科研究所,北
京,100853;国家人类基因组北方研究中心;解放军总医院耳鼻咽喉-头颈外科,解放军耳鼻咽喉科研究所,北京,100853;兰州大学第二医院耳鼻咽喉-头颈外科;兰州大学第二医院耳鼻咽喉-头颈外科;解放军总医院耳鼻咽喉-头颈外科,解放军耳鼻咽喉科研究所,北京,100853;中国医学科学院中国协和医科大学基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室;解放军总医院耳鼻咽喉-头颈外科,解放军耳鼻咽喉科研究所,北京,100853;解放军总医院耳鼻咽喉-头颈外科,解放军耳鼻咽喉科研究所,北
京,100853;国家人类基因组北方研究中心;解放军总医院耳鼻咽喉-头颈外科,解放军耳鼻咽喉科研究所,北京,100853
【正文语种】中文
【中图分类】R764.3
2004年赵辉等[1]在中国锦州一个母系遗传性耳聋大家系中发现线粒体12SrRNA
C1494T突变是一个新的与药物性耳聋和非综合征型耳聋相关的线粒体DNA突变，该突变导致线粒体DNA高度保守的12SrRNA中1 494位点C突变为T(C1494T)，形成了一个新的U1494-1555A碱基对，与药物性耳聋相关的A1555G突变所形
成的C1494-1555G碱基对结构相似，因此而产生对氨基糖苷类药物的敏感性。

那么，线粒体12SrRNA C1494T突变是否也是一个常见的药物敏感致聋靶点？该突变在临床表型特征上有无特点？是否要在临床上常规检测该突变的存在以起到重要的预警作用？本研究又发现了两个母系遗传性耳聋家系，进行了两家族线粒体
12SrRNA C1494T突变检测，并分析了临床表型特征，为临床聋病医学诊断工作
提供了一些有意义的启示。

1 资料与方法
1.1 家系资料的采集本研究家系的调查由解放军总医院耳鼻咽喉研究所完成，对
于该项目的伦理论证由解放军总医院伦理委员会认可。

研究中发现的家系位于黑龙江省某市及云南省某县，两个耳聋家系分别命名为196和1 802家系。

研究中对
签写知情同意的家系成员抽取外周静脉血5～10毫升用于基因组和线粒体 DNA
的提取及保存。

1.2 临床听力学检测应用Madsen 502便携式听力计(丹麦)，耳机为EAR-3A插
入式耳机(美国)进行家系成员的纯音测听检查，初步判断听力损失程度；应用Madsen901(丹麦)声导抗检测仪进行鼓室导抗图及镫骨肌反射的检测，了解中耳
传导状况；应用便携式听性脑干诱发电位仪(SmartEP Intelligent Hearing Systems, America.)进行听性脑干反应检测。

1.3 耳聋表型的分析判断标准听力损失程度按照两耳中听力较好耳的平均听阈(0.5、1、2、4 kHz听力水平的平均值)来评估：<20 dB HL为听力正常；20～40 dB
HL为轻度听力损失；41～70 dB HL为中度听力损失；71～95 dB HL为重度听
力损失；>95 dB HL为极重度听力损失。

耳聋表型根据听力损失的频率分为：高
频听力损失型(2～8 kHz为主)；低频听力损失型(0.25 kHz为主)；覆盆(中间)听力损失型(0.25～2 kHz为主)；全频听力损失型(0.25～4 kHz)。

1.4 基因组DNA提取应用改良Miller法抽提人白细胞基因组DNA，琼脂糖电泳和紫外分光光度计定量和纯度分析；分装后入库，-20°保存。

实验时将基因组稀释为100 ng/ μl置于4℃冰箱内备用。

1.5 引物设计应用在线引物设计软件—Primer3.0设计引物。

对线粒体12SrRNA 基因1 228～1 984位点设计引物。

上游引物为MtF2：5’-TCAACCTCACCACCTCTT-3’、下游引物为MtR2：5’-TTTGTCGCCTCTACCTAT -3’。

1.6 PCR反应体系本研究中应用25 μl的PCR反应体系：10×Buffer
2.5 μl，2.5 mmol/L dNTP
3.0 μl，10 μmol/L primers 1 μl，Taq酶1 μl，基因组DNA 100 ng 1 μl，加去离子水至25 μl体积。

1.7 PCR反应条件95℃预变性5分钟，95 ℃变性30秒, 62℃退火30秒, 72 ℃延伸30秒, 30 个循环,反应结束后72 ℃延伸7 min ,4 ℃保存。

1.8 测序取3 μl PCR产物进行琼脂糖电泳检测PCR产物，产物条带单一时可以将PCR 产物在ABI 3730 DNA测序仪上进行直接测序。

PCR产物纯化：将含有PCR 产物的MultiScreen PCR板抽真空，加入去离子水，静置，随后将MultiScreen PCR板置于混合器上震荡，纯化后的PCR产物重新溶解后转移至另一洁净的96孔板中。

