Real-Time PCR操作手册 0904
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成引物。
7 合成引物： 送往 Sangon 合成引物，大约需三个工作日。
8 引物稀释： 原液 100 μM 工作液 5 μM mixture Forwad primer Reverse primer ddH2O
5 μl 5 μl 90 μl
三） 推荐反应体系
试剂 2 × SYBR Green PCR Master mix cDNA (1-100 ng RNA 反转录所得 cDNA) H2O 5 μM Primer mix 终体积
此时可以设计 Real-time PCR 反应程序，点击兰色行的加号添加反应循环步骤，点击白色行加号添加每 一个循环内的步骤。 上图为 real-time PCR 的默认程序， ① 将第二个循环中第一步 95℃的时间调整为 15 秒，第二步改为 60℃（这些条件都需要根据所用的试 剂不同做出相应的调整）， ② 另外我们需要添加熔解曲线步骤，点击红圈标出的加号，添加第三个循环，并把 dwell time 改为 1， setpoint 列改为 95℃， ③ 再点击加号添加第四个循环，并把 dwell time 改为 1，setpoint 列改为 55℃，
5 选择引物序列： 打开 Map 标签页，查看找到的引物序列，此时引物有红蓝两色显示，在 optimal primer pairs only 前
打勾，则只显示红色并基本上按得分高低排列引物，此时尽可能选择靠近 3’端的引物；再打开 Result 标签页，复制 Forwad primer 和 Reverse primer 序列到 Word 文档中，比对引物查看其是否跨越至少 1 个 外显子，再打开 Primer 标签页查看选中的序列的罚分值，若引物正好跨越外显子，且得分比较低（红 色基本可用）则可用。
Real-Time PCR 操作手册
一 实验原理
工业化理念 实时检测 基于全管检测，对引物的特异性有近乎苛刻的要求
二 引物设计与工作液准备
软件：Primer Express 2.0 原则 尽量靠近 3’ 端
需跨越至少 1 个外显子 引物长度 20 左右 产物长度 100~150 bp 推荐网站：PrimerBank
点 下一步/ Add plate：查找到要分析的 Plate， 如
点 完成 即可 结果如下：
点红圈中绿键可进行分析条件的设定，一般将 Menual Baseline 修改为 End：10
点 Ok 即可 GAPDH 一般这样可
其余一般自动识别，横线在短曲线上方即可，例：
选中所有基因，点绿键开始分析，在 Gene Expression 中可见柱状分析图
设计好后出现如下界面：
最后点击 save/edit plate editting 并保存至指定文件夹后退出反应板设计。 设计完后可以点击 plate summary 检查设置的反应孔信息。
3 如下的界面为非联机状态下的界面，在联机状态下点击 run，会弹出类似于如下的界面（只是模拟图）：
点击 begin run 按钮，弹出保存结果的界面，可以将结果保存至指定文件夹，程序即开始运行。
用量 (μl) 10 1 7 2 20
终浓度 1× 500 nM
四） 配制 mix 原则 为保证各个复孔（每样至少 3 个）的重复性，特别是在分析多模板和/或多基因（引物）的表达变
化时，必须制备不同层次的 mix，此时一定要遵循从模板到引物的原则，就是必须最先将模板做到 mix 中，而引物则尽可能地放到最后才加入到反应体系，只有这样才能使各复孔间的差异降到最低。
3 修改参数： 将 Params 标签页中最下方的默认 min length 由 50 改为 100，其它参数保持不变。修改此选项后就
会被程序记住，无需再点按任何按钮，即可直接进行下一步。
4 查找引பைடு நூலகம்序列： 回到 Sequence 标签页，鼠标左键选中所有序列后，执行菜单栏的 Options/Find primers now/命令。
2 设计 real-time 反应板模式： 点击第一个界面图中的 plate 可以开始设计反应板模式，同样可以新建一个反应板或者更改已有的反应 板模式，点击 create new 后开始新建，出现如下界面：
首先点击 select/add fluorophores（红圈部分），弹出：
我们所用的荧光为 SYBR1，所以在 SYBR1 后打勾，点击 OK，回到上一个界面， 孔，但不会改变其属性
三 上机操作与数据分析
（一） ABI 7500 部分 检测引物——上机做溶解曲线
新合成的引物是否能用和好用需要做溶解曲线,如果溶解曲线结果出来是单个的峰,这是好用的,若有两 个峰出现,则需要优化条件,如升高反应温度,使出现单个峰才可使用.
