氯霉素单克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立

氯霉素单克隆抗体的制备及ELISA检测方法的建立
范素菊;杨兴东;高润
【摘要】本研究旨在建立检测动物源性食品中氯霉素(CAP)残留的间接竞争ELISA(ci-ELISA)方法.在CAP羟基(-OH)位点上引入活性基团羧基(-COOH)得到氯霉素半琥珀酸酯(CAP-HS);采用混合酸酐法将CAP-HS分别与BSA和OVA偶联合成人工免疫原CAP-HS-BSA和包被抗原CAP-HS-OVA,用CAP-HS-BSA免疫BALB/c小鼠,间接ELISA和ci-ELISA筛选细胞融合备用鼠;应用杂交瘤技术制备抗CAP单克隆抗体;以CAP单克隆抗体为基础、CAP-HS-OVA为检测原建立ci-ELISA方法.结果显示,试验成功筛选获得一株稳定分泌抗CAP抗体的杂交瘤细胞株(2C4),抗体效价为4.8×10-5,利用2C4腹水优化得到ci-ELISA最佳试验条件:0.4 μg/mL CAP-HS-OVA 37℃包被2 h;5％猪血清37℃封闭1 h;1∶6.4×104 CAP 单克隆抗体37℃孵育15min;1∶1 000羊抗鼠酶标二抗(GaMIgG-HRP)37℃孵育30 min;室温显色9 min.绘制的CAP残留ci-ELISA标准曲线为典型的S型,与4参数logit拟合曲线相吻合,半数抑制浓度(IC50)为0.53 ng/mL.添加回收试验结果显示,阴性鱼肉、牛奶的回收率分别为93.3％～96.6％和93.7％～96.8％,批内变异系数分别为2.3％～5.0％和2.2％～4.6％,批间变异系数分别为2.7％～4.1％和
2.3％～
3.6％.HPLC对比试验结果显示,ci-ELISA与HPLC的测定结果无显著差异.本试验成功建立了CAP的ELISA残留检测方法,该方法具有较高的灵敏度、准确度和精密度,可满足动物源性食品中CAP残留检测要求.
【期刊名称】《中国畜牧兽医》
【年(卷),期】2018(045)009
【总页数】9页(P2566-2574)
【关键词】氯霉素;残留检测;单克隆抗体;ci-ELISA
【作者】范素菊;杨兴东;高润
【作者单位】周口职业技术学院农牧工程学院,周口466000;周口师范学院食品药品检验检测中心,周口466001;周口师范学院食品药品检验检测中心,周口466001【正文语种】中文
【中图分类】S859.84
氯霉素(chloramphenicol，CAP)是一种广谱抗生素，其抗菌药效优良，能对各种细菌性动物疾病进行有效防治。

但CAP在动物源性食品中的残留可通过食物链进入人体，抑制人体的骨髓造血机能，可引起粒细胞缺乏症、血小板减少性紫癜、再生障碍性贫血等症，也可引发消化系统障碍，如食欲减退或废止、胃胀、腹泻和口腔炎症等，给人们的健康带来危害[1-2]。

中国和许多国家都明确规定禁止CAP用于动物源性食品中，并规定最大残留量为不得检出[3-5]。

随着中国对CAP监管力度的不断加强，CAP滥用逐渐减少，但CAP的违规添加仍时有发生[6-7]。

CAP 作为动物源性食品中残留问题较为突出的药物，针对其建立严格的检测方法已势在必行。

目前理化方法占CAP残留检测技术的主导地位[1-2,8]，但其具有样品前处理复杂、工作量大、耗时长、费用高、仪器设备昂贵、无法现场操作等缺点，不能很好的推广应用[9-11]。

而酶联免疫分析法(ELISA)用于检测兽药残留具有简便快速、高效稳定等优点，适合动物性食品残留的现场检测[12-13]。

本试验以检测抗原(CAP-OVA)及CAP单克隆抗体为基础，建立了检测CAP残留的间接竞争ELISA(ci-ELISA)方法，以期为动物源性食品中CAP的残留检测提供参考。

1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验动物、细胞及样品 SPF级的6～8周龄雌性BALB/c小鼠购自郑州大学医学院实验动物繁育中心，于周口师范学院神经转换医学实验室动物房喂养。

