四季蜜龙眼花芽形成相关基因 SAM的克隆

四季蜜龙眼花芽形成相关基因SAM的克隆
摘要以四季蜜龙眼花芽为材料,进行了总RNA的提取与纯化,应用RT-PCR技术扩增其3′端序列,经测序和拼接,获得SAM3′末端,共1 253 bp;序列分析表明,与杨树SAM基因同源性达到96%,为龙眼成花机理的深入研究奠定了基础。

关键词四季蜜龙眼;成花相关基因;SAM基因
CloningofSAMGeneRelatetoFloralBudFormationinDimocarpuslonganLour. cvSijimi
WANG Xiao-hangCHEN Qing-xi *ZHENG Meng-jiao
(College of Horticulture,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou Fujian 350002)
AbstractThe extraction and purification of the RNA of flower bud of Dimocarpus longan Lour. cv Sijimi were conducted. Utilizing RT-PCR t echnique to expand 3’ end sequence of SAM,testing its sequence and putting them together,the 3’end of SAM at the amount of 1 253 bp was attained. The nucleotide sequence comparison with the SAM gene of Populus trichocarpa showed that identity was higher than 96%,which would provide the basis to further study on the mechanism of blossom formation.
Key wordsDimocarpus longan Lour. cv Sijimi;the relevant gene to floral bud formation;SAM gene
高等植物的开花是植物个体发育过程的中心环节。

开花决定即在植物茎端分生组织中发生的生理生化变化和基因表达,这一过程从根本上控制着植物开花时间[1],利用遗传学的方法,目前已从拟南芥中鉴定出80个位点与开花相关[2-4],证明开花由多途径控制。

其中,SAM参与DNA甲基化和磷酸甾醇及叶绿素生物合成等途径,是植物体内一种重要的甲基供体[5],SAM可以被植物体内多种途径所利用,除了转化成ACC外,SAM可在SAM脱羧酶作用下转化成多胺[6]。

还可在SAM水解酶催化下水解成5-甲硫腺苷及高丝氨酸,前者通过Met循环转化成Met,而后者直接转化成Met从而降低植物体内SAM含量[5]。

龙眼作为福建省主栽果树之一,生产上存在成花不同步、花芽形成和开花易受外界条件的影响等问题,严重影响生产的稳定性。

龙眼成花调控机理的研究已成为当前研究的热点。

本研究以四季蜜龙眼花芽为材料,通过RT-PCR技术扩增序列,进行SAM基因的克隆,研究其在龙眼成花过程的功能与调控,为成花机理的研
究提供重要的理论和试验基础。

1材料与方法
1.1试验材料
试验所用材料为四季蜜龙眼花芽,采于漳州市云霄县源发农场龙眼园,采后立即放入液氮罐中带回,保存在-80 ℃冰箱中备用。

1.2仪器与试剂
Beckman公司台式高速冷冻离心机Avanti 30,北京市六一仪器厂水平电泳槽DYCP-31D,DYY-6C;北京市六一仪器厂电泳仪DYCP-31BM,台式恒温振荡器,海尔公司双人单面超净工作台。

Biometra公司梯度PCR仪T gradient。

琼脂糖购于MDBio公司;Tris-HCl、Tris base、LiCl、KCl、DEPC、NaCl、EDTA-2H2O、IPTG、X-gal、SDS、PVPP、PVP-40、氨苄青霉素、醋酸钾、醋酸钠、β-巯基乙醇均为Amresco分装试剂;胰蛋白胨、酵母提取物购于OXOID公司;其他常规试剂均为国产分析纯和超纯试剂。

1.3试验方法
1.3.1花芽总RNA的提取与测定。

总RNA的提取参照前人的SDS方法[7],并略有改动。

电泳检测结果显示所提取的RNA有DNA及糖污染,需对RNA进行纯化。

由于核酸的最大吸收波长为260 nm,OD260相当于RNA浓度40 μg/mL。

在此通过测OD260值来推算RNA浓度。

其计算公式如下:
RNA浓度(μg/μL)=(OD260×稀释倍数)/(40/1 000)
通过测定RNA样品的OD230、OD260和OD280,来计算OD260/OD280的比值,越接近2,则表明RNA纯度越高。