具体操作: 打开 7500 system SDS software File/ new/
（2）或者从 Gene ID 页面打开各目的基因相应的 Ensemble 页面，寻找并打开此页面中的[exon info] 链接，可以一步得到该基因所有外显子/内含子的序列信息，标记的方法同上。
注：查找比对序列过程中仔细小心以避免出现错误；另外，如果 exon 序列与全长序列有不一样的 地方，需要标记出来，将来设计引物时需避开。
双峰需调整!
做完溶解曲线后可进行正式的实验了 基本操作相似, 打开 7500 system SDS software File/ new/
板的设计原则基本与上相同
注意要设定内参,本室用的一般为 GAPDH,其余都标记的为 T:target,而 GAPDH 需选择 ENDO,标记为 E
点完成即可, 左键双击出现 Sample Name, 输入所需名称即可,例: 输入 L.输入完毕点 Close,则板子设定 完毕。
分析结果：
运行完程序得到结果，可以对其进行分析 下图为 real-time PCR 结果图形显示：
下图为熔解曲线图： 点击 analyze well 弹出如下界面，黄色框圈出选中的反应孔，可以对单个反应孔进行分析：
例如，选中 B3 孔，即反应孔 1 点击 OK 后，会出现反应孔 1 的 real-time PCR 图 此图显示结果表示引物可以扩增出目的基因，如下图所示时，表示引物不能扩增出目的基因：
一） 准备工作 1 查找并保存待检测的目的基因核苷酸序列：
NCBI/search Nucleotide For 目的基因 选择所需物种的对应 Gene ID，打开链接找到 mRNA and Protein，打开 NM-（ID）查找目的基因的 mRNA 序列
Display FASTA，即可得到目的基因的核苷酸序列
④ 最后添加第五个循环，并把 dwell time 设为 0:10，setpoint 列设为 55℃，并把 PCR/Melt data Acquisition
列改为 melt curve，设计好程序后会出现如下界面：
最后点击右上角的 save/edit protocol editting，弹出 save protocol 框，可以将设计好的程序保存在指定的 文件夹下，然后可以退出反应程序设定步骤。
二） 设计引物 1 创建 txt 文档：
打开 Word 文档，将最后几个外显子的序列复制粘贴到新创建的.txt 文档中.
2 引物设计软件： Primer Express 2.0 为专门设计 Real time 引物的软件，启动软件后，选择 File/ New/DNA PCR
Document，可出现 DNA PCR #1 界面，点按 Sequence 标签页的 Import DNA File 按钮，将已保存在 txt 文档中的序列导入设计软件。
下一步 选择所需检测的基因/Add 注意：本实验室所用的检测荧光为 SRBR
若列表中没有所需的基因名称，则需要自己添加。
New Detecteor 输入所需名称，选择 Reporter Dye: SYBR/OK 并将之添加到 Detectors in Documet 中/ 下一步
鼠标左键选中所需要标记的基因，在 Detector 基因前打勾标记 同样标记上 Z1 基因， 另设定 GAPDH 为内参，点 Task 中的下拉框,选择 standard, 此时版中标记为 S.点完成则 plate 设定完 毕.
序列保存到 Word 文档，利用查找替换功能去除所有段落标记并保存
2 查找目的基因的外显子和内含子信息： （1）在上述页面上找到此基因的 gene ID 并打开链接，Display gene Table
查到 EXON 信息，点开倒数第 2 个 exon，得到相应的序列，利用查找功能将这一段序列在完整序列中 标记出；利用同样的方法点开倒数第 4、6、8……个 exon，间隔标记其它外显子。
这时引物可用,如果如果出现双峰,说明引物之间也有二聚体形成，此时需要优化条件,如升高反应温度, 使出现单个峰才可使用. 具体操作流程： 打开 Bio-Rad/iQ5 此时会出现如下界面：
1 设计 real-time 反应程序： 点击左上角的 protocol（红圈部分），此时下方的 selected protocol 被绿框圈出，点击 create new 可以新 建 protocol，点击 edit 则可以更改已有的 protocol 程序。点击 create new 出现：
点柱状区右键，出现 Graphsettings 可惜该条件是柱状图更利于观看.