NS0骨髓瘤细胞由周口师范学院动物免疫学实验室保存。

阴性鱼肉购自周口市水产品批发市场；阴性牛奶样本为保质期内的蒙牛纯牛奶，经过周口市食品药品检验检测中心高效液相色谱法确证为阴性样本。

1.1.2 主要试剂及仪器 CAP购自Sigma公司；牛血清白蛋白(BSA)和鸡卵清蛋白(OVA)均购自Pierce公司；弗氏完全佐剂(FCA)、弗氏不完全佐剂(FIA)、选择培
养基HAT、聚乙二醇(PEG-1500)R/MINI-1640细胞培养基、HT培养基均购自Gibco公司；N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N，N-二环己基碳二亚胺(DCC)均购自Fluka公司；CAP琥珀酸钠(CAP-HS)购自上海阿拉丁公司；羊抗鼠酶标二抗(GaMIgG-HRP)购自上海华美生物公司；四甲基联苯胺(TMB)购自上海五联化工厂；其他试剂均为分析纯。

AR224CN电子天平购自上海奥豪斯仪器有限公司；Bio-Rad 550型酶标仪购自Bio-Rad公司；3701型CO2细胞培养箱购自Precision
公司；L600高效液相色谱仪购自北京普析通用仪器有限公司。

1.2 方法
1.2.1 CAP免疫原的合成混合酸酐法制备免疫原(CAP-HS-BSA)和包被原(CAP-HS-OVA)。

称取17.8 mg CAP半抗原(CAP-HS)加入2 mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，溶解后加入26.2 μL氯甲酸异丁酯与14.4 μL三正丁胺，避光条件下，冰浴，搅拌反应180 min。

称取66 mg BSA溶解到6 mL 0.01 mol/L PBS
缓冲液(pH 6.5)中，将上述反应液缓慢逐滴加入BSA溶液中，冰浴，搅拌反应9 h。

将反应液用0.01 mol/L PBS缓冲溶液连续透析9次，然后离心、分装，-20 ℃保存备用。

CAP-HS-OVA的制备过程与CAP-HS-BSA相同，其中OVA准确称取
43 mg(浓度为5.1 mg/mL)。

利用紫外分光光度计(UV)、SDS-PAGE分别鉴定
CAP-HS与载体蛋白(BSA或OVA)偶联是否成功[14]。

1.2.2 CAP多抗血清(pAb)的制备用免疫原CAP-HS-BSA背部多点皮下注射免疫
3只BALB/c小鼠，55 μg/只。

首次免疫，CAP-HS-BSA与等体积的弗氏完全佐
剂(FCA)进行乳化、免疫；3周后加强免疫，CAP-HS-BSA与等体积的弗氏不完全佐剂(FIA)乳化、免疫，注射剂量与首免免疫剂量一致，共免疫3次，每次间隔时
间为14 d。

最后一次免疫7 d后，CAP-HS-BSA按55 μg/只的剂量腹腔注射免
疫BALB/c小鼠，3 d后尾静脉采血，应用间接ELISA和ci-ELISA进行鉴定[15]。

1.2.3 抗CAP单克隆抗体的制备无菌手术取出免疫效果最优小鼠的脾脏，应用聚乙二醇(PEG-1500)将小鼠的脾细胞与NS0骨髓瘤细胞融合。

融合后的细胞加入
96孔板中，用含有小鼠饲养细胞和HAT的培养基于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，9 d后，用直接ELISA和ci-ELISA法筛选杂交瘤细胞的上清液，选择效价高、抑制率好的阳性孔进行有限稀释亚克隆，获得能稳定分泌CAP抗体的杂交瘤细胞株。

将液体石蜡注入8周龄雌性BALB/c小鼠腹腔中，7 d后注入阳性克隆化细胞，7 d后收集小鼠腹腔中的腹水，将收集的腹水4 000 r/min离心10 min，收集上
清液，采用饱和Na2SO4盐析法纯化，-20 ℃保存，应用ci-ELISA鉴定抗CAP
单克隆抗体的敏感性[16]。