取5 μL的RNA样品用DEPC-H2O稀释至1 mL,测定OD230值、OD260值和OD280值。

1.3.2 3′-RACE-Ready cDNA的合成。

按照试剂盒的说明书进行逆转录。

①所有试剂使用前必须混合均匀并微离心;②在0.2 mL的离心管里加入总RNA 3.0 μL、AP(10 μmoL/L) 1.0 μL、10 mmoL/L dNTP 1 μL、DEPC-H2O至10.0 μL;③65 ℃恒温水浴温浴5 min,然后冰上静止1 min;④准备cDNA合成试剂,分别混合以下试剂于冰上:10×R T buffer 2 μL、SuperScriptTM III RT(200 U/μL)1 μL、RNase OUTTM(40 U/μL)1 μL、0.1 moL/L DTT 2 μL、25 mmoL/L MgCl2 4.0 μL,加入至上述RNA引物混合物中,轻轻混匀,微离心,后50 ℃温浴50 min;⑤85 ℃ 5 min后放在冰上;加入RNase H 1μL,37 ℃温浴20 min;⑥将cDNA放置-20 ℃保存备用。

1.3.33′末端的PCR扩增。

①第1轮PCR扩增。

PCR管里顺次加入10×Ex Taq Buffer
2.5 μL、10 mmoL/L dNTP 0.5 μL、SAM-1(10 μmoL/L)0.5 μL、AUAP(10 μmoL/L) 0.5 μL、cDNA 1.0 μL、无菌水19.8 μL、Ex Taq(5 U/μL)0.2 μL。

反应体
系为25 μL。

PCR扩增条件:95 ℃预变性10 min;94 ℃变性45 s,52 ℃复性45 s,72 ℃延伸80 s,30个循环;4 ℃保存备用。

②第2轮PCR扩增。

用高压过的超纯水将第1轮PCR反应产物稀释500倍作为第2轮反应的模板。

PCR管里顺次次加入10×Ex Taq Buffer 2.5 μL、10 mmoL/L dNTP 0.5 μL、SAM-1 (10 μmoL/L)0.5 μL、AUAP(10 μmoL/L)0.5 μL、cDNA 1.0 μL、无菌水19.8 μL、Ex Taq(5 U/μL)0.2 μL。

体系为25 μL。

扩增条件:94 ℃预变性10 min;94 ℃变性45 s,52 ℃复性45 s,72 ℃延伸80 s,30个扩增循环;4 ℃保存备用。

1.3.4 PCR产物的回收纯化。

采用北京博大泰克基因技术有限责任公司DNA 片段胶回收试剂盒进行胶回收,为了提高回收量,可重复1次。

1.3.5感受态细胞的制备。

①从-80 ℃低温冰箱中取出大肠杆菌DH5α菌种,在无菌条件下,用移液器吸取菌种加到10 mL LB液体培养基中,37 ℃、225 r/min 摇床培养15 h。

②次日,将摇好的菌液在无菌条件下,吸取1 mL加到40 mL新鲜LB液体培养基中,37 ℃快摇(280~300 r/min)培养2~3 h。

③当OD600值达到0.5时,在无菌条件下,将菌液分装至2个50 mL无菌离心管中,冰浴10 min。

④4 ℃、
3 100 r/min离心10 min,弃上清,将管倒置,使最后的痕量培养基流尽。

无菌操作。

⑤每管加入10 mL预冷的0.1 moL/L无菌氯化钙溶液(1 moL/L氯化钙溶液的配制:称取1.470 g氯化钙固体药品,加双蒸水100 mL高温灭菌)重悬细胞,冰浴30 min。

⑥4 ℃、3 100 r/min离心10 min,超净台上,弃上清,将管倒置,使最后的痕量培养基流尽。

每管加入1.5 mL预冷的无菌氯化钙溶液(0.1 moL/L)重悬细胞。

冰浴20 min,放在4 ℃冰箱20 h。

⑦每管加入适量(30%)无菌预冷甘油,吸打混匀,然后分装到1 mL离心管中,以每管100 μL的量分装。

-80 ℃保存。

1.3.6转化及鉴定。

①取100 μL LDH5α感受态加入到10 μL连接产物当中,冰上放置30 min,42 ℃水浴热激90 s,然后冰上放置5 min。

②加入400 μL不含抗生素的LB液体培养基,37 ℃、200 r/min振荡培养1.5 h。

③加入7 μL 20% IPTG 和40 μL 20 mg/mL X-gal(二甲基甲酰胺溶解),涂板在含100 μg/mL Amp的LB固体培养基上,37 ℃过夜培养。