如将 Maximum 改为 3 后，结果如下： 可作为最后结果使用。
基本操作如上，具体细节可参考 ABI 公司的相对定量操作手册以及相关的参考文献。
（二） Bio-Rad iQ5 部分 检测引物
在检测引物时需进行两步实验：real-time PCR 和做熔解曲线 real-time PCR 是为了检测设计出的引物是否能够合成目的基因，而熔解曲线是为了检测设计的引物之间 是否会形成二聚体而影响 PCR 结果的判断。 结果判断：如果熔解曲线结果是单峰,则说明仅有目的基因形成二聚体，而引物之间不会形成二聚体，
当点击 melt curve/peak（红圈标出部分）则可以显示其熔解曲线图，如： 如图中显示熔解曲线为单峰时表示引物可用，而出现双峰或无峰时表示引物不可用，如：
对每个反应孔进行分析，判断每个引物是否可用。
目的基因的结果分析：
根据溶解曲线确定能用的引物后开始进行目的基因的 PCR 实验，前面的反应程序和反应板的设计过程 与前面相同，反应运行完成后，打开 iO5 软件，出现如下界面：
可以定义标准品
可以选择反应
可以定义未知样品
可以定义阴性对照
可以定义阳性对照 可以进行群设置
可以删除此反应孔对应的当前荧光染料的设置
可以删除此反应孔所对应的所有荧光染料的设置
点击模式板上方的 ，开始添加样品，并且可以在界面下方的 identifer/condition 栏对每个孔的样品 进行标注。注意，反应孔必须与预先设计的板型完全一致。 然后分别更改 sample volume、seal type 和 vessel type 为 25、film 和 strips（指 real time 专用的八联管）。
接下来需要对 Instrument 条件作一些修改
1 由于我们不需要 Stage 1,所以左键选择 Stage1 区域, 用 Delete 键可取消之 2 修改 Sample Volumn,本室一般为 20 μl 3 保存设定于文件夹中 点击 Start 即可开始采集信息 结果分析在 Results 中/Dissociation 单峰可用!
下一步则需修改 Instrument 条件：同上
1 去掉 Stage 1 2 修改体积 3 保存设定于相应文件夹中 将 96 孔板放入机器中 点击开始则计算机开始采集信息！ 约 1.5 小时后，试验结束即可分析结果。 结果分析 打开 7500 system SDS software File/ new/
注：1）若没有红色引物，则需另外选择区域，向 5’端顺延，如倒数第三、第四个外显子等。 2）若始终没有合适区域，需设计两条蓝色引物。
6 保存引物序列： 回到 Results 标签页，复制并保存上下游引物序列至 Word 文档。 至此，引物设计步骤即完成，将设计好的引物保存在实验室的引物清单中，即可将序列送至公司合
7 合成引物： 送往 Sangon 合成引物，大约需三个工作日。
8 引物稀释： 原液 100 μM 工作液 5 μM mixture Forwad primer Reverse primer ddH2O
5 μl 5 μl 90 μl
三） 推荐反应体系
试剂 2 × SYBR Green PCR Master mix cDNA (1-100 ng RNA 反转录所得 cDNA) H2O 5 μM Primer mix 终体积
此时可以设计 Real-time PCR 反应程序，点击兰色行的加号添加反应循环步骤，点击白色行加号添加每 一个循环内的步骤。 上图为 real-time PCR 的默认程序， ① 将第二个循环中第一步 95℃的时间调整为 15 秒，第二步改为 60℃（这些条件都需要根据所用的试 剂不同做出相应的调整）， ② 另外我们需要添加熔解曲线步骤，点击红圈标出的加号，添加第三个循环，并把 dwell time 改为 1， setpoint 列改为 95℃， ③ 再点击加号添加第四个循环，并把 dwell time 改为 1，setpoint 列改为 55℃，
5 选择引物序列： 打开 Map 标签页，查看找到的引物序列，此时引物有红蓝两色显示，在 optimal primer pairs only 前
打勾，则只显示红色并基本上按得分高低排列引物，此时尽可能选择靠近 3’端的引物；再打开 Result 标签页，复制 Forwad primer 和 Reverse primer 序列到 Word 文档中，比对引物查看其是否跨越至少 1 个 外显子，再打开 Primer 标签页查看选中的序列的罚分值，若引物正好跨越外显子，且得分比较低（红 色基本可用）则可用。
Real-Time PCR 操作手册
一 实验原理
工业化理念 实时检测 基于全管检测，对引物的特异性有近乎苛刻的要求
二 引物设计与工作液准备
软件：Primer Express 2.0 原则 尽量靠近 3’ 端
需跨越至少 1 个外显子 引物长度 20 左右 产物长度 100~150 bp 推荐网站：PrimerBank