1.2.4 CAP检测ci-ELISA试验条件的优化
1.2.4.1 方阵滴定试验确定最佳包被浓度和单克隆抗体工作浓度①CAP-HS-OVA
溶液加入碳酸盐缓冲液(CBS)，使其浓度为3.2 μg/mL，在此浓度基础上进一步2
倍倍比稀释至0.1 μg/mL，将6个浓度梯度的CAP-HS-OVA溶液以50 μL/孔的
剂量加入酶标板中包被；②将腹水分别稀释4×103、8×103、1.6×104、
3.2×104、6.4×104、1.28×105、2.56×105和5.12×105倍，将8个浓度梯度
的腹水稀释液纵向加入已包被好的酶标板中，最后一列加入1∶1×105的CAP单
克隆抗体；③ci-ELISA测定D450 nm值[17-18]，选取D450 nm值接近1.0，且
附近的D450 nm值相差较大的孔，对应的即为最佳CAP-HS-OVA包被浓度CAP 单克隆抗体工作浓度。

1.2.4.2 CAP-HS-OVA包被条件的筛选按照1.2.4.1优化的包被浓度包被96孔板，设定37 ℃包被60 min，37 ℃包被120 min，4 ℃包被过夜3个包被条件；阳性对照为CAP单克隆抗体最佳工作浓度，阴性对照为1.0×105倍稀释的CAP单克
隆抗体，ci-ELISA测定D450 nm值，P/N值最大时为最佳包被条件。

1.2.4.3 酶标二抗稀释度的筛选用PBS将酶标二抗分别稀释0.3×103、1.0×103、3.0×103、9.0×103倍，参照1.2.4.2方法分别设阳性对照和阴性对照，37 ℃孵
育30 min，ci-ELISA测定D450 nm值，选取P/N最大值对应的二抗稀释浓度为最佳二抗稀释度。

1.2.4.4 封闭条件的筛选根据1.2.4.1选取的包被浓度进行包被，37 ℃分别封闭30、60和120 min，设不封闭进行对照。

以5%脱脂奶粉、5%猪血清、聚乙二醇(PEG)为封闭液，参照1.2.4.2方法分别设阳性对照和阴性对照，ci-ELISA测定
D450 nm值，得出P/N值，确立最佳封闭条件。

1.2.4.5 TMB显色时间的筛选依据前面得到的作用条件，ELISA显色时，加入TMB显色液(50 μL/孔)，室温条件下分别作用3、6、9和18 min。

2 mol/L
H2SO4终止显色后，选取P/N最大值对应的显色时间为最佳显色时间。

1.2.5 标准曲线绘制用已建立的ci-ELISA方法检测浓度分别为32.0、16.0、8.0、4.0、2.0、1.0 ng/mL CAP标准品。

以CAP浓度的对数值为横坐标、吸光率
B/B0为纵坐标(B为各个CAP标准品浓度的D450 nm值，B0为CAP为0
ng/mL的D450 nm值)绘制标准曲线。

1.2.6 添加回收试验以阴性鱼肉、牛奶样品为研究对象，牛奶不需任何前处理，
鱼肉需进行以下前处理：去除新鲜鱼肉中的骨头，称取12 g，使用匀浆机匀浆，
加入24 mL甲醇，3 200 r/min离心12 min，沉淀物再进行相同处理后，与第一
次获得的上清液合并，过滤浓缩到12 mL。

牛奶和处理后的鱼肉中分别以3、6、9、12 ng/mL 4个水平进行CAP的添加回收试验，每个水平设3个平行，重复3次。

1.2.7 HPLC检测按照文献报道的衍生化方法处理和色谱条件[19-21]对鱼肉样品
进行测定，鱼肉中分别以15、30、60 ng/mL 3个水平进行CAP的添加回收试验，重复3次。

2 结果
2.1 人工抗原及多抗血清的测定
UV鉴定结果显示，CAP-HS-BSA和BSA的最大吸收峰分别在269和278 nm，CAP-HS-OVA和OVA的最大吸收峰分别在213和278 nm；SDS-PAGE电泳图显示，CAP-HS-BSA和CAP-HS-OVA的泳动速率分别小于BSA和OVA，两者
的鉴定方法均显示CAP-HS与BSA和OVA均偶联成功。

经过4次免疫和1次强化免疫，3号小鼠的多抗血清效价最高，达到1.0×10-4以上，对CAP的半抑制
浓度(IC50)为16.40 ng/mL。

因此，选取3号小鼠进行细胞融合试验。

2.2 抗CAP单克隆抗体的制备
经细胞融合与筛选，最终得到一株既能稳定分泌CAP单克隆抗体又能无限增殖的
杂交瘤细胞株2C4，腹腔诱生腹水法生产得到抗CAP单克隆抗体，其效价为
4.8×10-5，对CAP的IC50为0.53 ng/mL。