④次日,取平板,在 1.5 mL离心管中加入含有100 μg/mL Amp 的0.5 mL LB培养基,挑选白斑菌落,转入其中(1个单一菌落一管)。

⑤220 r/min、37 ℃振荡培养2~4 h。

取4 μL菌液,依次加入10×Ex Taq Buffer 2.5 μL、2.5 mmoL/L dNTP 2 μL、EMF2-F(10 μmoL/L)1μL、EMF2-R(10 μmoL/L)1 μL、菌液4 μL、无菌水14.35 μL、Ex Taq(5 U/μL)0.15 μL。

PCR扩增条件:94 ℃预变性5 min,94 ℃变性45 s,50 ℃复性45 s,72 ℃延伸1 min,30个循环扩增;4 ℃保存。

反应结束,经电泳检测后EB 染色,采用凝胶成像仪拍照。

选择扩增出条带与目的片段一致样品的菌液(3个)至上海生工生物工程技术服务有限公司/英骏生物技术有限公司进行测序。

利用DNAMAN等软件进行序列分析。

2结果与分析
2.1花芽总RNA的纯度检测
提取RNA经紫外分光光度计测定其OD260/OD280=1.89,OD260/OD230=2.18,说明其完整性较好,纯度较高。

电泳结果也显示RNA较完整,且28 s的亮度大约是18 s的2倍(图1),说明可满足后续试验需要。

2.2龙眼SAM基因cDNA 3′端的获得
经过2轮扩增,第1轮扩增出现非特扩增条带较多,第2轮扩增出1条约1 000 bp的特异条带(图2),经测序获得长1 014 bp的片段,与已获得的保守区序列有1个长达351 bp的重叠区。

将该序列上传到NCBI数据库,登陆号为HM067359。

经回收与纯化后的目的片段,与载体连接、转化到大肠杆菌中,再经蓝白斑筛选、重组质粒鉴定,将重组质粒阳性菌送去测序。

测序结果序列与保守区序列拼接,结果如下:
经BLAST分析,该序列与杨树、蓖麻、番木瓜SAM基因同源性很高,分别为96%、92%、86%,可预测此片段为SAM 3′末端序列。

将所得核苷酸序列用DNAMAN软件翻译成氨基酸序列,推测其编码362个氨基酸。

翻译成的氨基酸序列如下:
将拼接后翻译成氨基酸序列在NCBI数据库中进行比对,结果显示该序列包含SAM家族的3′端,从而证明研究所得序列就是SAM 3′末端。

3 结论与讨论
本研究克隆了龙眼SAM基因大部分序列,共1 253 bp,与杨树SAM基因同源性达到96%。

该基因在四季蜜龙眼花芽中上调表达,它催化Met和ATP形成S-腺苷蛋氨酸,S-腺苷蛋氨酸可以被植物体内多种途径所利用,除了转化为乙烯外,还可在SAM脱羧酶作用下转化为多胺,多胺类物质参与了细胞分裂、抗逆反应等多种植物生长发育过程。

不同植物的SAMs基因的表达研究显示,在矮牵牛和康乃馨等植物中都表现出组织和发育阶段的特异性。

该基因的上调表达,使S-腺苷蛋氨酸含量增加,S-腺苷蛋氨酸在SAM脱羧酶作用下转化为多胺,多胺平衡的改变影响成花,这与陈清西提出龙眼成花假设模型的推论一致[8]。

与其他物种比较,5′端还有大约200 bp序列未能获得,这可能是由于5′端RNA二级结构复杂,相似的逆转录酶无法完全转录成cDNA。

为了进一步确定龙眼SAM基因在龙眼成花过程中的具体作用,还需要通过基因克隆技术获得5′端序列,做进一步的结构和功能分析。

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