点 下一步/ Add plate：查找到要分析的 Plate， 如
点 完成 即可 结果如下：
点红圈中绿键可进行分析条件的设定，一般将 Menual Baseline 修改为 End：10
点 Ok 即可 GAPDH 一般这样可
其余一般自动识别，横线在短曲线上方即可，例：
选中所有基因，点绿键开始分析，在 Gene Expression 中可见柱状分析图
设计好后出现如下界面：
最后点击 save/edit plate editting 并保存至指定文件夹后退出反应板设计。 设计完后可以点击 plate summary 检查设置的反应孔信息。
3 如下的界面为非联机状态下的界面，在联机状态下点击 run，会弹出类似于如下的界面（只是模拟图）：
点击 begin run 按钮，弹出保存结果的界面，可以将结果保存至指定文件夹，程序即开始运行。
用量 (μl) 10 1 7 2 20
终浓度 1× 500 nM
四） 配制 mix 原则 为保证各个复孔（每样至少 3 个）的重复性，特别是在分析多模板和/或多基因（引物）的表达变
化时，必须制备不同层次的 mix，此时一定要遵循从模板到引物的原则，就是必须最先将模板做到 mix 中，而引物则尽可能地放到最后才加入到反应体系，只有这样才能使各复孔间的差异降到最低。
3 修改参数： 将 Params 标签页中最下方的默认 min length 由 50 改为 100，其它参数保持不变。修改此选项后就
会被程序记住，无需再点按任何按钮，即可直接进行下一步。
4 查找引பைடு நூலகம்序列： 回到 Sequence 标签页，鼠标左键选中所有序列后，执行菜单栏的 Options/Find primers now/命令。
2 设计 real-time 反应板模式： 点击第一个界面图中的 plate 可以开始设计反应板模式，同样可以新建一个反应板或者更改已有的反应 板模式，点击 create new 后开始新建，出现如下界面：
首先点击 select/add fluorophores（红圈部分），弹出：
我们所用的荧光为 SYBR1，所以在 SYBR1 后打勾，点击 OK，回到上一个界面， 孔，但不会改变其属性
三 上机操作与数据分析
（一） ABI 7500 部分 检测引物——上机做溶解曲线
新合成的引物是否能用和好用需要做溶解曲线,如果溶解曲线结果出来是单个的峰,这是好用的,若有两 个峰出现,则需要优化条件,如升高反应温度,使出现单个峰才可使用.
具体操作: 打开 7500 system SDS software File/ new/
（2）或者从 Gene ID 页面打开各目的基因相应的 Ensemble 页面，寻找并打开此页面中的[exon info] 链接，可以一步得到该基因所有外显子/内含子的序列信息，标记的方法同上。
注：查找比对序列过程中仔细小心以避免出现错误；另外，如果 exon 序列与全长序列有不一样的 地方，需要标记出来，将来设计引物时需避开。
双峰需调整!
做完溶解曲线后可进行正式的实验了 基本操作相似, 打开 7500 system SDS software File/ new/
板的设计原则基本与上相同
注意要设定内参,本室用的一般为 GAPDH,其余都标记的为 T:target,而 GAPDH 需选择 ENDO,标记为 E
点完成即可, 左键双击出现 Sample Name, 输入所需名称即可,例: 输入 L.输入完毕点 Close,则板子设定 完毕。
分析结果：
运行完程序得到结果，可以对其进行分析 下图为 real-time PCR 结果图形显示：
下图为熔解曲线图： 点击 analyze well 弹出如下界面，黄色框圈出选中的反应孔，可以对单个反应孔进行分析：
例如，选中 B3 孔，即反应孔 1 点击 OK 后，会出现反应孔 1 的 real-time PCR 图 此图显示结果表示引物可以扩增出目的基因，如下图所示时，表示引物不能扩增出目的基因：
一） 准备工作 1 查找并保存待检测的目的基因核苷酸序列：
NCBI/search Nucleotide For 目的基因 选择所需物种的对应 Gene ID，打开链接找到 mRNA and Protein，打开 NM-（ID）查找目的基因的 mRNA 序列
Display FASTA，即可得到目的基因的核苷酸序列
④ 最后添加第五个循环，并把 dwell time 设为 0:10，setpoint 列设为 55℃，并把 PCR/Melt data Acquisition
列改为 melt curve，设计好程序后会出现如下界面：
最后点击右上角的 save/edit protocol editting，弹出 save protocol 框，可以将设计好的程序保存在指定的 文件夹下，然后可以退出反应程序设定步骤。
二） 设计引物 1 创建 txt 文档：
打开 Word 文档，将最后几个外显子的序列复制粘贴到新创建的.txt 文档中.