测序引物与PCR扩增引物相同，在ABI9700热循环仪上进行测序反应。

反应结束后，延伸产物上样于ABI PRISM 3730DNA序列分析仪进行测序。

1.9 序列分析应用DNAStar (Lasergene Inc.)软件包中的SeqmanTM软件进行测序序列的对比分析，即将测序得到的序列与NCBI检索到的线粒体剑桥标准序列进行比对分析。

2 结果
本研究的两个家系分别为黑龙江省某市的196家系和云南省某县的1 802家系。

利用Cyrillic2.0软件构建两个家系图谱(见图1、图2)，初步判断两个家系的耳聋
发病符合母系遗传方式。

图1 196家系图谱
图2 1 802家系图谱
2.1 196家系图谱绘制及家系特征[3]
196家系为4代遗传的耳聋家系，该家系现有20人，其中有9名母系成员，8名耳聋患者，除2名(Ⅱ:1；Ⅱ:10)由于婚姻关系进入该家系外，其余6名均为该家
系的母系成员(Ⅰ:2；Ⅱ:2；Ⅱ:3；Ⅱ:5；Ⅱ:9；Ⅲ:2)。

经直接测序检测，该家系共发现8名12SrRNA C1494T携带者，其中3名在接触氨基糖苷类药物后成为聋哑人(II:2；II:5；Ⅲ:2)；2名(II:9；II:7)无耳毒性用药史，表现为高频听力损失，言语发育正常；1名患者在25岁(II:3)时应用链霉素后而至重度耳聋，现交流困难；1
名(IV:1)现为2岁幼儿，目前对声音反应正常；1名为听力正常人(III:3)，现年28岁。

表1和图3总结了该家系部分母系成员的临床病史资料、基因检测结果和临
床听力学表型。

2.2 1 802家系图谱绘制及家系特征
1 802家系为3代遗传的耳聋家系，现有家系成员17人，其中12名为耳聋患者，除由于婚姻关系成为该家系成员的5名耳聋患者外，剩余的7名患者均为母系家
庭成员。

其中5名聋哑患者为第二代同胞兄妹(II:2；II:4；II:6；II:8；II:10)，在5
名同胞兄妹中II:2和II:4是在3岁以前分别使用奎宁和青链霉素后出现耳聋；2名为第三代聋哑患者(III:1；III:3)，在2岁时使用链霉素和庆大霉素后出现耳聋，而III:3的同胞姐姐III:2现为听力正常人。

表2总结了1 802家系中部分母系成员的
临床资料和基因检测结果。

2.3 线粒体DNA 12SrRNA C1494T突变检测结果
线粒体DNA 12SrRNA 检测发现了两家系均为线粒体DNA 12SrRNA C1494T突变导致的母系遗传性耳聋。

其中196家系人员9名I:2, II:2,3,5,7,9, III:2,3, IV:1；1 802家系成员9名I:2, II:2,4,6,8,10, III:1,2,3。

患者的线粒体DNA 12SrRNA 15555位碱基序列正常(图4)。

3 讨论
本研究中，在母系遗传性耳聋的196家系和1 802家系的母系成员中检测到线粒体12SrRNA C1494T的均质性突变是导致两家系出现重度耳聋和聋哑的原因。

通过临床病史、听力学结果和基因检测结果推测发现，两个家系中共有18名为线粒体12SrRNA C1494T突变人员，这些携带者中有13名发生了耳聋，其中196家系有6名患者，1 802家系有7名患者，13名患者中有8名有基因检测的结果，均为12SrRNA C1494T突变，其他人员可以推测亦为此种突变(母系遗传特点)。

表1 196家系线粒体DNA 12SrRNA C1494T阳性患者的临床资料和基因检测结果编号性别检测年龄(岁)发病年龄(岁)用药史耳聋表型听力损失程度基因检测结果(1494C→T)II:2女516链霉素高频听力损失型极重度阳性II:3男4425链霉素平坦型极重度阳性II:5男5614链霉素高频听力损失型中度阳性II:7男45无无用药高频听力损失型中度阳性II:9男484无用药高频听力损失型重度阳性III:2女322庆大霉素/小诺霉素高频听力损失型重度阳性III:3男28无无用药正常正常阳性IV:1女2无无用药正常正常阳性
图3 196家系母成员线粒体DNA12SrRNA C1494T阳性患者听力图表2 1 802家系部分母系成员的临床资料和基因检测结果
编号发病年龄(岁)用药史用药剂量(支)听力损失程度基因检测结果(1494C→T)II:23奎宁1极重度阳性II:42青链霉素1极重度阳性II:6<3不详不详极重度未检测
II:8<3不详不详极重度未检测II:10<3不详不详极重度未检测III:12链霉素1极重
度未检测III:32庆大霉素1极重度未检测
图4 线粒体DNA12SrRNAC1494T突变序列和正常序列比较图
在发生耳聋的患者中，除1名患者在3岁时肌注1支奎宁后出现重度耳聋，3名
患者缺乏明确的用药史以外，其余9名耳聋患者均有明确的氨基糖苷类抗生素应
用史，氨基糖苷类抗生素的应用在耳聋的发病中起到了很重要的作用。