2.3 CAP检测ci-ELISA反应条件的优化
2.3.1 最佳包被浓度和单克隆抗体工作浓度的确定选择D450 nm值接近1.0，且附近的D450 nm值相差显著的孔所对应的CAP-HS-OVA浓度为最佳CAP-HS-OVA浓度，所对应的CAP单克隆抗体浓度为最佳工作浓度。

由表1可知，CAP-HS-OVA佳包被浓度为0.4 μg/mL， CAP单克隆抗体最优的工作浓度为1∶64 000。

表1 包被浓度和CAP单克隆抗体稀释倍数的筛选(D450 nm)
Table 1 Selection of the mass concentration of coating antigen and the diluted multiple of CAP mAb (D450 nm)
CAP单克隆抗体稀释度Dilution multiple of CAP mAb包被原浓度Concentration of CAP-HS-
OVA/(μg/mL)3.21.60.80.40.20.11∶4×1033.1222.8572.5862.2091.7911.1021∶8×1032.9212.4822.4012.1381.5350.8071∶1.6×1042.6492.3232.2311.8671 .1640.6921∶3.2×1042.5312.1931.8251.5240.9450.3801∶6.4×1042.2022.78 71.4511.0190.7210.2391∶1.28×1051.8411.2861.1320.7370.5110.1911∶2.56×1051.6891.0410.7890.5410.2920.1531∶5.12×1050.9860.7620.4910.3880.2 250.133PC0.0820.0750.0780.0610.0680.071NC0.0680.0720.0690.0720.0770. 068
PC，阳性对照；NC，阴性对照。

下同
PC,Positive control;NC,Negative control.The same as below
2.3.2 CAP-HS-OVA最佳包被条件的确定由表2可知，37 ℃包被2 h和4 ℃过夜包被的P/N值基本一致，37 ℃包被2 h的P/N值最大，达到17.05，37 ℃包被1 h的P/N值最低，故选择37 ℃包被2 h作为最佳包被条件。

表2 CAP-HS-OVA包被条件的筛选(D450 nm)
Table 2 Screening of CAP-HS-OVA coating conditions (D450 nm)
项目ItemsCAP-HS-OVA包被条件 Coating conditions of CAP-HS-OVA37 ℃ 1 h37 ℃ 2 h4 ℃ 过夜 Overnight at
4 ℃NC0.0490.0580.053PC0.7750.9890.897P/N15.81617.05216.924
2.3.3 酶标二抗稀释度的筛选由表3可知，用5%猪血清将酶标二抗分别稀释0.3×103、1.0×103、3.0×103、9.0×103倍，酶标二抗稀释度在1∶1×103时
P/N值最高，因此，选择1∶1×103为酶标二抗最佳稀释度。

表3 酶标二抗稀释度的筛选
Table 3 Screening of enzyme-labeled secondary antibody dilutions
项目Items酶标二抗稀释度 Dilution of enzyme-labeled secondary antibody1∶0.3×1031∶1.0×1031∶3.0×1031∶9.0×103NC0.1020.0620.0510. 035PC1.2131.0240.7860.437P/N11.89216.51615.41212.486
2.3.4 封闭条件的确定由表4可知，3种封闭液37 ℃封闭60与80 min的P/N 值基本一致，封闭效果较佳，PEG、脱脂奶粉与猪血清相比价格较高，考虑到成本因素，因此，选择5%猪血清37 ℃封闭1 h。

表4 封闭液与封闭时间的筛选(D450 nm)
Table 4 Screening of different blocking liquid and closure time (D450 nm) 项目Items聚乙二醇PEG2.5%脱脂奶粉2.5% skim milk power5% 猪血清5% porcine serum无封闭No closure37 ℃40 min37 ℃60 min37 ℃80
min37 ℃40 min37 ℃60 min37 ℃80 min37 ℃40 min37 ℃60 min37 ℃80 min37 ℃40 min37 ℃60 min37 ℃ 80
minNC0.0630.0640.0670.0590.0600.0630.0610.0670.0690.0750.0770.078PC 0.7251.0291.0730.6840.9671.0160.7061.0791.1100.5910.6080.621P/N11.50 816.07816.01511.59316.11716.12711.57416.10416.0877.8807.8967.962 2.3.5 显色时间的确定由表5可知，在一定的作用时间内，随显色时间增加，
P/N值逐渐变大；超过18 min，P/N值偏低，9 min时，P/N值最大，测定孔的D450 nm值也较大，因此确立室温条件下显色液作用9 min。