2 引物设计软件： Primer Express 2.0 为专门设计 Real time 引物的软件，启动软件后，选择 File/ New/DNA PCR
Document，可出现 DNA PCR #1 界面，点按 Sequence 标签页的 Import DNA File 按钮，将已保存在 txt 文档中的序列导入设计软件。
下一步 选择所需检测的基因/Add 注意：本实验室所用的检测荧光为 SRBR
若列表中没有所需的基因名称，则需要自己添加。
New Detecteor 输入所需名称，选择 Reporter Dye: SYBR/OK 并将之添加到 Detectors in Documet 中/ 下一步
鼠标左键选中所需要标记的基因，在 Detector 基因前打勾标记 同样标记上 Z1 基因， 另设定 GAPDH 为内参，点 Task 中的下拉框,选择 standard, 此时版中标记为 S.点完成则 plate 设定完 毕.
序列保存到 Word 文档，利用查找替换功能去除所有段落标记并保存
2 查找目的基因的外显子和内含子信息： （1）在上述页面上找到此基因的 gene ID 并打开链接，Display gene Table
查到 EXON 信息，点开倒数第 2 个 exon，得到相应的序列，利用查找功能将这一段序列在完整序列中 标记出；利用同样的方法点开倒数第 4、6、8……个 exon，间隔标记其它外显子。
这时引物可用,如果如果出现双峰,说明引物之间也有二聚体形成，此时需要优化条件,如升高反应温度, 使出现单个峰才可使用. 具体操作流程： 打开 Bio-Rad/iQ5 此时会出现如下界面：
1 设计 real-time 反应程序： 点击左上角的 protocol（红圈部分），此时下方的 selected protocol 被绿框圈出，点击 create new 可以新 建 protocol，点击 edit 则可以更改已有的 protocol 程序。点击 create new 出现：
点柱状区右键，出现 Graphsettings 可惜该条件是柱状图更利于观看.
如将 Maximum 改为 3 后，结果如下： 可作为最后结果使用。
基本操作如上，具体细节可参考 ABI 公司的相对定量操作手册以及相关的参考文献。
（二） Bio-Rad iQ5 部分 检测引物
在检测引物时需进行两步实验：real-time PCR 和做熔解曲线 real-time PCR 是为了检测设计出的引物是否能够合成目的基因，而熔解曲线是为了检测设计的引物之间 是否会形成二聚体而影响 PCR 结果的判断。 结果判断：如果熔解曲线结果是单峰,则说明仅有目的基因形成二聚体，而引物之间不会形成二聚体，
当点击 melt curve/peak（红圈标出部分）则可以显示其熔解曲线图，如： 如图中显示熔解曲线为单峰时表示引物可用，而出现双峰或无峰时表示引物不可用，如：
对每个反应孔进行分析，判断每个引物是否可用。
目的基因的结果分析：
根据溶解曲线确定能用的引物后开始进行目的基因的 PCR 实验，前面的反应程序和反应板的设计过程 与前面相同，反应运行完成后，打开 iO5 软件，出现如下界面：
可以定义标准品
可以选择反应
可以定义未知样品
可以定义阴性对照
可以定义阳性对照 可以进行群设置
可以删除此反应孔对应的当前荧光染料的设置
可以删除此反应孔所对应的所有荧光染料的设置
点击模式板上方的 ，开始添加样品，并且可以在界面下方的 identifer/condition 栏对每个孔的样品 进行标注。注意，反应孔必须与预先设计的板型完全一致。 然后分别更改 sample volume、seal type 和 vessel type 为 25、film 和 strips（指 real time 专用的八联管）。
接下来需要对 Instrument 条件作一些修改
1 由于我们不需要 Stage 1,所以左键选择 Stage1 区域, 用 Delete 键可取消之 2 修改 Sample Volumn,本室一般为 20 μl 3 保存设定于文件夹中 点击 Start 即可开始采集信息 结果分析在 Results 中/Dissociation 单峰可用!
下一步则需修改 Instrument 条件：同上
1 去掉 Stage 1 2 修改体积 3 保存设定于相应文件夹中 将 96 孔板放入机器中 点击开始则计算机开始采集信息！ 约 1.5 小时后，试验结束即可分析结果。 结果分析 打开 7500 system SDS software File/ new/
注：1）若没有红色引物，则需另外选择区域，向 5’端顺延，如倒数第三、第四个外显子等。 2）若始终没有合适区域，需设计两条蓝色引物。
6 保存引物序列： 回到 Results 标签页，复制并保存上下游引物序列至 Word 文档。 至此，引物设计步骤即完成，将设计好的引物保存在实验室的引物清单中，即可将序列送至公司合