其次，9名耳聋患者的耳聋表型符合耳毒性药物致聋的听力学表现即：以高频听力损失为主的双耳对称性的听力下降，听力损失程度为重度-极重度至全聋[4]。

以上结果显示两个家系成员的耳聋与氨基糖苷类抗生素的应用密切相关。

本研究中还发现，在没有耳毒性药物应用的情况下，196家系的母系成员II:7，现年45岁，听力检查仅发现8 kHz听阈下降至50 dB HL，其余频率听力正常，但
是其同胞哥哥II:9在4岁时即出现听力下降，在本次检查中患者双耳高频听力完
全丧失，低频听阈在65 dB HL左右，临床诊断为重度听力损失。

目前，在这两个家系中的3个年龄分别为28岁、2岁和3岁的母系成员(196家系的III:3和IV:1，1 802家系的III:4)为听力正常的线粒体DNA C1494T突变携带者。

但是这些成员一旦用药则有极高的几率发生耳聋，要高度警示。

回顾线粒体DNA12SrRNA A1555G突变患者的听力学特点发现，自从1993年Prezant等[5]首次发现线粒体A1555G与氨基糖苷类抗生素致聋和非综合征型耳
聋密切相关以来，随后的研究发现，在没有氨基糖苷类抗生素应用的情况下，
A1555G突变可以导致不同表现型的听力下降，即从正常听力至极重度听力损失[6]。

而对于上述现象的解释目前主要认为与线粒体的致病特点有关，即在部分携
带者中，突变本身尚不直接导致表型的出现，需要其它因素共同作用，如：环境因素，细胞核基因的差别以及其它线粒体基因的共同作用[7，8]。

而氨基糖苷类抗生素诱发或加重耳聋的程度使环境因素在耳聋的发病方面显得更为突出，另外，对线粒体12SrRNA基因功能有影响的核修饰基因可能会使C1494T突变的生化缺陷增
强，使该突变携带者听力下降，而这种核修饰基因也可以抑制该突变的作用而使该成员听力正常[9]。

但是，其真正的作用机理还不是很清楚。

药物性耳聋的治疗目前更是一个难题。

因此，如何积极有效的预防耳聋的发生和发展显得迫切和需要。

本研究提示，与线粒体DNA12SrRNA A1555G一样，C1494T突变或许也是一个在中国人群中常见的药物敏感致聋靶点。

因此，对具有母系遗传耳聋病史或药物中毒性耳聋的患者，在排除常见的线粒体DNA A1555G突变的基础上，进行常规的C1494T突变筛查，不仅可以对该患者进行准确的分子病因学诊断，为以后的治疗和康复提供依据，也可以通过有效的遗传咨询给予其家族内的母系成员早期的预防和干预，降低耳聋的发生。

4 参考文献
1 Zhao H, Li R, Wang Q, et al. Maternally inherited aminoglycoside-induced and nonsyndromic deafness is associated with the novel C1494T mutation in the mitochondrial 12S rRNA gene in a large Chinese family[J]. Am J Hum Genet,2004,74:139.
2 王秋菊，顾瑞.关于非综合征型遗传性听损伤家系遗传学及听力学描述术语建议案[J].中华耳科学杂志，2003，1：46.
3 Wang Q, Li QZ, Han D, et al. Clinical and molecular analysis of a four-generation Chinese family with aminoglycoside-induced and nonsyndromic hearing loss associated with the mitochondrial 12S rRNA
C1494T mutation[J]. Biochem Biophys Res Commun,2006,340:583.
4 黄兆选,汪吉宝. 实用耳鼻咽喉科学[M]. 北京: 人民卫生出版社, 1998.981～983.
5 Prezant TR, Agapian JV, Bohlman MC, et al. Mitochondrial ribosomal RNA mutation associated with both antibiotic-induced and non-syndromic deafness[J]. Nat Genet,1993,4:289.
6 Estivill X, Govea N, Barceló E,et al.Familial progressive sensorineural deafness is mainly due to the mtDNA A1555G mutation and is enhanced by treatment of aminoglycosides[J]. Am J Hum Genet，1998， 62:27.
7 Finsterer J, Fellinger J. Nuclear and mitochondrial genes mutated in nonsyndromic impaired hearing[J].Int J Pediatr Otorhinolaryngol，2005，69:621.
8 Li R, Xing G, Yan M, et al. Cosegregation of C-insertion at position 961 with A1555G mutation of mitochondrial 12SrRNA gene in a large Chinese family with maternally inherited hearing loss[J]. Am J Hum Genet，2003，124:113.
9 Guan MX, Fischel-Ghodsian N, Attarde G. Biochemiacal evidence for nuclear gene involvement in phenotype of non-syndromic deafness associated with mitochondrial 12S rRNA mutation[J].Hum Mol Genet，1996 5:963.。