表5 显色液作用时间的筛选(D450 nm)
Table 5 Screening of different reaction time of chromogenic liquid (D450 nm)
项目Items显色液作用时间 Reaction time of chromogenic
liquid/min36918NC0.0510.0550.0590.066PC0.7190.8370.9740.943P/N14.09 815.21816.50914.288
2.3.6 ci-ELISA方法的建立依据前面筛选的反应条件，确定ci-ELISA最佳试验条件为：0.4 μg/mL CAP-HS-OVA 37 ℃包被2 h；5%猪血清37 ℃封闭1 h；1∶6.4×104 CAP单克隆抗体37 ℃孵育15 min；1∶1 000羊抗鼠酶标二抗(GaMIgG-HRP)37 ℃孵育30 min；室温显色9 min。

2.4 标准曲线的绘制与曲线拟合
由图1可知，标准曲线为典型的S型，与4参数Logit拟合曲线相吻合，回归方程为：y=-0.3691x+0.4093，相关系数(R2)为0.995，IC50为0.53 ng/mL。

图1 ci-ELISA的标准曲线Fig.1 Standard curve of ci-ELISA
2.5 添加回收试验
依据所得标准曲线与鱼肉、牛奶前处理过程中相应的稀释倍数计算添加回收率，结果见表6。

由表6可知，阴性鱼肉、牛奶的回收率分别为93.3%～96.6%和93.7%～96.8%，批内变异系数分别为2.3%～5.0%和2.2%～4.6%，批间变异系数分别为2.7%～4.1%和2.3%～3.6%，变异系数均≤5.0%。

表6 添加回收试验结果
Table 6 Results of adjunction recovery test
样品SamplesCAP添加量Amount of CAP/(μg/L)测定值Measured
value/(μg/L)回收率Recovery/%变异系数CV/%批内Intra-assay批间Inter-assay阴性鱼肉32.80±0.1493.3±4.65.04.1Negative
fish65.65±0.2194.2±3.53.73.498.60±0.2895.6±3.13.33.31211.59±0.2696.6±2.22.32.7阴性牛奶32.81±0.1393.7±4.34.63.6Negative
milk65.66±0.2094.3±3.33.53.198.62±0.2695.8±2.93.02.81211.62±0.2596.8±2.12.22.3
2.6 ci-ELISA 与HPLC测定对比
分别将15、30、60 ng/mL CAP加入到阴性鱼肉中，利用ci-ELISA和HPLC进行测定，结果见表7。

由表7可知，ci-ELISA测定结果与HPLC的测定值无显著差异(P>0.05)。

表7 ci-ELISA与HPLC的对比
Table 7 Comparison of ci-ELISA and HPLC
方法MethodsCAP浓度 Concentration of CAP/(ng/mL)153060ci-
ELISA14.50±0.3229.12±0.3059.18±0.59HPLC14.60±0.2929.19±0.3459.35±0 .38
同列数据肩标不同字母表示差异显著(P<0.05)；肩标相同字母或无字母标注表示差异不显著(P>0.05)
In the same column，values with different letter superscripts mean significant difference (P<0.05)；While with the same or no letter superscripts mean no significant difference (P>0.05)
3 讨论
3.1 CAP单克隆抗体的制备
想要获得效价高、亲和力好、特异性强的CAP单克隆抗体，首先需得到免疫效果好的人工合成抗原CAP-HS-BSA，目前常用的鉴定CAP-HS-BSA的方法有紫外分光光度计(UV)和SDS-PAGE[15,17-18]，但由于CAP的相对分子质量(323.14)较小、BSA相对分子质量(66 430)较大，与BSA有效偶联的CAP的数量有限(一般在10～25之间)，所以CAP-HS-BSA和BSA分子质量差异不明显，实际操作中两种鉴定方法仅供参考。

最可靠的方法是将免疫原免疫试验动物后，测定试验动物
的多抗血清的效价和IC50值，但这种鉴定方法耗时耗力。

所以寻求可靠地鉴定人工合成免疫原的检测方法，是广大动物免疫工作者亟需解决的问题。

其次，在杂交瘤细胞培养时，细胞污染是最常见的问题，所以在培养细胞时，应严格进行无菌操作，同时配合一定量抗生素的应用，确保单克隆抗体制备工作的顺利进行。

3.2 ELISA试验条件的优化
3.2.1 包被常用包被抗体或抗原的浓度在0.1～5.0 μg/mL之间，包被抗原或抗体的浓度过大或过小都不利于 ELISA 的检测。

本试验用棋盘试验测定包被抗原CAP-OVA最佳包被浓度为0.4 μg/mL。

本试验结果显示37 ℃包被1 h的P/N 值最低，究其原因是包被时间过短致使包被不全，包被效果不理想；37 ℃包被2 h的P/N 值最高；4 ℃过夜、37 ℃包被2 h的P/N 值无明显差别，包被效果均好，因此选择37 ℃包被 2 h 可节省时间。

3.2.2 封闭封闭条件可根据不同的反应体系来选择，封闭时间、封闭液、稀释液
中各种离子的浓度、稳定剂等都影响封闭的质量。

选择合适的封闭时间很有必要，反应时间过长ELISA的灵敏性变小，反应时间过短则非特异性反应增大。

本试验
结果显示，未加入封闭液和封闭时间为40 min时，P/N值偏低，可能由于GaMIgG-HRP直接与测定孔底部显露的蛋白结合部位发生反应，致使二者发生非特异性反应，阴性对照孔(NC)D450 nm值过高致使P/N值较低。

BSA、脱脂奶粉、马血清、猪血清、甲醛、吐温-20、PEG等是较为常见的封闭液，本试验筛选了常见的封闭液及封闭时间，从获得难易和经济成本等综合考虑，最终选择5%猪血清37 ℃封闭1 h。

3.2.3 酶标二抗稀释度酶标二抗浓度过小导致抗原不能很好地与单克隆抗体表位
全部反应，得到的各反应孔之间的D450 nm值差别不大，浓度过大则会导致非特异性吸附反应增多，这两种情况都将对ELISA的灵敏性产生不利影响。

本试验结
果显示，1∶1×103 是酶标二抗GaMIgG-HRP的最适稀释度。

3.3 添加回收率
添加回收率是判定药物残留量检测技术准确程度的主要标准，通常情况下，添加回收率在70%～130%之间是判定药物残留量检测技术准确程度的主要标准[22-23]。

本研究的ci-ELISA检测阴性鱼肉、牛奶的回收率分别为93.3%～96.6%和
93.7%～96.8%，批内变异系数分别为2.3%～5.0%和2.2%～4.6%，批间变异系
数分别为2.7%～4.1%和2.3%～3.6%，变异系数均≤5.0%，符合残留分析方法要求。

张立辰等[24]建立了基于CAP单克隆抗体的ELISA方法检测鳕鱼中CAP残留，其回收率平均为87.3%，变异系数平均为5.12%；陈霞等[25]用建立的ELISA方
法检测鱼肉、牛奶中CAP的含量，其平均回收率分别为88.25%和88.05%，平均变异系数分别为6.95%和8.30%，批间变异系数分别为7.75%和8.75%；余权等[26]用ELISA检测草鱼中CAP的含量，其回收率为96.7%，变异系数为5.2%，
本研究批内、批间变异系数均小于以上文献报道的结果，进一步表明建立的ci-ELISA具有较高的准确度和精密度。

如果其数值>100%，表示可能测定样品的基
质干预程度过多，或是抗体特异性小，导致结果显示为假阳性；如果其数值过低，表示测定样品预处理的流程中残留靶标损失量过多，导致结果显示为假阴性。

正常情况下，样品的预处理措施不当，抗体的特异性不强、稳定性低等因素都能引起添加回收率发生变化，与实际含量不符，试验结果显示为假阳性或假阴性。

1 mL水仅能溶解0.25 mg CAP，CAP对有机溶剂有良好的溶解性，所以样本预处理时，需经有机溶剂进行提取。

4 结论
本研究应用杂交瘤技术成功制备CAP单克隆抗体，通过优化反应条件建立ci-ELISA。

该方法具有较高的灵敏度(IC50为0.53 ng/mL)、准确度和精密度。

建立
了ci-ELISA检测方法的标准曲线，能很好地满足动物源性食品中高灵敏度检测CAP残留的要求。

参考文献(References)：
【相关文献】
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